B淋巴細(xì)胞瘤-xL蛋白及其在腫瘤耐藥中作用機(jī)制的研究進(jìn)展〔1〕

楊偉鋒，李曉寧，李軍岐，許書(shū)君，王菁婧，張晨靜

(1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001)

臨床上治療腫瘤的三種手段是手術(shù)、放療和化療，只有化療是全身治療手段，但耐藥性極大地影響了化療藥物的療效。研究[1]顯示，B淋巴細(xì)胞瘤-XL蛋白(Bcl-xL)是腫瘤耐藥機(jī)制中的一個(gè)重要靶點(diǎn)，尤其是它在腫瘤細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)與腫瘤耐藥密切相關(guān)，且在結(jié)直腸癌、膀胱癌、白血病、卵巢癌及宮頸癌等腫瘤中都得到證實(shí)。因此認(rèn)識(shí)Bcl-xL蛋白并探究其在腫瘤耐藥中的作用機(jī)制對(duì)未來(lái)腫瘤研究的發(fā)展至關(guān)重要。本文就目前Bcl-xL蛋白的研究進(jìn)展，從其分子結(jié)構(gòu)、生物功能、調(diào)節(jié)機(jī)制以及在腫瘤耐藥中的作用機(jī)制等方面進(jìn)行闡述，為今后腫瘤耐藥機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 B淋巴細(xì)胞瘤-XL蛋白

1.1 Bcl-xL蛋白的結(jié)構(gòu)

B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)家族蛋白是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要蛋白。1984年Bcl-2基因在人類(lèi)的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞異位染色體t(14，18)上首次克隆產(chǎn)生，從此打開(kāi)Bcl-2家族蛋白的探索之門(mén)。截至目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了25種Bcl-2同源蛋白。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能主要分為三類(lèi)：第一類(lèi)具有抗凋亡的作用，包括Bcl-2，Bcl-w，Bcl-xL等；第二類(lèi)具有促凋亡作用，包括Bax，Bak等；第三類(lèi)只有BH3結(jié)構(gòu)域，稱(chēng)為BH3-only，同樣具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-xL是Bcl-2家族中第一個(gè)闡明空間結(jié)構(gòu)域的蛋白，它是利用X射線晶體衍射與核磁共振分光術(shù)相結(jié)合的方式獲得的，促進(jìn)了Bcl-2家族中其他蛋白結(jié)構(gòu)的研究。Bcl-xL是一種由233個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其所包含的結(jié)構(gòu)域與Bcl-2相似。它是由一條長(zhǎng)度可變的環(huán)形結(jié)構(gòu)連接8個(gè)α螺旋構(gòu)成，含有與Bcl-2同源的結(jié)構(gòu)域—BH1，BH2，BH3和BH4，其中BH4，BH3結(jié)構(gòu)域分別與α螺旋1、α螺旋2相對(duì)應(yīng)，BH1結(jié)構(gòu)域與α螺旋5以及與其相連的環(huán)形結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)，BH2與α螺旋6及其下游的結(jié)構(gòu)域相對(duì)應(yīng)。在Bcl-xL蛋白中有一個(gè)疏水環(huán)，它的頂部由BH1，BH2，BH3三個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，底部由α螺旋3和α螺旋4構(gòu)成。這個(gè)疏水環(huán)可以與Bcl-2家族中部分促凋亡蛋白上相應(yīng)的結(jié)構(gòu)結(jié)合形成一個(gè)異源二聚體，從而發(fā)揮Bcl-xL的抗凋亡作用[1]。正常情況下，合成的Bcl-xL散布在胞質(zhì)中，只有接受細(xì)胞凋亡信號(hào)時(shí)，它才會(huì)迅速轉(zhuǎn)移到線粒體膜表面發(fā)揮作用。Bcl-xL作為細(xì)胞中抗凋亡的主要作用因子，還有其他重要作用，例如在對(duì)成年小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，Bcl-xL蛋白對(duì)輻射引起的腎臟損害所致的貧血具有保護(hù)作用[2]；其次還發(fā)現(xiàn)Bcl-xL蛋白可通過(guò)對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)和突觸可塑性的調(diào)節(jié)、對(duì)Ca2+信號(hào)傳遞的調(diào)節(jié)來(lái)促進(jìn)ATP合成和提高代謝效率；另外其在自身免疫性疾病與衰老過(guò)程中也發(fā)揮重要作用[3]。

