非編碼RNA 在心肌缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制△

羅長(zhǎng)軍，熊 思，張 敬，孫一帆，蔣 磊，譚 寧

［1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬柳鐵中心醫(yī)院&柳鐵臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科，廣西柳州 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬柳鐵中心醫(yī)院&柳鐵臨床醫(yī)學(xué)院超聲科，廣西柳州 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬柳鐵中心醫(yī)院&柳鐵臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)科，廣西柳州 530021；4.廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣州 510080；5.廣東省心血管病研究所心內(nèi)科廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣州510080］

提要：非編碼RNA 包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNAs），微小RNA（microRNAs，miRNAs）以及環(huán)狀RNA（circular RNA，CircRNA）等，均已被證明會(huì)影響心肌缺血再灌注損傷，同時(shí)，這些非編碼RNA 將有可能成為一個(gè)有吸引力的潛在治療靶點(diǎn)。在此，本文回顧了非編碼RNA 通過(guò)調(diào)控缺血預(yù)處理和缺血后處理影響缺血再灌注損傷的機(jī)制；同時(shí)探討缺血再灌注損傷后非編碼RNA 是如何介導(dǎo)線粒體功能從而影響心肌缺血再灌注損傷，及不同的非編碼RNA 之間如何發(fā)生相互作用從而調(diào)控心肌缺血再灌注損傷。本文將對(duì)上述非編碼RNA 在心肌缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制進(jìn)行歸納，以求在未來(lái)的研究工作中更好地理解非編碼RNA 在心血管疾病進(jìn)展中的功能及機(jī)制。

缺血是指由于動(dòng)脈血流受阻而導(dǎo)致組織供血不足，眾所周知，缺血會(huì)導(dǎo)致組織損傷，但對(duì)缺血所導(dǎo)致的相關(guān)疾病的分子病理學(xué)進(jìn)行深入研究后，人們發(fā)現(xiàn)缺血所導(dǎo)致的損傷并非如此單一，目前有充分證據(jù)支持，除缺血過(guò)程外，缺血后血流再灌注可以意外地促進(jìn)和加重組織損傷及壞死，從而產(chǎn)生了“缺血/再灌注（缺血再灌注）損傷”的概念［1］，這種損傷在對(duì)氧高度依賴的心肌細(xì)胞尤為敏感。在缺血過(guò)程中，無(wú)氧代謝占據(jù)優(yōu)勢(shì)從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)pH 值下降，而作為防止氫離子積聚的保護(hù)機(jī)制，Na+/H+交換泵會(huì)泵出額外的氫離子，而導(dǎo)致鈉離子大量流入［2］。此外，缺血減少了三磷酸腺苷的儲(chǔ)存，導(dǎo)致三磷酸腺苷酶失活，活性鈣釋放減少，同時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制鈣離子的再吸收。這一級(jí)聯(lián)事件導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載的發(fā)生，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡。另一方面，缺血會(huì)引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的暴露，隨后會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致線粒體膜電位崩潰，三磷酸腺苷合成受損。所有這些機(jī)制都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞及組織損傷，其程度取決于血流阻塞的程度和缺血時(shí)間的長(zhǎng)短［3］，而缺血引起的生化系統(tǒng)紊亂可通過(guò)血液供應(yīng)重建后氧氣和其他血液成分的運(yùn)輸而加劇，進(jìn)而引發(fā)一系列事件，使組織損傷加?。?］。在這些機(jī)制發(fā)生的過(guò)程中，非編碼RNA 發(fā)揮著極為關(guān)鍵的作用，其中非編碼RNA 主要包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNAs），微小RNA（microRNAs，miRNAs）以及環(huán)狀RNA（circular RNA，CircRNA），本文將對(duì)上述非編碼RNA 在心肌缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制進(jìn)行歸納，以求在未來(lái)的研究工作中更好地理解非編碼RNA 在心血管疾病進(jìn)展中的功能及機(jī)制。

