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    抗O型口蹄疫兔化弱毒YNTBa株單克隆抗體的制備及其生物學(xué)特性鑒定

    2021-12-23 13:39:06湯雅淇李珂艾軍嚴(yán)紅亞信愛國
    云南畜牧獸醫(yī) 2021年6期
    關(guān)鍵詞:雜交瘤O型單克隆

    湯雅淇,李珂,艾軍,嚴(yán)紅亞,信愛國*

    (1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650224;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,云南 昆明 650201; 3.昆明海關(guān)技術(shù)中心,云南 昆明 650200)

    口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus, FMDV)引起豬、牛、羊等偶蹄動(dòng)物的急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病傳播速度快、流行范圍廣,病毒可通過接觸易感動(dòng)物和空氣傳播,易感動(dòng)物接觸病毒后2~3d產(chǎn)生臨床癥狀,發(fā)病率為100%,幼畜經(jīng)常不見癥狀而猝死,死亡率因病毒株而異,嚴(yán)重時(shí)可達(dá)100%。FMDV屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)口瘡病毒屬(Aphthovirus)成員,基因組為一長約8 500 bp的單股正鏈RNA分子[1]。FMDV目前已知有7個(gè)不同的血清型(A、O、C、Asia1和南非1、2、3型),在每個(gè)血清型內(nèi)存在多種亞型,不同血清型間無交叉免疫性。目前,O型FMDV存在10個(gè)不同拓?fù)湫?,即中東-南亞 (ME-SA)、東南亞 (SEA)、古典中國拓?fù)湫?CATHAY)、歐洲-南美 (Euro-SA)、印度尼西亞-1(ISA-1)、印度尼西亞-2 (ISA-2)、東非-1 (EA-1)、東非-2 (EA-2)、東非-3 (EA-3)、西非拓?fù)湫?WA)[2]。我國毗鄰的東南亞、南亞地區(qū)O型病毒變異頻繁,存在病原生物多樣性[3,4],區(qū)域內(nèi)FMD流行處于流行毒株多元化時(shí)期,不同血清型、不同遺傳譜系、不同進(jìn)化階段的病毒混雜存在,各自循環(huán),形成了復(fù)雜難解的防控局面[5-7]。

    預(yù)防、控制和消滅FMD是我國獸醫(yī)研究的重大課題,其中研發(fā)口蹄疫的快速診斷、定型技術(shù)具有十分重要的臨床意義。單克隆抗體(monoclone antibody, mAb)能夠識(shí)別單一抗原位點(diǎn),與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)。目前,國內(nèi)諸多具有代表性的研究制備了多種抗口蹄疫病毒的單克隆抗體,用于FMDV診斷定型、抗體水平監(jiān)測、疫苗免疫動(dòng)物與自然感染的鑒別診斷、抗原表位分析等方面[8-14]。

    為建立FMDV檢測方法,本研究用純化的O型兔化弱毒FMDV云南太保株(Yunnan Taibao attenuated strain, YNTBa)作為抗原,制備了1株O型FMDV的特異性mAb,分析了其生物學(xué)特性,為O型FMDV的診斷及其抗原位點(diǎn)研究奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1主要試劑

    HRP-羊抗鼠IgG、FITC-羊抗鼠IgG、弗氏完全和弗氏不完全佐劑、PEG(Mw,1500和6000)、HAT(50×)、HT(50×)選擇培養(yǎng)基均購自Sigma公司;IMDM高糖培養(yǎng)基和優(yōu)質(zhì)胎牛血清(FBS)為GIBCO公司產(chǎn)品;其他化學(xué)試劑均為分析純;免疫球蛋白標(biāo)準(zhǔn)亞類鑒定試劑盒購于RoChe公司。

    1.1.2細(xì)胞、毒株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    BHK-21細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)室凍存;SP2/0骨髓瘤細(xì)胞由昆明海關(guān)動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室提供;BALB/c小鼠購于昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心;O型FMDV兔化弱毒云南太保株(YNTBa)適應(yīng)于BHK-21細(xì)胞備用,由本實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2 方法