1.2 Bcl-xL蛋白的功能及其調(diào)控機(jī)制

Bcl-xL最主要的作用為抑制細(xì)胞凋亡，其在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。細(xì)胞凋亡是指機(jī)體為維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定而通過(guò)一系列基因調(diào)控細(xì)胞死亡的過(guò)程。細(xì)胞凋亡主要有三種途徑，分別是死亡受體凋亡途徑、線粒體途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。Bcl-xL主要通過(guò)線粒體途徑發(fā)揮其抗凋亡作用。在線粒體凋亡途徑中，當(dāng)接收到細(xì)胞凋亡信號(hào)時(shí)，線粒體在各種因子作用下發(fā)生線粒體膜通透性改變，使線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)孔開(kāi)放、跨膜電位降低，引起凋亡啟動(dòng)因子細(xì)胞色素c和凋亡誘導(dǎo)因子釋放，激活半胱氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使DNA分子斷裂產(chǎn)生凋亡小體，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在這一個(gè)過(guò)程中Bcl-xL蛋白迅速聚集到線粒體外膜，通過(guò)疏水環(huán)與促凋亡蛋白Bax的BH3結(jié)構(gòu)域之間的特異性結(jié)合來(lái)抑制線粒體外膜通透性改變，從而阻止線粒體凋亡途徑的進(jìn)行，進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡作用[5]。由此可見(jiàn)，調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵點(diǎn)在于Bcl-xL蛋白的產(chǎn)生。目前已知Bcl-xL蛋白是人類(lèi)第20號(hào)染色體上的Bcl-xL基因通過(guò)選擇性剪接產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。細(xì)胞凋亡在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，主要是通過(guò)一系列的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)Bcl-xL基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而影響B(tài)cl-xL蛋白的產(chǎn)生。研究[6]顯示，在人的成骨細(xì)胞中表達(dá)一種轉(zhuǎn)錄因子即GATA-DNA結(jié)合蛋白(GTA-3)，可以調(diào)節(jié)Bcl-xL基因表達(dá)的反式激活活性來(lái)影響骨折的愈合。在大腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA HEIH(lncRNA-HEIH)可以破壞miR-939與核因子κb(NF-κb)的結(jié)合，導(dǎo)致NF-κb與Bcl-xL啟動(dòng)子的結(jié)合增加，最終促進(jìn)Bcl-xL基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[7]。另外，研究[8]發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子(Nrf2)可以與細(xì)胞保護(hù)基因啟動(dòng)子區(qū)的抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，增強(qiáng)其表達(dá)；過(guò)表達(dá)的Nrf2可以增強(qiáng)抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞的耐藥性[8]。

