環(huán)狀RNA在肺纖維化中的研究進展

胡婷婷，曾林祥

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,南昌 330006)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種病因不明，累及肺實質(zhì)的纖維化及炎性病變的組合，是臨床上最常見和最致命的特發(fā)性間質(zhì)性肺炎。其發(fā)病機制復(fù)雜，確診后中位生存期僅為3～5年[1]。IPF病因不明，好發(fā)于老年人，其發(fā)病率呈上升趨勢，在歐洲和北美，估計每年每10萬人中有8～18例；亞洲和南美的發(fā)病率較低，每年(0.5～4.2)人/10萬人[2]；我國尚缺乏肺纖維化的流行病學(xué)調(diào)查。IPF起源于反復(fù)的肺泡上皮細胞炎性損傷，激活產(chǎn)生多種細胞因子，從而誘導(dǎo)固有成纖維細胞增生，促進成纖維細胞和肌成纖維細胞的增殖及肌成纖維細胞分泌細胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肺瘢痕形成和不可逆轉(zhuǎn)的功能喪失[3]。目前除肺移植外，IPF尚無確切有效的治療方法。

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是不含5′端帽子與3′端多聚A尾，由前體RNA首尾閉合形成的環(huán)狀閉合結(jié)構(gòu)的非編碼RNA。circRNA閉合成環(huán)，對核酸外切酶有抗性，故較線性RNA更加穩(wěn)定，能在細胞中不斷累積。有些circRNA表達水平較高，部分circRNA的表達水平甚至超過線性異構(gòu)體的10倍[4]。因此，大量積累的circRNA在各種疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。circRNA廣泛存在于各種生命體內(nèi)，具有細胞信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)翻譯、基因調(diào)控等生物功能，其異常表達可影響縮窄性心包炎[5]、腫瘤[6]、生殖系統(tǒng)[7]等疾病的發(fā)生、發(fā)展。近年來由于基因測序及生物信息工程的發(fā)展，越來越多的circRNA被發(fā)現(xiàn)鑒定，且在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的circRNA更廣泛和多樣化[8]。本文就circRNA的生物學(xué)特性、功能以及其在PF中的研究進展進行綜述。

1 circRNA的分類及生物學(xué)特性

1.1 circRNA的分類

根據(jù)circRNA的來源不同可將其分為內(nèi)源性circRNA和外源性circRNA。內(nèi)源性circRNA按組成成分的不同有3種:1)外顯子circRNA，指僅由外顯子組成的circRNA，主要存在于細胞質(zhì)中，占circRNA的86.6%[9-10]；2)內(nèi)含子circRNA，指僅由內(nèi)含子組成的circRNA，主要存在于細胞核中[11]；3)外顯子-內(nèi)含子,其由內(nèi)含子和外顯子聯(lián)合組成，主要存在于細胞核內(nèi)[10,12]。外源性circRNA指存在體液，如血液、唾液、尿液等中的circRNA[10,13]。作為疾病的新興生物標(biāo)志物，circRNA對臨床許多疾病包括肺纖維化的診斷及治療有著潛在的應(yīng)用價值。

1.2 circRNA的生物學(xué)特性

circRNA不包括典型的5′端帽子與3′端多聚A尾結(jié)構(gòu)，由前體RNA首尾閉合形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，多數(shù)存在于細胞質(zhì)中，少數(shù)在細胞核中表達。由于其特殊的結(jié)構(gòu)，circRNA具有多種特定的生物學(xué)功能。

1.2.1 充當(dāng)miRNA的分子海綿

circRNA是一類非編碼RNA。部分circRNA上具有多個miRNA或相同miRNA的多個結(jié)合位點，可充當(dāng)分子海綿，與靶基因競爭性結(jié)合miRNA，調(diào)節(jié)其信使RNA(mRNA)靶點來影響基因調(diào)控，進而抑制其生物學(xué)功能[10]。雖已發(fā)現(xiàn)數(shù)以萬計的circRNA與其他RNA競爭miRNA結(jié)合位點，但只有幾個circRNA被驗證[14]。例如，Cdr1as在胰島細胞中通過競爭結(jié)合miR-7促進胰島細胞中胰島素mRNA增加從而影響胰島素的分泌[15]。ZHANG等[16]發(fā)現(xiàn)circRNA-vgll3通過競爭結(jié)合miR-326-5p抑制ITGA5的翻譯對ADSCs的成骨分化具有調(diào)控作用，circRNA-vgl13調(diào)控后的ADSCs顯著促進成骨分化的活性，從而促進了新骨的生成。另有研究[17]發(fā)現(xiàn)，circRNA_101237在非小細胞肺癌(NSCLC)組織中明顯上調(diào)，而circRNA_101237的高表達與淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤體積大小、TNM分期呈正相關(guān)，通過進一步實驗驗證hsa_circ_101237通過miR-940海綿促進MAPK1的表達，從而影響腫瘤細胞的惡性進展。臨床上可通過檢驗hsa_circ_101237的表達來預(yù)測NSCLC患者的不良預(yù)后[17]。而且，由于circRNA的豐度和穩(wěn)定性，circRNA比非circRNA在海綿miRNA中更有效[4]，這對于充當(dāng)miRNA海綿的RNA來說是一個明顯的優(yōu)勢。通過對circRNA分子海綿作用的深入研究，circRNA有可能成為治療各種疾病的靶點及疾病診斷與預(yù)后判斷的標(biāo)志物。