    1.2.1FMDV抗原制備

    將YNTBa病毒(毒價(jià)為10-5.6TCID50/0.1 mL)按照MOI=0.01 TCID50劑量接種長滿單層的BHK-21細(xì)胞,于37℃、5% CO2培養(yǎng)16~18h后出現(xiàn)CPE,收集病變細(xì)胞,凍融2次,4℃、9000r/min離心1 h,收取上清用BEI滅活處理;滅活液按照比例加入80g/L PEG-6000和40g/L NaCl,4℃攪拌并放置12h; 次日4℃ 9000r/min 離心90min,回收沉淀,用NTE緩沖液重懸,然后4℃、29000r/min離心2h,棄上清;沉淀用NTE緩沖液浸泡,4℃過夜,次日重懸,充分混合均勻分裝,-70℃凍存?zhèn)溆?。?jīng)PEG-6000沉淀純化病毒,測定蛋白含量,作為小鼠免疫抗原和ELISA包被抗原。

    1.2.2間接ELISA檢測方法的建立

    間接ELISA方法,采用方陣滴定法確定純化YNTBa抗原和抗體的最適工作濃度;用包被液按1∶50倍比稀釋抗原,包被酶標(biāo)板;BALB/c小鼠陽性血清和陰性血清均做倍比稀釋,同時(shí)設(shè)立骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和空白對照;酶標(biāo)二抗工作濃度1∶5000,TMB顯色后置于450 nm處讀取吸光值,P/N值最大的抗原稀釋度為最適濃度。

    1.2.3動(dòng)物免疫

    取純化的YNTBa病毒抗原免疫BALB/c小鼠。首次免疫用弗氏完全佐劑乳化的抗原,按0.5mL/只(含抗原量50μg)皮下多點(diǎn)注射;間隔2周后,第2次免疫,用弗氏不完全佐劑乳化抗原,劑量途徑同上;間隔2周,第3次免疫,不加佐劑,劑量同上,腹腔注射。2周后尾部采血,分離血清,測定免疫小鼠血清抗體水平效價(jià)。取抗體效價(jià)最高的小鼠于融合前3d進(jìn)行加強(qiáng)免疫,腹腔注射純化抗原,劑量100μg/只。

    1.2.4細(xì)胞融合

    加強(qiáng)免疫前1d,取正常BALB/c雌鼠腹腔細(xì)胞,按照常規(guī)方法制備飼養(yǎng)層細(xì)胞。加強(qiáng)免疫3d后,取血清效價(jià)最高的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞按6∶1的比例混合,按照常規(guī)方法進(jìn)行融合后,加入鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板,放置于含5% CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。第2天用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行半數(shù)換液,根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)10d左右完全更換HT培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。雜交瘤細(xì)胞孔適時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)移并擴(kuò)大培養(yǎng),采用間接ELISA和IFA方法檢測抗體,陽性孔適時(shí)進(jìn)行亞克隆,直到獲得分泌穩(wěn)定的特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株[13]。

    1.2.5單克隆抗體腹水的制備及純化

    將0.5mL的滅菌液狀石蠟注射到10~12周齡小鼠腹腔,1周后,按1×106/只小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞,7~10d后,抽取腹部極度膨脹小鼠腹水, 37℃ 2~4h,隨后置4℃過夜,次日10000r/min 離心10min取上清,用ELISA方法檢測效價(jià),再采用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行提純,-70℃分裝保存。

    1.2.6單克隆抗體效價(jià)的測定

    用間接 ELISA 方法測定,細(xì)胞培養(yǎng)上清與腹水分別進(jìn)行倍比稀釋,同時(shí)分別以 SP2/0 細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水做同等稀釋度作為對照。

    1.2.7單克隆抗體亞類鑒定

    按照抗體亞類鑒定試劑盒說明書,對所獲得的單克隆抗體進(jìn)行抗體亞類鑒定。

    1.2.8Western-blot分析

    按照常規(guī)方法,將純化的YNTBa病毒進(jìn)行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印后用含5%脫脂乳的PBS 37℃封閉1h,用TBST充分洗滌后加入1∶1000倍稀釋的腹水單克隆抗體37℃搖床作用10min,4℃過夜,充分洗滌3次后加入1∶5000倍稀釋的HRP-羊抗鼠IgG,37℃作用40min,洗滌3次后用DAB顯色。

