骨髓干細(xì)胞移植治療急性心肌梗死的研究進(jìn)展

盧文燕，張 明

(1.南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部2018級；2.江西省人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科,南昌 330006)

急性心肌梗死(AMI)是在冠狀動脈粥樣硬化病變的基礎(chǔ)上，因冠脈管腔內(nèi)血栓形成，造成急性冠脈閉塞，相應(yīng)心肌細(xì)胞供血中斷，導(dǎo)致心肌細(xì)胞嚴(yán)重而持久的急性缺血性壞死。為了盡快使閉塞的血管再通，再灌注治療已成為目前治療AMI的重要緊急措施。再灌注治療方法包括溶栓治療和急診經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)，但由于急診PCI在基層醫(yī)院可能并未開展或者技術(shù)不成熟，導(dǎo)致患者轉(zhuǎn)入上級醫(yī)院時已經(jīng)造成部分心肌細(xì)胞缺血壞死，而溶栓治療又有其適應(yīng)證、禁忌證，部分患者不宜進(jìn)行溶栓治療，同樣造成心肌梗死。其中更有部分急性期患者因未能及時疏通或重建血運而迅速造成大面積心肌梗死，心臟為維持其泵血功能，發(fā)生退行性左室重塑，甚至形成室壁瘤，最終導(dǎo)致心功能不斷惡化而心力衰竭。以往認(rèn)為成熟的心肌細(xì)胞缺乏再生能力，心肌梗死發(fā)生后，梗死區(qū)心肌只能通過纖維增生，由無收縮功能的疤痕組織代替。因而即使恢復(fù)或重建血運通路，也不能從根本上修復(fù)壞死心肌組織。心肌梗死后在梗死灶周邊及正常的心肌組織中也有少量心肌細(xì)胞發(fā)生有絲分裂，以增殖修復(fù)受損的心肌組織。而TAKAHASHI等[1]的研究表明骨髓單個核細(xì)胞(MNCs)培養(yǎng)液能產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子通過直接保護(hù)心肌細(xì)胞，增強(qiáng)心肌的收縮能力，抑制心肌細(xì)胞的凋亡，誘導(dǎo)梗死灶周圍微血管生成，從而促進(jìn)梗死心臟功能的改善。

干細(xì)胞是一種未充分分化，尚不成熟的細(xì)胞，具有分化成各種細(xì)胞、組織、器官的潛在功能。根據(jù)來源不同，分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞面臨細(xì)胞標(biāo)本短缺、免疫排斥、倫理道德等方面的問題，使之應(yīng)用受限。骨髓干細(xì)胞(BMCs)屬于成體干細(xì)胞，目前認(rèn)為其主要包含以下兩類干細(xì)胞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)和造血干細(xì)胞。由于骨髓干細(xì)胞通過溫和的機(jī)械分離即能制備單細(xì)胞懸液，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，來源廣泛，且可自體移植，受到廣大學(xué)者的青睞。骨髓干細(xì)胞能分化為心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及多種細(xì)胞因子等。因此，通過干細(xì)胞移植阻止心臟衰竭的惡化進(jìn)程甚至去恢復(fù)心肌損傷患者的心功能，給心肌梗死的治療開辟了一個嶄新的前景。本文就干細(xì)胞移植治療急性心肌梗死的作用機(jī)制、研究狀況、存在的問題及前景進(jìn)行綜述。

1 作用機(jī)制

1.1 干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞

早在1999年TOMITA等[2]研究表明，體外培養(yǎng)中，5-aza培養(yǎng)的BMCs可形成肌鈣蛋白Ⅰ和肌球蛋白重鏈染色陽性的肌小管；體內(nèi)研究中，將BMCs移植到冷損傷性心臟痕組織中，8周后檢測也可見心肌樣肌細(xì)胞，肌球蛋白重鏈和肌鈣蛋白Ⅰ染色陽性，心臟功能較前顯著改善。SZARAZ等[3]利用qPCR技術(shù)分析體外培養(yǎng)基cTnT和MYH6基因表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組cTnT mRNA水平高于對照組，MYH6 mRNA的表達(dá)在干細(xì)胞分化過程中也被強(qiáng)烈誘導(dǎo)。并采用流式細(xì)胞術(shù)分析心源性分化標(biāo)記物，結(jié)果顯示心肌細(xì)胞標(biāo)記信號調(diào)節(jié)蛋白α和縫隙連接蛋白43(Cx43)的表達(dá)水平高于對照組，表明間充質(zhì)干細(xì)胞能分化為功能性心肌細(xì)胞樣細(xì)胞。

