非小細(xì)胞肺癌新靶向癌基因的研究進(jìn)展

耿僡臨，胡鵬程，翁 艷

目前，肺癌是癌癥死亡的主要原因之一，非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)約占肺癌的85%，治療以手術(shù)切除為主，且多數(shù)患者在確診時(shí)已為晚期，預(yù)后不良。近年NSCLC的治療方法已取得較大進(jìn)展，尤其是針對特異性分子改變的靶向治療。識別腫瘤的基因突變可有效促進(jìn)靶向治療的發(fā)展。全基因組篩查肺癌的基因突變?yōu)榛颊咛峁┬碌闹委煓C(jī)會，不同分子分型的患者也已從靶向治療中獲益。最近的全基因組測序分析發(fā)現(xiàn)NSCLC中復(fù)雜的分子改變，并為個(gè)體化醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供基礎(chǔ)，個(gè)體化用藥的成功依賴于適當(dāng)選擇對治療有反應(yīng)的患者，新一代測序技術(shù)可以對癌癥基因組進(jìn)行更深入的研究。因此，NSCLC新分子靶點(diǎn)是目前研究的重點(diǎn)。本文對近年NSCLC靶向癌基因的研究進(jìn)展作一綜述，包括ROS1、RET、HER-2、FGFR1、BRAF和DDR2基因，為NSCLC靶向治療提供更有效的依據(jù)。

1 ROS1基因重排

ROS1位于第6號染色體上，編碼1個(gè)受體酪氨酸激酶，由富含糖蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域及胞內(nèi)酪氨酸激酶組成。ROS1重排最初在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中被發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生新的融合基因，ROS1融合是潛在的致癌因素。最近，在其他幾種惡性腫瘤中也發(fā)現(xiàn)ROS1重排，包括膽管癌、卵巢癌和胃癌。ROS1重排的NSCLC是一種具有獨(dú)特臨床病理特征的分子亞型。研究表明，ROS1重排的NSCLC患者年齡較小，無吸煙史，腫瘤分期多為晚期，組織學(xué)類型多為腺癌，在大細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌中較少出現(xiàn)[1-2]。

ROS1是NSCLC有效的治療靶點(diǎn)。在1%～2%的NSCLC中出現(xiàn)ROS1基因染色體重排。臨床攜帶ROS1融合基因的NSCLC患者對ROS1靶向酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKI)產(chǎn)生明顯的治療反應(yīng)。間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)基因重排NSCLC也是一種獨(dú)特的分子亞型。ROS1重排患者與ALK陽性患者具有很多共同特征，ROS1基因與ALK基因具有同源性，這種結(jié)構(gòu)相似性是利用ALK抑制劑治療ROS1陽性NSCLC的理論基礎(chǔ)?？诉蛱婺崾悄壳爸委烺OS1陽性NSCLC的一線藥物，對克唑替尼耐藥性機(jī)制的研究也促進(jìn)了新型酪氨酸激酶抑制劑的發(fā)展。目前另外幾種具有ROS1抑制活性的抑制劑，包括氯拉替尼、卡伯贊替尼、恩替尼等亦正在研究中[3-4]。

在NSCLC中，ROS1重排與其他致癌基因(包括EGFR、KRAS、ALK等)的改變同時(shí)發(fā)生較少，且這些基因改變通常相互排斥。但在一項(xiàng)對ROS1重排NSCLC的高通量測序研究中發(fā)現(xiàn)一些額外的基因改變，包括TP53突變、CDKN2A/B缺失和CTNNB1突變。臨床發(fā)現(xiàn)患者可能存在其他癌基因的伴隨突變，應(yīng)在進(jìn)行靶向治療之前確認(rèn)分子診斷。對于ROS1重排和其他基因改變同時(shí)發(fā)生的頻率，以及與ROS1融合共同發(fā)生的基因變化是否與其生物學(xué)行為和治療相關(guān)，需收集更多的病例進(jìn)行分析[5-7]。