1.2.2 circRNA與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控

部分circRNA上具有miRNA結(jié)合位點，但大多數(shù)circRNA沒有足夠的miRNA結(jié)合位點來作為海綿發(fā)揮作用，而沒有足夠miRNA結(jié)合位點的circRNA可通過與轉(zhuǎn)錄因子等結(jié)合形成復(fù)合物后，參與調(diào)控mRNA的轉(zhuǎn)錄。有研究[18]發(fā)現(xiàn)，circMbl可以和MBL蛋白結(jié)合,干擾mRNA前體的剪接,降低MBL蛋白水平。DU等[19]發(fā)現(xiàn)circFoxo3通過與p21和Cdk2形成三元復(fù)合物后，減少了游離的Cdk2和p21，避免了cyclin E/Cdk2復(fù)合物的形成，同時也消除了p21對cyclin A/Cdk2復(fù)合體的抑制作用，使細胞周期進程被阻滯在G1期，不能過渡到S期，從而抑制了細胞周期進程。

1.2.3 部分circRNA編碼肽鏈

長期以來，circRNA一直被認為作為功能性RNA直接參與各種生物過程。但近年發(fā)現(xiàn)部分circRNA具有翻譯功能，且所產(chǎn)生的多肽在人類疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著生物學(xué)作用。有研究[20]發(fā)現(xiàn)，circSHPRH具有開放閱讀框架，可編碼SHPRH-146aa，由含146個氨基酸的多肽組成，SHPRH-146aa是保護SHPRH免受泛素蛋白酶體降解的誘餌分子，從而增加SHPRH的水平。另有研究[21]發(fā)現(xiàn)circPP1R12A編碼的PPP1R12A-73aa通過激活YAP1激活Hippo-YAP信號通路，從而提高癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

2 circRNA與肺纖維化

IPF是一種發(fā)病機制不明的源于肺泡上皮反復(fù)發(fā)生微小損傷后的異常修復(fù),最終導(dǎo)致肺瘢痕形成和不可逆轉(zhuǎn)的功能喪失。近年來，circRNA在肺部疾病中的作用成為研究熱點，且與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。

circRNA CDR1as(CIRS-7)是研究最多的circRNA之一。有研究[22]發(fā)現(xiàn)，在SiO2誘導(dǎo)的肺纖維化模型中，CIRS-7可以通過海綿作用于miR-7，而miR-7是一種重要的纖維化抑制因子，靶向轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)/smad信號通路，抑制內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，從而促進TGF-β1的釋放，在人支氣管上皮細胞和A549細胞中發(fā)揮促纖維化分子的作用。LI等[23]發(fā)現(xiàn)circTADA2A通過miR-526b/Cav1抑制肺成纖維細胞的活化，通過miR-203/Cav2抑制肺成纖維細胞的增殖，從而抑制ECM的過度沉積減輕IPF。在astilbin處理組與博萊霉素(BLM)處理組肺纖維化小鼠模型中，circRNA 662和949可以作為miR 29b海綿靶向Gli2和STAT3發(fā)揮其功能。抑制STAT3表達可保護小鼠免受BLM誘導(dǎo)的肺纖維化[24]。Gli2是Hedgehog信號通路的一個組成部分，在astilbin作用下該通路在肺纖維化中起到調(diào)節(jié)作用[24]。另有研究[25]用微陣列鑒定IPF患者血漿中circRNA，共發(fā)現(xiàn)67個差異表達的circRNA，其中38個circRNA上調(diào)，29個circRNA下調(diào)，特別是circRNA_100906、circRNA_102100和circRNA_102348表達呈顯著上調(diào)，而circRNA_101225、circRNA_104780和circRNA_101242表達呈明顯下調(diào)。熒光素酶報告基因證實circRNA_100906和circRNA_102348分別與miR-324-5p和miR630有著直接的相互作用[25]，而miR-324-5p和miR630在特發(fā)性肺纖維化患者中表達下調(diào)。circHIPK3是肺組織中表達最豐富的circRNA之一。有研究[26]發(fā)現(xiàn)，在BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中，HIPK3在成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化(fibroblast-to-myofibroblast transition，F(xiàn)MT)來源的肌成纖維細胞中表達上調(diào)。在體內(nèi)外實驗中，circHIPK3沉默可以改善FMT，抑制成纖維細胞增殖。進一步研究[26]證實circHIPK3通過作為內(nèi)源性miR-338-3p海綿調(diào)節(jié)FMT，并抑制miR-338-3p的活性，從而導(dǎo)致Sox4和COL1A1表達增加。另有研究[27]發(fā)現(xiàn)，circZC3H4RNA通過miR-212調(diào)節(jié)ZC3H4蛋白，從而激活巨噬細胞，激活的巨噬細胞進而促進成纖維細胞的增殖和遷移。ZHOU等[28]發(fā)現(xiàn)，在SiO2處理的巨噬細胞中circHECTD1表達減少，但在肺組織中積累。累積的circHECTD1可能與HECTD1蛋白競爭ZC3H12A來抑制ZC3H12A的泛素化，并影響巨噬細胞M1/M2的極化和激活，從而啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)。