1.2 干細(xì)胞旁分泌機(jī)制產(chǎn)生多種細(xì)胞因子

TAKAHASHI等[1]在研究中發(fā)現(xiàn)BMCs無論是在缺氧還是常氧條件下均能明顯抑制成齡大鼠心肌細(xì)胞的凋亡，同時增加梗死后心肌微血管的密度，縮小纖維瘢痕的面積，明顯提高心臟的功能。他們收集BMCs的培養(yǎng)液做ELISA和Western bloting分析，發(fā)現(xiàn)BMCs產(chǎn)生了多種細(xì)胞因子(包括VEGF、IL-6、PDGF、IGF-1)，其中一些在缺氧的條件下是明顯增加的。研究表明BMCs產(chǎn)生的細(xì)胞因子增強(qiáng)了心肌細(xì)胞對抗缺血損傷的能力，誘導(dǎo)了血管的新生，抑制了梗死心臟的重構(gòu)，這對干細(xì)胞移植治療心肌梗死意義重大。TANG等[4]對心肌梗死小鼠進(jìn)行自體MSCs移植，2個月后發(fā)現(xiàn)小鼠梗死區(qū)毛細(xì)血管密度增高，VEGF表達(dá)明顯升高，心肌細(xì)胞凋亡減少，心功能明顯改善。其可能機(jī)制為MSCs在損傷區(qū)域可以自身分泌和上調(diào)周邊細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞活性因子；MSCs自我更新能力能維持長期的血管再生狀態(tài)。

1.3 干細(xì)胞減少炎癥因子

LUGER等[5]將小鼠左前降支阻斷45 min，在心肌梗死后24 h，實驗組靜脈注射2×106MSCs，對照組注射生理鹽水，每組各16只，21 d后，發(fā)現(xiàn)MSCs組明顯降低心臟和脾臟的自然殺傷細(xì)胞和心臟的中性粒細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死前24 h特異性自然殺傷細(xì)胞耗竭可改善梗死面積、左心室射血分?jǐn)?shù)、左室重構(gòu)及減少心臟中性粒細(xì)胞。這表明MSCs通過全身抗炎作用改善急性心肌梗死的左心功能障礙。

1.4 干細(xì)胞外泌體發(fā)揮重要作用

干細(xì)胞分泌的胞外小泡有刺激血管生成，保護(hù)細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用。DOUGHERTY等[6]從人類誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞源性心肌細(xì)胞(hiPSC-CM)培養(yǎng)基中分離出分泌顆粒，并用射透電鏡、納米粒子追蹤分析、免疫印跡證實了分泌顆粒的大小和形態(tài)與外泌體一致。此外，在研究外泌體對牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)的管壁形成、傷口愈合和細(xì)胞增殖的影響時發(fā)現(xiàn)，與對照組(NO-Exosomes)相比，100 μg·mL-1CM-ES處理的BAEC在管壁形成、傷口愈合和細(xì)胞增殖方面均有顯著提高。結(jié)果表明，從hiPSC-CM中分離出的Exosomes能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生成和細(xì)胞增殖。該研究闡明了干細(xì)胞移植治療心肌梗死新的作用機(jī)制，為疾病的治療提供了新的理論基礎(chǔ)。