目前，檢測ROS1的方法包括免疫組化、FISH、RT-PCR、DNA或RNA測序，每種檢測方法均有其獨(dú)特的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)。雖然使用ROS1免疫組化抗體D4D6可篩選適合靶向治療的NSCLC患者。有文獻(xiàn)報(bào)道免疫組化和FISH檢測結(jié)果不一致病例，免疫組化檢測ROS1呈強(qiáng)陽性，而FISH檢測呈陰性。ROS1重排NSCLC在年輕和晚期患者中發(fā)生率高，組織學(xué)表現(xiàn)為篩狀結(jié)構(gòu)、細(xì)胞外黏液和砂粒體，而ROS1檢測不一致病例發(fā)生在分期較早的老年患者，組織學(xué)呈鱗屑樣生長方式。大多數(shù)ROS1重排NSCLC無其他基因的聯(lián)合突變，73%的ROS1檢測不一致病例同時(shí)存在其他基因突變，包括EGFR和ERBB2[8]。通過排除EGFR/ALK陽性病例，使用免疫組化法篩查ROS1陽性病例進(jìn)行FISH檢測，可增強(qiáng)識別ROS1重排肺癌的可能性，并避免對所有病例進(jìn)行昂貴且耗時(shí)的FISH檢測[9]，目前具體的實(shí)施還需制定標(biāo)準(zhǔn)化的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評估。

2 RET基因重排

RET是一種在轉(zhuǎn)染過程中發(fā)生重排的原癌基因，位于染色體10q11.2，編碼1個(gè)受體酪氨酸激酶，由胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)酪氨酸激酶3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。RET通常在神經(jīng)元、交感神經(jīng)節(jié)和副交感神經(jīng)節(jié)、甲狀腺C細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞、泌尿生殖道細(xì)胞和睪丸生殖細(xì)胞中表達(dá)。RET激活后發(fā)生自體磷酸化，并參與下游信號通路RAS/MAPK/ERK、PI3K/AKT和磷脂酶C-γ，促進(jìn)細(xì)胞生長、遷移和分化，其功能改變與人類癌癥有關(guān)。最近，在NSCLC中也發(fā)現(xiàn)RET基因重排，已確定4種不同的RET融合基因：KIF5B、CCDC6、TRIM33和NCOA4，其中KIF5B最常見。除TRIM33外，其余基因均位于10號染色體上，因此NSCLC中RET融合主要是通過染色體內(nèi)重排發(fā)生。NSCLC中RET重排檢測方法包括FISH、RT-PCR和免疫組化，其中FISH檢測最為準(zhǔn)確。RET基因重排與EGFR、KRAS、ALK、HER-2和BRAF基因突變相互排斥，提示RET基因融合是NSCLC中獨(dú)立的致癌因素。有研究表明，RET基因融合是NSCLC可行的治療靶點(diǎn)。在表達(dá)KIF5B-RET的細(xì)胞系模型中，具有抗RET活性的多靶點(diǎn)TKIs(舒尼替尼、索拉非尼和萬德他尼)可抑制腫瘤細(xì)胞生長，相反，用不具有抗RET活性的吉非替尼或克唑替尼治療，則無抑制作用[10-11]。

3 HER-2基因擴(kuò)增

HER-2(EGFR2/ERBB2)是EGFR受體酪氨酸激酶家族的成員之一，HER-2基因位于17號染色體上，編碼1個(gè)具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，與EGFR受體具有同源性，在某些人類腫瘤的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。所有HER-2基因突變均為第20外顯子的框架內(nèi)插入，與EGFR基因插入相同。HER-2基因擴(kuò)增導(dǎo)致蛋白表達(dá)增強(qiáng)。近年已有研究報(bào)道其在肺癌中發(fā)生突變。HER-2在乳腺癌和卵巢癌中均存在過表達(dá)和基因擴(kuò)增，與患者預(yù)后不良相關(guān)。肺癌中HER-2基因擴(kuò)增的發(fā)生率低于乳腺癌，HER-2過表達(dá)約占20%，主要為不吸煙的腺癌患者。曲妥珠單抗是一種人源性單克隆抗體，結(jié)合HER-2的細(xì)胞外區(qū)域，與其他細(xì)胞毒藥物一起使用對治療HER-2過表達(dá)乳腺癌患者有效，然而在NSCLC中，使用曲妥珠單抗的臨床試驗(yàn)結(jié)果并不理想。蛋白激酶抑制劑吉非替尼(易瑞沙，ZD1839)和厄洛替尼(特羅凱，OSI-774)目前也用于治療NSCLC。

EGFR家族成員還包括EGFR(HER-1/ERBB1)、EGFR3(HER-3/ERBB3)和EGFR4(HER-4/ERBB4)，這些基因均包含細(xì)胞外、跨膜和細(xì)胞內(nèi)區(qū)域，最大的同源區(qū)域是包含在細(xì)胞內(nèi)的激酶區(qū)域。這些基因均有不同的特性，HER-2有很強(qiáng)的激酶活性，能形成同源二聚體和異源二聚體，但無確定的配體；EGFR3在關(guān)鍵的TK結(jié)構(gòu)域殘基上發(fā)生替換而缺乏激酶活性。最近，關(guān)于EGFR TK結(jié)構(gòu)域突變的研究發(fā)現(xiàn)，其可預(yù)測吉非替尼或厄洛替尼的敏感性，這些研究結(jié)果引出“致癌基因成癮”的概念，即假設(shè)癌細(xì)胞均是依賴于活化的致癌基因而存活。因此，包括EGFR家族成員在內(nèi)的蛋白激酶的致癌活化均應(yīng)是癌癥治療的靶點(diǎn)[12-13]。