    1.2.9單克隆抗體相對親和力測定

    采用NaSCN洗脫法測定mAb的相對親和力,用間隔0.5mol/L連續(xù)濃度的NaSCN分別對腹水上清和SP2/0腹水上清與抗原形成的復(fù)合物進(jìn)行洗脫,測定洗脫后抗體與抗原反應(yīng)的OD450值。當(dāng)OD450值下降到不經(jīng)洗脫時(shí)的50%時(shí),對應(yīng)的NaSCN濃度即為抗體的相對親和力常數(shù),以mol/L表示。

    1.2.10單克隆抗體型特異性鑒定

    采用IFA方法檢測,按本實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行[15]。用O型的YNTBa病毒和A型FMDV毒株感染BHK-21細(xì)胞,同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照,用冰冷無水乙醇固定10min,晾干后加入待檢測雜交瘤細(xì)胞上清。37℃作用40min,PBS洗滌后加入羊抗鼠FITC標(biāo)記的IgG,37℃、40min,PBS洗滌后于熒光顯微鏡下觀察。

    1.2.11單克隆抗體中和特性測定

    按照常規(guī)病毒中和試驗(yàn)進(jìn)行,96孔微量板中加入50μL純化單克隆抗體,進(jìn)行10倍連續(xù)倍比稀釋,每個(gè)稀釋度4孔;上述各孔中加入100 TCID50的YNTBa病毒50μL混合,37℃作用1h, 接種長滿單層BHK-21細(xì)胞的96孔板,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察CPE。同時(shí)設(shè)立陽性、陰性血清對照、病毒對照和正常細(xì)胞對照。

    2 結(jié)果

    2.1 抗原制備及小鼠免疫

    BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)收獲YNTBa病毒,經(jīng)差速離心、PEG-6000沉淀純化抗原,制備獲得病毒抗原。按照免疫程序,經(jīng)3次免疫后的5只BALB/c小鼠間接ELISA測定血清效價(jià)。結(jié)果顯示:5只小鼠血清效價(jià)≥10-4稀釋度中,4號和5號小鼠較其他小鼠高,首選為試驗(yàn)用鼠(圖1)。

    圖1 小鼠血清10-4稀釋抗體效價(jià)

    2.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立

    免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0雜交瘤細(xì)胞按6∶1的比例混合融合,分散于10塊96孔板中培養(yǎng);雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)間接ELISA檢測,當(dāng)雜交瘤細(xì)胞上清對YNTBa抗原與小鼠陰性血清、SP2/0細(xì)胞上清對YNTBa抗原OD值之比均大于2.1,判為陽性雜交瘤細(xì)胞。再經(jīng)篩選及3次有限稀釋法克隆,結(jié)果獲得1株穩(wěn)定分泌抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株,命名為9B3。

    2.3 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清及腹水抗體效價(jià)測定

    采用間接ELISA法測定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水抗體效價(jià),將其分別進(jìn)行倍比稀釋,測定OD450值;同時(shí)設(shè)立陽性、陰性血清對照。檢測樣品與陰性血清的OD450值(P/N)之比大于2.1時(shí)的mAb最大稀釋度確定為其ELISA效價(jià)。結(jié)果顯示:9B3雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)為1∶25 600,腹水效價(jià)為1∶106。

    2.4 單克隆抗體亞類鑒定

    對獲得的9B3單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定,結(jié)果顯示,此9B3單克隆抗體的重鏈類型為IgG2a, 輕鏈類型為κ(圖2)。

    圖2 單抗亞型鑒定圖

    2.5 Western-blot分析

    用純化的YNTBa抗原進(jìn)行SDS-PAGE電泳,在電轉(zhuǎn)印至PDVF膜上進(jìn)行Western-blot分析。結(jié)果顯示:9B3單克隆抗體與O型FMDV YNTBa病毒無特異性條帶,表明該單抗所針對的抗原位點(diǎn)為空間構(gòu)象表位。

    2.6 單克隆抗體的相對親和力

    分別用連續(xù)間隔0.5mol/L的不同濃度NaSCN對單抗9B3和SP2/0腹水進(jìn)行洗脫,經(jīng)測定9B3單克隆抗體的相對親和力指數(shù)為1.0mol/L(圖3),表明9B3單抗具有中等強(qiáng)度的親和力。