1 微小RNA 在缺血再灌注損傷中的作用

miRNAs作為一種大小約為18～24個(gè)核苷酸的小調(diào)控轉(zhuǎn)錄物，調(diào)節(jié)與細(xì)胞生命功能、應(yīng)激反應(yīng)、增殖和凋亡等相關(guān)的關(guān)鍵功能［5］。而在缺血再灌注損傷中，miRNAs 的作用主要是通過(guò)介導(dǎo)與壞死、凋亡、炎癥、纖維化和新生血管生成相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)通路［6］。由于缺血再灌注是因?yàn)榻M織供氧量的短暫減少引起的繼發(fā)于急性動(dòng)脈閉塞，隨后迅速恢復(fù)血液流動(dòng)，這會(huì)引發(fā)一連串的心肌細(xì)胞功能損傷和死亡。最初的缺血引起組織缺氧損傷，隨后第二種損傷模式以再灌注后活性氧爆發(fā)為主要特征，同時(shí)伴隨著活性氮和繼發(fā)性炎癥爆發(fā)以及線粒體功能失調(diào)［7-9］。在缺血之前，有幾種潛在的治療方式可通過(guò)靶向miRNA 減少心肌梗死的面積：缺血預(yù)處理（IPC）與遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理（RIC）。缺血預(yù)處理是通過(guò)誘導(dǎo)激發(fā)自身保護(hù)機(jī)制而保護(hù)心臟的一種形式，特指在心肌長(zhǎng)期缺血前進(jìn)行亞損傷性缺血事件發(fā)作，此后，當(dāng)真正發(fā)作缺血性事件時(shí)，心肌細(xì)胞損傷會(huì)因?yàn)樵缙凇邦A(yù)處理”而顯著減弱［10］?，F(xiàn)有研究表明，在體外有兩種主要miRNA 介導(dǎo)缺血預(yù)處理：miRNA-21 和miRNA-451［11］。小鼠和大鼠模型中，miRNAs 被證明具有明顯的心肌保護(hù)及對(duì)抗缺血損傷作用，其中miRNA-451的心臟保護(hù)作用是通過(guò)減少氧化應(yīng)激信號(hào)通路的激活，而miRNA-21 的保護(hù)作用被認(rèn)為是通過(guò)調(diào)節(jié)PDCD4 而介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的減少?gòu)亩Ｗo(hù)心?。?2-13］。

遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理是一種類似于缺血預(yù)處理的心肌保護(hù)，但是在遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理中，亞損傷性缺血事件遠(yuǎn)離心臟本身，因此機(jī)制更為復(fù)雜［14］。目前研究表明，這種機(jī)制包括3 個(gè)步驟：在遠(yuǎn)程缺血點(diǎn)激活信號(hào)通路隨后通過(guò)某種方式影響缺血后心臟［11］。目前還沒(méi)有報(bào)道明確的miRNA可通過(guò)該種方式在缺血部位的表達(dá)從而形成遠(yuǎn)程調(diào)節(jié)。但是，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)心肌組織中有miRNA 可通過(guò)血液循環(huán)的作用作為遠(yuǎn)程缺血預(yù)處的信號(hào)傳感器發(fā)揮作用［15］。學(xué)者Li 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-144 在心肌缺血再灌注后的血漿和心臟中的表達(dá)明顯改變，并發(fā)揮著重要保護(hù)作用，其機(jī)制可能就包含遠(yuǎn)程信號(hào)傳感作用。還有許多其他miRNAs 在動(dòng)物模型中被證明具有不同的心肌缺血后保護(hù)作用，例如，在永久性冠狀動(dòng)脈閉塞模型中，miRNA-21、miRNA-144 或miRNA-126 的改變會(huì)導(dǎo)致梗死面積增加，表明這些miRNAs 的保護(hù)作用［17-19］。

目前，已有報(bào)道證實(shí)miRNAs 可通過(guò)介導(dǎo)葡萄糖缺乏途徑（OGD）從而影響心肌細(xì)胞功能，例如miRNA-132 在心肌細(xì)胞株H9c2 細(xì)胞的糖代謝，而調(diào)控miRNA-132 后可影響葡萄糖缺乏途徑從而誘導(dǎo)這些心肌細(xì)胞的生命活性和凋亡激活。此外，miRNA-132 還能通過(guò)調(diào)節(jié)p21、p27 和p27 的表達(dá)從而阻止G0/G1 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)，達(dá)到減輕葡萄糖缺乏途徑誘導(dǎo)的心肌損傷的目的。此外，F(xiàn)OXO3A 已被證實(shí)為miRNA-132 的直接下游靶基因。綜上所述，miRNA-132 可靶向抑制FOXO3A 從而保護(hù)心肌細(xì)胞在葡萄糖缺乏途徑誘導(dǎo)下的損傷，而葡萄糖缺乏途徑是缺血再灌注損傷的主要通路之一，miRNA-132 有望在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用［20］。