NSCLC細(xì)胞系和20%～50%的病理標(biāo)本均表達(dá)HER-2，表明HER-2是NSCLC有意義的研究靶點(diǎn)。HER-2表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素。在乳腺癌中使用FISH檢測HER-2基因擴(kuò)增情況，選擇符合曲妥珠單抗治療條件的患者。在對肺癌細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，HER-2蛋白表達(dá)與單獨(dú)使用曲妥珠單抗或聯(lián)合使用細(xì)胞抑制藥物的有效性存在正相關(guān)。在肺癌中，目前還不明確什么水平的HER-2蛋白表達(dá)或基因擴(kuò)增程度將影響患者預(yù)后和治療，因此還需進(jìn)一步開展前瞻性的臨床試驗(yàn)。根據(jù)乳腺癌研究的臨床經(jīng)驗(yàn)，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注HER-2免疫組化3+和(或)基因擴(kuò)增的NSCLC患者。

4 FGFR1基因擴(kuò)增

成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)家族由18個(gè)內(nèi)在組織調(diào)節(jié)多肽組成，這些多肽通過結(jié)合、激活跨膜FGF受體(FGFR)酪氨酸激酶調(diào)控細(xì)胞生長。FGFR屬于糖基化多肽，由胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域組成，有4個(gè)基因編碼FGFR：FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4。FGF信號通路的異常表達(dá)、激活或失活與多種發(fā)育障礙疾病和腫瘤相關(guān)[14]。配體與FGFR結(jié)合，激活下游3個(gè)通路：Ras-MAP激酶通路、PI3K-AKT-mTOR通路和PLCγ-Ca2+通路，以控制細(xì)胞增殖和分化。FGFR底物FRS2的磷酸化水平升高與FGFR抑制劑的敏感性增加有關(guān)，表明FGFR信號活躍的細(xì)胞可能對治療更為敏感，然而FGF配體在腫瘤微環(huán)境中的分泌可能并不能激活人類腫瘤中的FGFR。因此，F(xiàn)GF配體的表達(dá)與FGFR抑制反應(yīng)之間的相關(guān)性，還需在人類腫瘤及其微環(huán)境的肺癌模型中進(jìn)一步分析。

FGFR1是一個(gè)膜結(jié)合受體酪氨酸激酶，通過MAPK和PI3K通路調(diào)節(jié)增殖，類似EGFR。

在20%的肺鱗狀細(xì)胞癌中存在FGFR1擴(kuò)增，在肺腺癌中僅占1%。使用FGFR抑制劑的治療在臨床實(shí)驗(yàn)中顯示出部分的治療反應(yīng)。MYC是細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)因子，在腫瘤中過表達(dá)，也參與細(xì)胞凋亡。與單獨(dú)表達(dá)FGFR1的細(xì)胞相比，同時(shí)表達(dá)MYC和FGFR1的細(xì)胞系對FGFR抑制更敏感，提示共同表達(dá)MYC可能增加FGFR抑制劑的敏感性。另外，在肺癌的免疫治療中，F(xiàn)GFR抑制可能導(dǎo)致活化的T細(xì)胞抗原呈遞增加，表明免疫治療聯(lián)合FGFR抑制劑可能增強(qiáng)治療反應(yīng)。因此，F(xiàn)GFR抑制劑可與其他靶向治療或免疫治療聯(lián)合使用。對FGFR1基因擴(kuò)增腫瘤發(fā)病機(jī)制的探索，以及對FGFR抑制劑敏感性和介導(dǎo)耐藥的因素更深入的分析，對選擇患者和提高FGFR抑制劑在肺癌中治療的成功率至關(guān)重要[15-16]。