2 基礎(chǔ)與臨床研究現(xiàn)狀

2.1 基礎(chǔ)研究

LUO等[7]為了解決干細(xì)胞生長、保存和運輸?shù)膯栴}，將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子包裝成聚乳酸-乙醇酸微粒子，然后包被MSC膜，形成非物理粒子合成MSC(或synMSC)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，synMSC顯示出與真MSC相似的因子釋放譜和表面抗原，并能發(fā)揮MSC的促進(jìn)心肌細(xì)胞和血管再生的功能及顯示低溫環(huán)境下體外或體內(nèi)保存和凍干穩(wěn)定性。LUGER等[5]對鼠的研究發(fā)現(xiàn)注射生理鹽水對照組左室重構(gòu)不良，左室射血分?jǐn)?shù)惡化，而靜脈給予間充質(zhì)干細(xì)胞實驗組消除了左室舒張末期容積和左室收縮末期容積的惡化，另外在缺血性心肌病模型中，心肌梗死后4周給予小鼠(n=16)尾靜脈注射2×106MSCs，第3周重復(fù)注射，與對照組(n=16)相比，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組左室射血分?jǐn)?shù)明顯增加，左室收縮末期容積減少。MENG等[8]將白介素10(IL-10)基因通過轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)核酸酶(TALEN)整合到羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(AMM)基因組中，并翻譯成IL-10基因編輯的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(AMM/I)，將AMM/I移植到AMI小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)AMM/I移植可明顯抑制CD68陽性或F4/80陽性的浸潤性炎癥細(xì)胞，降低梗死心肌中促炎因子的表達(dá)。此外，還發(fā)現(xiàn)，采用AMM/I移植的小鼠心肌細(xì)胞周圍毛細(xì)血管密度明顯增加，梗死面積明顯縮小，左室功能得到改善，并且AMM/I對心肌細(xì)胞凋亡具有高度抑制作用。此項研究表明，AMM/I移植通過抑制細(xì)胞炎癥、增加毛細(xì)血管密度、抑制細(xì)胞凋亡等方面的作用，對左心室功能的早期恢復(fù)和重構(gòu)發(fā)揮了良好的作用。然而移植的細(xì)胞在缺血缺氧環(huán)境下存活不良會降低其治療效果。Follistatin-like 1(Fstl1)是一種新型促生存的心肌因子，在缺血環(huán)境中對細(xì)胞具有保護(hù)作用。SHEN等[9]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在缺氧條件下模擬心肌缺血環(huán)境，分別于缺氧后0、24、48 h檢測Fstl1的表達(dá)，在低氧處理48 h后，進(jìn)一步收集間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞死亡和增殖試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fstl1在缺氧間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)呈明顯的時間依賴性下降，體外研究進(jìn)一步證實Fstl1促進(jìn)缺氧間充質(zhì)干細(xì)胞的存活和增殖。因此可以推測，F(xiàn)stl1可以顯著延長MSC植入人體后的存活時間。同時他們將MSCs(MSCs-mcherry)或Fstl1過表達(dá)MSCs(MSCs-fstl1)注入小鼠梗死周圍區(qū)，在治療后1、3、7 d對供體細(xì)胞的保留情況進(jìn)行評估，并計算梗死面積、梗死心臟的新生血管及心肌功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSCs-fstl1組顯著延長供體細(xì)胞的存活時間，并且通過限制瘢痕形成、減少炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)新生血管，明顯改善心肌梗死后的心功能。這表明fstl1是一種促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存活和增殖的內(nèi)源性心臟因子，可以優(yōu)化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的治療效果。

2.2 臨床研究

KIM等[10]進(jìn)行的一項隨機(jī)對照臨床試驗，將26例急性ST段抬高型心肌梗死PCI術(shù)后患者分為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC)組(n=14)和對照組(n=12)，對照組在梗死后給予常規(guī)治療，BM-MSC組在PCI術(shù)后1個月冠狀動脈內(nèi)注射自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并給予常規(guī)治療。觀察左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)從基線到隨訪4個月后的變化。通過SPECT測定，BM-MSC組LVEF較對照組明顯增加。通過超聲心動圖測定，隨訪4個月時LVEF增加幅度細(xì)胞組顯著高于對照組[(9.0±4.7)%比(5.3±2.6)%，P=0.023]。在整個研究過程中，細(xì)胞移植并未增加不良臨床事件、支架內(nèi)再狹窄或心律失常風(fēng)險。LI等[11]進(jìn)行了一項80例患者參與的隨機(jī)對照試驗，在成功完成再灌注治療后1個月，經(jīng)冠狀動脈注入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞至梗死相關(guān)動脈，隨訪6個月后發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組LVEF的改善幅度明顯大于對照組[(5.9±8.5)%比(1.6±7.0)%，P=0.037]，在治療過程中，未發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞治療相關(guān)毒性，隨訪期間無明顯不良心血管事件發(fā)生?？梢?，冠狀動脈內(nèi)灌注骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是安全有效的。張艷平等[12]將8項隨機(jī)對照臨床試驗共410例納入薈萃分析，結(jié)果顯示在有效性方面，移植后3、6、12個月，移植組左室射血分?jǐn)?shù)均較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；在安全性方面，移植組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。肖文濤等[13]進(jìn)行的一項自體MNCs、MSCs經(jīng)梗死相關(guān)冠狀動脈(IRCA)內(nèi)序貫移植治療AMI的臨床研究，分別于移植后3、6個月測定LVEF和心肌灌注缺損面積百分?jǐn)?shù)，結(jié)果顯示移植組LVEF和心肌灌注缺損面積百分?jǐn)?shù)均較對照組明顯改善，且2組惡性心血管事件發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