2 長(zhǎng)鏈非編碼RNA 在缺血再灌注損傷中的作用

有證據(jù)表明，調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)可能是LncRNA 抑制細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要機(jī)制［21］，目前已有報(bào)道LncRNAs 參與了調(diào)控心肌缺血再灌注損傷中線粒體分裂［22-23］。例如，CARL（心臟凋亡相關(guān)lncRNA）能靶向干擾miRNA-539 功能，而miRNA-539 自身可干擾prohibitin2 蛋白發(fā)揮關(guān)鍵功能，prohibitin 家族蛋白主要位于線粒體內(nèi)膜，其作用是充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和脂質(zhì)調(diào)節(jié)線粒體代謝的支架［24］，過(guò)表達(dá)心肌組織中prohibitin2 能通過(guò)減少線粒體分裂和細(xì)胞凋亡從而有效抑制大鼠心肌缺血再灌注的梗死范圍。因此，CARL可以通過(guò)干擾miRNA-539 而維持prohibitin2 功能從而減輕缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡［22］。同時(shí)，該團(tuán)隊(duì)還報(bào)道了另一個(gè)線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)lncRNA-MDR，同樣能在缺氧條件下調(diào)控心肌細(xì)胞線粒體的分裂，MDRL 通過(guò)發(fā)揮內(nèi)源性海綿體作用吸附miRNA-361，從而抑制線粒體降解和細(xì)胞凋亡達(dá)到減輕缺氧復(fù)氧的心肌細(xì)胞損傷［23］。另有學(xué)者報(bào)道，最初發(fā)現(xiàn)于腫瘤中的LncRNA-HOTAIR（HOX 反義鏈上的基因間RNA），Li 等［25］發(fā)現(xiàn)抑制它的表達(dá)后可以加劇氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞凋亡，而過(guò)表達(dá)HOTAIR 后則可起到保護(hù)心肌細(xì)胞應(yīng)激損傷的作用，HOTAIR 作用機(jī)制被認(rèn)為與miRNA-125/MMP-2蛋白軸有關(guān)。另一方面，Meng 等［26］學(xué)者還證明了HOTAIR 可以通過(guò)激活細(xì)胞保護(hù)激酶AMPKα 從而抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞凋亡。

在lncRNA 生物學(xué)的主要分子作用機(jī)制中，現(xiàn)有證據(jù)表明其ceRNA 作用（或miRNA 海綿）作為關(guān)鍵作用方式介導(dǎo)心肌缺血再灌注損傷，前文已提及相關(guān)的ceRNA-miR?NA-mRNA 相互作用參與調(diào)節(jié)缺血再灌注心肌細(xì)胞損傷。通常情況下，一個(gè)LncRNA 可拮抗一個(gè)或多個(gè)miRNAs，而miRNAs 則通過(guò)經(jīng)典作用方式抑制下游靶基因的功能，從而促進(jìn)mRNA 降解或阻礙翻譯來(lái)抑制靶基因的表達(dá)達(dá)到調(diào)控細(xì)胞功能的目的［27］。因此，lncRNA 的增加有望增加其靶基因的蛋白質(zhì)表達(dá)，除非在某些特殊情況下miRNA可增強(qiáng)基因表達(dá)。但有趣的是，我們注意到心肌細(xì)胞中的lncRNA 可能影響具有類似生物學(xué)效應(yīng)的多個(gè)靶點(diǎn)（例如MALAT1 和Gas5）［28-29］，在這種情況下，我們推測(cè)最終的細(xì)胞功能狀態(tài)變化會(huì)由其具體影響的不同路徑而決定［30］。另一方面，一些LncRNAs 被證明與兩個(gè)miRNAs 相互作用對(duì)細(xì)胞有沖突的影響（例如H19）。這仍需學(xué)者進(jìn)一步研究其具體功能變化［31-32］。

目前已有一系列體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)明確了LncRNAs 在心肌細(xì)胞缺血再灌注過(guò)程中的功能，這些研究表明，LncRNAs 明確參與缺血再灌注損傷后的細(xì)胞壞死、凋亡、以及自噬，而這些LncRNAs 既可能發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用也可能加重細(xì)胞損傷。值得一提的是LncRNA 的缺血再灌注研究絕大部分均是通過(guò)小動(dòng)物模型進(jìn)行驗(yàn)證，而LncRNA測(cè)序結(jié)果顯示LncRNA 在物種中保守性較差，除了少數(shù)LncRNA，如MALAT1［33］。盡管如此，越來(lái)越多的研究表明LncRNA 的功能不僅僅是由一級(jí)核苷酸序列決定，其二級(jí)結(jié)構(gòu)和時(shí)空表達(dá)模式也極為關(guān)鍵。因此，盡管序列保守性不一定高度一致，但一個(gè)LncRNA可能因?yàn)槠涠?jí)結(jié)構(gòu)和時(shí)空表達(dá)模式類似而在不同物種間發(fā)揮相似的功能［34］。