5 BRAF基因突變

BRAF是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，通常被人類癌癥中的體細(xì)胞點(diǎn)突變激活。BRAF位于MAPK信號級聯(lián)系統(tǒng)中KRAS的下游。BRAF突變發(fā)生在60%的黑色素瘤中，并在其他惡性腫瘤(如結(jié)直腸癌、卵巢癌和甲狀腺乳頭狀癌)中高頻出現(xiàn)，表明RAS-RAF-MEK-ERK通路在促進(jìn)腫瘤的發(fā)生中具有重要意義。RAF-MEK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一種保守的由RAS激活的蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)，通過對生長因子、細(xì)胞因子和激素的反應(yīng)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖和分化。RAF是RAS下游識別的第一個(gè)效應(yīng)器。RAF激活由RAS-GTP與位于激酶N端調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi)的RAS結(jié)合域(receptor-binding domain, RBD)結(jié)合啟動，隨后促進(jìn)RAF磷酸化，刺激其絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，觸發(fā)MEK和ERK的連續(xù)磷酸化和激活。人類三種功能性RAF蛋白ARAF、BRAF和CRAF(CRAF-1)依賴于活化片段的磷酸化，BRAF的激酶活性最高。目前已發(fā)現(xiàn)30多個(gè)與人類癌癥相關(guān)的BRAF基因突變，其中大部分位于激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)。BRAF突變是惡性腫瘤的關(guān)鍵促進(jìn)因子[17]。

在黑色素瘤中，BRAF突變最常見于15號外顯子，在密碼子600(V600E)處的纈氨酸取代谷氨酸[18]，而NSCLC中BRAF突變大多數(shù)都不是11號和15外顯子中的V600E。在NSCLC細(xì)胞系中，BRAF突變大多來自腺癌細(xì)胞系，有研究在肺腺癌中發(fā)現(xiàn)了11號外顯子上的2個(gè)新突變：V458L和K438T。V458L是甘氨酸環(huán)(G環(huán))中第1個(gè)甘氨酸上游的5個(gè)密碼子，其可能會改變相鄰G環(huán)的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致活化；K438T突變改變了AKT磷酸化的蘇氨酸旁殘基，BRAF有3個(gè)AKT磷酸化位點(diǎn)：Thr439、Ser428和Ser364，K438T和K438Q可能會抑制相鄰Thr439的AKT依賴性磷酸化。另外，有研究在肺鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)了位于11號外顯子的T439P突變和15號外顯子的L596V、V599E突變[19]。另一項(xiàng)研究中，127例肺腺癌中有2例BRAF突變，1例為11號外顯子中G1394T(G465V)錯(cuò)義突變，1例為15號外顯子中T1787G(L596R)錯(cuò)義突變[20]。這些研究表明，BRAF突變激活可能通過多種機(jī)制發(fā)生[21]。

目前，NSCLC中BRAF突變罕見，與黑色素瘤中的BRAF突變在性質(zhì)上存在差異，并且BRAF突變對預(yù)測靶向藥物療效的價(jià)值仍不清楚，特別是對于BRAF非V600E的突變。因此，還需更深入、更大樣本量的臨床試驗(yàn)[22-23]。

6 DDR2基因突變

盤狀蛋白結(jié)構(gòu)域受體(discoidin domain receptors, DDR)是與EGFR同源的受體酪氨酸激酶，盤狀蛋白結(jié)構(gòu)域受體DDR1和DDR2與多種人類癌癥有關(guān)，如乳腺癌、食管癌、卵巢癌和肺癌。DDR1基因由19個(gè)外顯子組成，編碼序列為2 742 bp；DDR2也有19個(gè)外顯子，編碼1個(gè)2 568 bp的mRNA。DDR1在腫瘤細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)，而DDR2在腫瘤間質(zhì)中表達(dá)，傳遞細(xì)胞外間質(zhì)信號，在細(xì)胞增殖、黏附、遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移中起調(diào)節(jié)作用。DDR2包括獨(dú)特的盤蛋白同源區(qū)、柄區(qū)、跨膜區(qū)、近膜區(qū)和激酶區(qū)。DDR2與內(nèi)源性配體膠原蛋白結(jié)合，通過與配體結(jié)合和磷酸化激活時(shí)促進(jìn)細(xì)胞遷移和生長增殖。在肺癌中已發(fā)現(xiàn)2個(gè)DDR2突變：R105S和N456S。在一項(xiàng)對290例肺鱗狀細(xì)胞癌樣本的研究中，發(fā)現(xiàn)11例DDR2基因新的體細(xì)胞突變，DDR2可能是肺鱗狀細(xì)胞癌的重要治療靶點(diǎn)之一[24-25]。

綜上所述，NSCLC新靶點(diǎn)的研究在指導(dǎo)臨床靶向治療中具有重要作用，包括ROS1和RET基因重排、HER-2和FGFR1基因擴(kuò)增、BRAF和DDR2基因突變等，但這些研究尚未完善，還需更大樣本量實(shí)驗(yàn)和臨床研究，為NSCLC的分子分型及臨床靶向治療提供更準(zhǔn)確、更有效的依據(jù)。