3 circRNA作為競爭內(nèi)源性RNA在肺纖維化中的作用

miRNA通過與mRNA結(jié)合來沉默基因，而circRNA通過競爭性結(jié)合miRNA來調(diào)節(jié)基因的表達。circRNA作為競爭性內(nèi)源RNA，其有miRNA結(jié)合位點，可以結(jié)合特定的miRNA，調(diào)節(jié)miRNA和mRNA的結(jié)合[29]。circRNA/miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與了許多肺纖維化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。例如，circRNA/miRNA/mRNA的競爭內(nèi)源性RNA網(wǎng)絡(luò)提示，circRNA保護的mRNA參與TGF-β1、缺氧誘導(dǎo)因子-1、Wnt、Janus激酶、Rho相關(guān)蛋白激酶、血管內(nèi)皮生長因子等信號通路，其中circRNA_100906可能通過隔離miR-324-5p和miR-330-5p而觸發(fā)SOCS1、ROCK1、SP1、NEMO樣激酶、MMP1、含有2個溴域的溴結(jié)構(gòu)域、ECM1、ITGBL1、磷酸肌醇-3-激酶調(diào)節(jié)亞基3和成纖維細胞生長因子受體2的上調(diào)[25]。LU等[24]在astilbin與BLM處理的肺纖維化小鼠模型中發(fā)現(xiàn)22個miRNA與circRNA-394、662、949和986的結(jié)合位點。進一步研究發(fā)現(xiàn)circRNA與RNA及其蛋白編碼基因可以協(xié)作建立一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這可能為探討IPF的潛在分子機制提供了一條新的途徑。

4 外泌體circRNA的潛在臨床價值

外泌體是一種微型納米級細胞外囊泡，其攜帶的核酸、蛋白質(zhì)等內(nèi)含物能夠影響受體細胞的生理狀態(tài)[30]。根據(jù)外泌體攜帶物質(zhì)不同，對疾病產(chǎn)生的影響亦不同，外泌體可存在于生理體液中，如支氣管肺泡灌洗液、血漿、惡性滲出液、尿液和痰液等[31-32]。目前在外泌體中已發(fā)現(xiàn)的RNA有mRNA、miRNA、circRNA。其中與circRNA緊密相連的外泌體是近年來的另一個研究熱點。有研究[33]發(fā)現(xiàn)，在退行性鼻咽癌中外泌體轉(zhuǎn)運的circRNA_0000253通過吸附miRNA1415p和下調(diào)sirt1被證實具有增加碘缺乏病的作用。另有研究[34]發(fā)現(xiàn)，circRNA_0044516通過下調(diào)miR-29a-3p的表達抑制了前列腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，提示cicRNA_0044516在前列腺癌中起致癌作用，可作為前列腺癌的潛在生物標(biāo)志物。CHEN等[35]發(fā)現(xiàn)CIRC-0051443通過外泌體從正常細胞傳播到肝癌細胞，通過促進細胞凋亡、阻滯細胞周期等途徑抑制肝癌細胞的惡性生物學(xué)行為；同時在動物實驗中發(fā)現(xiàn)外泌體CIRC-0051443通過上調(diào)裸鼠移植瘤BAK1的表達，降低移植瘤的重量和體積，提示外泌體CIRC-0051443可以作為肝癌的預(yù)測指標(biāo)和潛在的治療靶點。在肺纖維化中，目前針對外泌體的核酸研究主要集中于miRNA，而外泌體攜帶的circRNA對PF的影響需要進一步研究探索。

5 小結(jié)

綜上，circRNA在PF中具有重要的調(diào)控性作用。首先，作為分子海綿，circRNA可作用于特定的miRNA及其相應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進而影響肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。其次，circRNA、miRNA以及其它靶蛋白之間存在相互調(diào)節(jié)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，并可通過調(diào)控下游的信號通路如TGF-β1、缺氧誘導(dǎo)因子-1、成纖維細胞生長因子受體2等影響肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。但是其海綿作用如何最大調(diào)控靶基因與miRNA之間的競爭以及基因的多元化仍是目前亟需解決的難題。盡管如此，circRNA作為肺纖維化診斷、治療的靶點有著較大的潛在價值，需要深入探索。