3 環(huán)狀RNA 在缺血再灌注損傷中的作用

最近發(fā)現(xiàn)一種新穎的circRNA——circRNA-ACR：Au?tophagy Related RircRNA 具有心臟保護(hù)功能［35］，ACR 可通過(guò)與DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員Dnmt3B結(jié)合從而阻斷Dnmt3B介導(dǎo)的Pink1 啟動(dòng)子甲基化。因此，ACR 可避免Pink1 啟動(dòng)子的降解，從而影響FAM65B 的Pink1 依賴性甲基化。Pink1 定位于細(xì)胞質(zhì)，作為線粒體功能的相關(guān)激酶并維持線粒體的穩(wěn)態(tài)［36-37］。更關(guān)鍵的是，Pink1 可通過(guò)磷酸化作用調(diào)控其下游靶基因［38］。在心肌缺血再灌注期間，自噬活性的改變可能會(huì)起到心臟保護(hù)作用，有研究證實(shí)ACRPink1-FAM65B 可通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)而抑制自噬，并為治療心肌缺血再灌注損傷的潛在分子機(jī)制提供了新的線索［39-40］。

研究還報(bào)道了一個(gè)線粒體分裂和凋亡相關(guān)的cir?cRNA-MFACR：Mitochondrial Fission and Apoptosis-Related CircRNA（也稱mm9-circ-016597），miRNA-652-3p 有15 個(gè)疑似結(jié)合位點(diǎn)與其相關(guān)，當(dāng)它被敲除的時(shí)候，海綿體吸附作用消失，miRNA-652-3p 的表達(dá)顯著增加，從而能抑制由核基因MTP18編碼的MTP18（線粒體蛋白，18 kDa）的功能［41］。而線粒體膜蛋白MTP18 在各種物種細(xì)胞的線粒體分裂中發(fā)揮關(guān)鍵作用［42-43］。MFACR 所參與的CircRNAmiRNA-mRNA 級(jí)聯(lián)反應(yīng)能有效減少線粒體分裂和凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞和心臟組織而減輕缺血再灌注損傷。還有一項(xiàng)研究報(bào)道表明，通過(guò)經(jīng)典模型過(guò)氧化氫處理乳鼠心肌細(xì)胞或使小鼠心肌模擬缺血再灌注引起的損傷時(shí)，位于ncx1 基因轉(zhuǎn)錄本所轉(zhuǎn)錄的circRNA-circNCX1 在氧化應(yīng)激期間表達(dá)量顯著增加，而circNCX1 可通過(guò)海綿體吸附作用抑制miRNA-133a-3p 表達(dá)量，從而減弱促進(jìn)細(xì)胞凋亡的核基因CDIP1對(duì)于心肌細(xì)胞缺血再灌注時(shí)的負(fù)性調(diào)控作用，因此，circNCX1-miRNA-133-3p-CDIP1 軸可能在氧化誘導(dǎo)下發(fā)揮重要作用從而調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡［44］。此外，學(xué)者Wang 等［45］最近的一項(xiàng)研究表明，在心肌缺血再灌注損傷中，circRNA DLGAP4 可通過(guò)靶向miRNA-143 來(lái)調(diào)節(jié)BCL2 從而減輕心肌細(xì)胞凋亡。

本綜述回顧了幾種非編碼RNA，主要是miRNA、Ln?cRNA 以及circRNA 在心肌缺血再灌注損傷時(shí)所發(fā)揮的功能及其作用機(jī)制，例如miRNA 主要通過(guò)影響缺血預(yù)處理或缺血后處理的關(guān)鍵通路；LncRNA 主要通過(guò)影響miRNA或直接通過(guò)高級(jí)空間結(jié)構(gòu)作用于mRNA 影響心肌缺血再灌注損傷，且線粒體功能是其主要介導(dǎo)位點(diǎn)；而circRNA則主要通過(guò)miRNA 的海綿體吸附作用從而影響miRNA 下游靶基因發(fā)揮其調(diào)控作用。除了上述的功能及機(jī)制以外，心肌缺血再灌注相關(guān)的非編碼RNA 仍有大量的未知需要我們闡明，而毫無(wú)疑問(wèn)的是，非編碼RNA 對(duì)于減輕心肌缺血再灌注損傷，具有重要的治療靶點(diǎn)潛力，學(xué)者們對(duì)其進(jìn)一步研究有望為該領(lǐng)域新藥研發(fā)打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。