然而LAGUNA等[14]選用LVEF低于50%，有冠脈搭橋(CABG)適應(yīng)證的20例透壁性心肌梗死患者進(jìn)行隨機(jī)對照試驗，在急性心肌梗死后第10—15天，干細(xì)胞組在體外循環(huán)下采用心肌內(nèi)直接注射骨髓單個核細(xì)胞(MNCs)，對照組僅行CABG治療。術(shù)前、術(shù)后9個月行釓磁共振成像及應(yīng)激性超聲心動圖檢查。最后17例患者完成隨訪，分析研究結(jié)果，在2組基線特征基本一致的前提下，2組LVEF變化幅度、整體室壁運動減低水平或局部室壁運動減低水平、舒張末期容積下降幅度或收縮末期容積下降幅度比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。此項研究結(jié)果表明，AMI患者在冠脈搭橋時心肌內(nèi)注射MNCs對心室重構(gòu)及心臟功能無中—遠(yuǎn)期改善作用。另外NICOLAU等[15]的隨機(jī)對照臨床試驗也得出相似結(jié)論，即冠狀動脈內(nèi)灌注MNCs并沒有改善左心室重構(gòu)或減少梗死面積。但從具體數(shù)值上分析，在LAGUNA等[14]的研究細(xì)胞組的指標(biāo)除局部室壁運動減低水平外，其余指標(biāo)均優(yōu)于對照組，且該研究樣本量少，用于結(jié)果分析的僅17例，這可能影響試驗結(jié)果的說服力。所以需要開展更多大樣本、多中心、雙盲、隨機(jī)對照試驗來進(jìn)一步證實。綜合分析以上研究，不難發(fā)現(xiàn)各方研究者利用的移植時間、移植途徑、細(xì)胞種類、細(xì)胞數(shù)量、患者初始左室射血分?jǐn)?shù)不一，造成研究結(jié)果不盡相同。在今后通過控制這些可控因素，將干細(xì)胞聯(lián)合某種或多種細(xì)胞因子整合到生物材料中，以期尋找一種最優(yōu)化組合，為臨床應(yīng)用干細(xì)胞治療心肌梗死提供強(qiáng)有力的治療方案。

3 存在的問題

3.1 干細(xì)胞歸巢率、分化率差

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是心肌細(xì)胞修復(fù)和再生的種子細(xì)胞，但其歸巢率和分化率差，不能最大程度分化成心肌細(xì)胞，在臨床應(yīng)用中受到了一定的限制。YANG等[16]研究發(fā)現(xiàn)超聲靶向微泡破壞介導(dǎo)的趨化因子 12(CXCL 12)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)共轉(zhuǎn)染能顯著促進(jìn)干細(xì)胞移植后梗死心肌的修復(fù)和再生；LU等[17]的研究也表明間充質(zhì)干細(xì)胞通過CXCL 12趨化途徑向梗死灶周邊招募常駐心臟內(nèi)皮細(xì)胞，從而改善AMI小鼠模型的心臟功能，其中CXCL 12是歸巢因子，BMP 2是促分化因子，但是兩種因子以何種比例聯(lián)用才能達(dá)到更好的治療效果，還需要更多高質(zhì)量的基礎(chǔ)研究及臨床研究來證實。

3.2 移植細(xì)胞存活率低

梗死區(qū)缺血缺氧和炎癥狀態(tài)會促使移植細(xì)胞死亡，從而降低干細(xì)胞對缺血性心臟病的治療效果。Bcl-2是細(xì)胞凋亡中最受關(guān)注的癌基因之一，它具有抑制凋亡的作用。LI等[11]使用Bcl-2基因?qū)SCs進(jìn)行基因改造，組裝成Bcl-2過表達(dá)MSCs，將Bcl-2-MSCs或單純MSCs移植到心肌梗死大鼠中，與MSCs組相比，Bcl-2-MSCs組在移植后4 d、3周和6周時細(xì)胞存活率分別增加了2.2倍、1.9倍和1.2倍。KITABAYASHI等[18]對梗死大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2修飾的骨骼肌成肌細(xì)胞組移植細(xì)胞存活時間延長，心肌纖維化減少，梗死區(qū)和邊緣區(qū)血管密度增加，心功能明顯改善。2項研究都支持Bcl-2能夠提高移植細(xì)胞抵御心肌梗死區(qū)惡劣環(huán)境的能力，但僅限于動物研究，在人體中是否有效還有待考證。