目前已知Bcl-xL蛋白的降解主要通過(guò)泛素化蛋白酶體系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)。在泛素化蛋白酶體系統(tǒng)中最重要的酶是E3泛素連接酶，它決定了泛素化對(duì)底物的選擇性和特異性[9]?？缒し核剡B接酶RNF-183是一個(gè)含有典型C3HC4環(huán)指結(jié)構(gòu)的蛋白，在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞系中很常見(jiàn)。該蛋白主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜整合蛋白，具有E3泛素連接酶的活性，它可以多聚泛素化修飾Bcl-xL，促使Bcl-xL蛋白的降解[10]。在對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，特異性激活蛋白酶活化受體2(PAR2)可以顯著上調(diào)Bcl-xL蛋白的表達(dá)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Bcl-xL蛋白的半衰期延長(zhǎng)。研究[11]表明，激活PAR2信號(hào)通路能夠增加促凋亡蛋白Bad的磷酸化，同時(shí)增加抗凋亡蛋白Mcl-1表達(dá)的磷酸化，而B(niǎo)ad與Mcl-1都屬于Bcl-2蛋白家族。所以在敲除結(jié)直腸癌細(xì)胞中PAR2基因后，我們發(fā)現(xiàn)E3泛素連接酶RNF152的表達(dá)顯著增加，同時(shí)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的RNF152可明顯降低Bcl-xL蛋白的表達(dá)水平。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RNF152可以與Bcl-xL蛋白相互作用，且活化的PAR2可以降低RNF152與Bcl-xL蛋白之間的相互作用。由此表明，PAR2可能通過(guò)抑制Bcl-xL蛋白的泛素化降解而促進(jìn)Bcl-xL蛋白在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的高表達(dá)，證實(shí)在結(jié)直腸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的Bcl-xL蛋白可能受PAR2的調(diào)控，從而影響其耐藥性[12]。研究[13]發(fā)現(xiàn)維甲酸-干擾素誘導(dǎo)的死亡相關(guān)基因GRIM19在對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性的晚期膀胱癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)Bcl-xL蛋白的泛素化，并推斷該泛素化過(guò)程可能以P38/JNK依賴(lài)的方式進(jìn)行，且已證實(shí)可以降低癌細(xì)胞中Bcl-xL蛋白的表達(dá)，降低膀胱癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。研究[14]發(fā)現(xiàn)跨膜E3泛素連接酶RNF183能以泛素化依賴(lài)的方式降解抗凋亡蛋白Bcl-xL。由此可見(jiàn)，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)的Bcl-xL蛋白的降解可能為Bcl-xL高表達(dá)導(dǎo)致的腫瘤耐藥提供了新的治療靶點(diǎn)。

此外，腫瘤抑制因子p73在胞漿中通過(guò)其反式激活結(jié)構(gòu)域(TAD)與Bcl-xL中一個(gè)非經(jīng)典位點(diǎn)結(jié)合，影響B(tài)cl-xL的修飾識(shí)別模式，從而誘導(dǎo)細(xì)胞以線粒體途徑凋亡[13]。

2 Bcl-xL與腫瘤耐藥

目前研究表明腫瘤化療失敗的主要原因是腫瘤耐藥[14]。腫瘤產(chǎn)生耐藥的原因多種多樣，包括耐藥相關(guān)蛋白的異常表達(dá)、DNA損傷和修復(fù)功能障礙、細(xì)胞自噬以及細(xì)胞的凋亡機(jī)制異常等[15]?；熕幬餁⑺滥[瘤細(xì)胞的主要機(jī)制就是通過(guò)各種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。近年不斷有研究者發(fā)現(xiàn)[16]，抗凋亡蛋白Bcl-xL在多種耐藥腫瘤細(xì)胞中都有過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象。在小細(xì)胞癌、膀胱癌、黑色素瘤以及急性髓系白細(xì)胞病(AML)，尤其是化療耐藥的AML中，都發(fā)現(xiàn)了抗凋亡蛋白Bcl-xL過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象。研究[17]顯示通過(guò)人工調(diào)節(jié)Bcl-xL蛋白在膠質(zhì)細(xì)胞瘤干細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Bcl-xL蛋白的表達(dá)與腫瘤的大小具有相關(guān)性，此外通過(guò)上調(diào)Bcl-xL蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)BH3模擬物敏感。對(duì)于過(guò)表達(dá)的Bcl-xL蛋白是如何影響腫瘤耐藥的?研究發(fā)現(xiàn)在不同的腫瘤中其作用機(jī)制也不相同。在惡性外周神經(jīng)鞘瘤(MPNST)細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，NF1基因表達(dá)下調(diào)時(shí)，Bcl-xL蛋白高表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)抗癌藥物產(chǎn)生耐藥性，表明Bcl-xL蛋白的過(guò)表達(dá)與MPNST細(xì)胞的耐藥性產(chǎn)生相關(guān)[18]。研究[19]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子1 (WT1)與急性髓系白血病細(xì)胞系中Bcl-xL表達(dá)密切相關(guān)，可以直接與Bcl-xL基因的啟動(dòng)子結(jié)合反式激活Bcl-xL基因表達(dá)，而B(niǎo)cl-xL蛋白的過(guò)表達(dá)可以使AML細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的耐藥性增加。王彩梅和李海香[20]研究宮頸癌細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，Bcl-xL蛋白的表達(dá)水平隨miR-417的表達(dá)降低而降低。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Bcl-xL蛋白在該類(lèi)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)由miR-417下調(diào)引起的細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性[20]。研究[21]顯示在尿路上皮癌細(xì)胞中，三氟拉嗪(一種抗精神藥物)可以通過(guò)抑制Bcl-xL蛋白的表達(dá)使其對(duì)順鉑的耐藥性降低，說(shuō)明尿路上皮癌細(xì)胞的耐藥性與Bcl-xL蛋白的表達(dá)具有相關(guān)性。除此之外，我們課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Bcl-xL蛋白的高表達(dá)與卵巢癌的耐藥性相關(guān)。綜上所述，不同腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物產(chǎn)生耐藥性與Bcl-xL蛋白的過(guò)表達(dá)密切相關(guān)，但是其中具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3 Bcl-xL蛋白拮抗劑