    圖 3 單抗9B3的相對親和力指數(shù)測定結(jié)果

    2.7 單克隆抗體血清型特異性鑒定

    將9B3單克隆抗體分別作用于感染O型FMDV YNTBa病毒和A 型FMDV的BHK-21細(xì)胞,進(jìn)行IFA檢測。結(jié)果顯示:9B3對YNTBa可以產(chǎn)生特異性熒光,而與A型FMDV不產(chǎn)生熒光反應(yīng)(圖4)。表明9B3單克隆抗體只針對O型FMDV起反應(yīng),具有病毒型特異性。

    A:感染O型FMDV的BHK-21細(xì)胞與mAb 9B3的反應(yīng)結(jié)果;B:感染A型FMDV的BHK-21細(xì)胞與mAb 9B3的反應(yīng)結(jié)果。

    2.8 單克隆抗體中和特性的檢測

    運(yùn)用微量病毒中和試驗(yàn)鑒定9B3單克隆抗體的中和活性,對照陽性血清中和效價(jià)≥1∶32判為陽性,<1∶32判為陰性。結(jié)果顯示:O型FMDV陽性血清、空白、細(xì)胞和病毒對照均成立,此單克隆抗體中和性>1∶32,表明9B3不具備中和活性。

    3 討論

    試驗(yàn)研究的目的是制備抗O型FMDV的特異性mAb,期望篩選出具有型特異性、識(shí)別譜廣、能夠用于開發(fā)檢測O型FMDV抗體的ELISA試劑盒。單抗制備免疫原O型FMDV兔化弱毒YNTBa病毒,來源于1958年云南保山地區(qū)流行的牛O型FMDV分離株,牛源強(qiáng)毒經(jīng)適應(yīng)3~5日齡乳兔后,連續(xù)傳代480代次以上,對牛源宿主毒力減弱,后再次適應(yīng)BHK-21細(xì)胞[16]。YNTBa毒株全基因序列(GenBank No. KY072818)分析顯示該毒株屬于O型Cathay遺傳進(jìn)化系譜較早的流行毒株[17],與后期流行的O型Cathay系譜毒株的致病宿主與抗原差異明顯[2]。本文選擇制備該毒株單抗,還有用于分析該遺傳系譜毒株遺傳進(jìn)化抗原識(shí)別位點(diǎn)變異加劇趨勢的研究。同時(shí),該毒株具有良好的免疫原性,免疫小鼠能夠獲得高的抗體效價(jià)(圖1),保證免疫小鼠與雜交瘤細(xì)胞融合,獲得陽性分離株。同時(shí),在制備過程中發(fā)現(xiàn),免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞合適的比例融合,也是成功獲得雜交瘤細(xì)胞的關(guān)鍵點(diǎn)。

    試驗(yàn)獲得1株抗O型FMDV的mAb 9B3,IFA試驗(yàn)結(jié)果表明其具有型特異性(圖4),推測其識(shí)別的抗原位點(diǎn)位于FMDV的衣殼蛋白上。但是病毒中和試驗(yàn)表明該單抗不具有中和活性,而且根據(jù)Western-blot結(jié)果分析,9B3結(jié)合的位點(diǎn)屬于空間構(gòu)想表位。FMDV mAb結(jié)合表位的保守性是其作為診斷試劑、選擇合適mAb的重要因素,下一步深入分析FMDV mAb 9B3識(shí)別的抗原位點(diǎn),對于評估其作為廣譜抗原識(shí)別位點(diǎn)、研發(fā)檢測ELISA試劑具有科學(xué)意義。此外,本文尚不能確定該單抗識(shí)別不同O型FMDV遺傳系譜毒株的能力,特別是近年主要流行的SEA、ME-SA(含泛亞-1和泛亞-2)拓?fù)湫偷淖R(shí)別能力,有必要針對不同流行毒株制備不同批次單克隆抗體,研究其識(shí)別的不同免疫優(yōu)勢位點(diǎn),增加基于單抗建立血清學(xué)檢測方法的靈敏度。

    試驗(yàn)制備獲得1株針對O型FMDV的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株9B3;該單抗屬于IgG2a/κ亞類,具有FMDV血清型特異性、不具有病毒中和活性,識(shí)別非線性的抗原表位。該單抗為O型FMDV抗原表位研究及檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

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