3.3 干細(xì)胞的增殖分化需要強(qiáng)化

單純的細(xì)胞移植后其轉(zhuǎn)分化率及表達(dá)結(jié)構(gòu)功能的程度并未達(dá)到人們的預(yù)期理想，因此人們開始傾力于對細(xì)胞的增殖分化有促進(jìn)作用的生長因子的研究。CHANG等[19]在左前降支閉塞的Sprague-Dawley大鼠心肌梗死模型中發(fā)現(xiàn)，移植后12周，脂肪源性成人干細(xì)胞聯(lián)合生長因子復(fù)合物(ADAS-GFS)移植組與ADAS移植組或?qū)φ战M比較，ADAS-GFS移植組梗死區(qū)周圍毛細(xì)血管增多，左心室功能明顯改善，與ADAS移植組或?qū)φ战M比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這些數(shù)據(jù)表明生長因子能夠提高干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能。然而生長因子由于其易彌散而不能持久作用，以及如何與微環(huán)境中的移植細(xì)胞達(dá)到最有效的生物性結(jié)合又成為研究中懸而未解的問題。

3.4 干細(xì)胞治療的安全性問題

不少研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞治療存在安全隱患。GLEESON等[20]在全枸櫞酸血中添加間充質(zhì)干細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)可增強(qiáng)動脈剪切時血小板在膠原蛋白上的血栓沉積，肝素聯(lián)合用藥可消除這一效應(yīng)；在豬急性心肌梗死模型中，在再灌注期間注入25×106間充質(zhì)干細(xì)胞后，冠狀動脈血流減少，聯(lián)用肝素可消除該效應(yīng)，說明MSCs有形成血栓的前活性，這對于心肌梗死患者來說是非常不利的。SIMINIAK等[21]將10例患者的自體骨骼肌成肌細(xì)胞在體外培養(yǎng)3周后進(jìn)行移植，術(shù)后早期2例出現(xiàn)持續(xù)性室性心動過速，其余2例隨訪2周后發(fā)生持續(xù)性室性心動過速。還有學(xué)者認(rèn)為干細(xì)胞移植會導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。GAO等[22]在臨床研究中發(fā)現(xiàn)1例患者在注射細(xì)胞的過程中發(fā)生嚴(yán)重的冠狀動脈阻塞并發(fā)癥；LALU等[23]進(jìn)行的薈萃分析共收集了668項研究，其中23項符合資格標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞與急性不良事件之間無相關(guān)性，表明MSCs治療缺血性心臟病似乎是安全的。為進(jìn)一步明確骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的收益—風(fēng)險狀況，有必要進(jìn)行精心設(shè)計、更大規(guī)模的隨機(jī)對照試驗。

此外，還有骨髓干細(xì)胞自噬問題、分化的細(xì)胞能否長期維持心肌細(xì)胞功能等問題。

4 小結(jié)與展望

盡管目前治療急性心肌梗死的手段多樣，但AMI的預(yù)后欠佳，病死率仍然居高不下，是心血管領(lǐng)域亟需攻克的一大難題，需要找到新的治療方法來改變心肌梗死的預(yù)后。因此，國內(nèi)外學(xué)者試圖用干細(xì)胞移植來治療心肌梗死，目前已有大量臨床研究證實干細(xì)胞移植對于AMI的治療有一定的療效，但由于移植后分化率低、形成新的血栓、誘發(fā)心律失常、形成腫瘤，甚至有研究發(fā)現(xiàn)移植后并無改善心功能的作用等方面的問題，該治療方法尚未應(yīng)用于臨床。但是，筆者仍相信干細(xì)胞在心肌梗死治療領(lǐng)域的積極作用，并且預(yù)計該領(lǐng)域的迅速進(jìn)展和生物技術(shù)的進(jìn)步將解決這些問題，期待干細(xì)胞移植為心肌梗死的治療開辟一條新“通路”。