雖然Bcl-xL蛋白在腫瘤耐藥中的具體作用機(jī)制還不是很明了，但不少研究者已將Bcl-xL蛋白作為腫瘤耐藥治療的突破口。研究表明，BH3結(jié)構(gòu)域是Bcl-xL蛋白發(fā)揮抗凋亡功能的必要結(jié)構(gòu)，因此針對(duì)BH3結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)與其具有較高親和力和選擇性的活性小分子已成為當(dāng)下癌癥藥物研究的熱點(diǎn)[22]。目前對(duì)Bcl-xL蛋白拮抗劑分子骨架的研究較多，主要有以下三種：第一，由Ryan等[23]運(yùn)用全新藥物設(shè)計(jì)方法研究的具有苯甲酰脲骨架的Bcl-xL拮抗劑，具有很強(qiáng)的靶向性；第二，Tao等[24]研究證明，含有苯丙噻唑骨架的Bcl-xL蛋白拮抗劑，對(duì)慢性淋巴細(xì)胞白血病和非霍奇金淋巴瘤有一定的療效；第三，以磺酰胺為核心骨架的Bcl-xL蛋白拮抗劑，是目前達(dá)到摩爾水平的小分子抑制劑。這三種分子骨架是目前Bcl-xL蛋白拮抗劑研究的三個(gè)不同方向，相信隨著研究的深入，將會(huì)開(kāi)發(fā)出更多的Bcl-xL蛋白拮抗劑。

4 結(jié) 語(yǔ)

腫瘤耐藥是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程。Bcl-xL蛋白作為腫瘤耐藥機(jī)制中的一個(gè)重要靶點(diǎn)，深入研究其在腫瘤耐藥中的作用機(jī)制，對(duì)增強(qiáng)化療藥物的療效有很大的幫助。目前雖已進(jìn)行了大量研究，但依舊處于質(zhì)變前的量變積累階段，大多數(shù)對(duì)腫瘤耐藥中Bcl-xL蛋白作用機(jī)制的研究只是證明了某種影響因子與Bcl-xL蛋白之間存在相互作用，對(duì)于二者之間是如何相互作用的研究很少。因此，更加深入地研究各種影響因子與Bcl-xL蛋白之間的相互作用，闡明Bcl-xL蛋白的作用機(jī)制對(duì)解決腫瘤耐藥問(wèn)題至關(guān)重要。