不同樣本中巨細(xì)胞病毒DNA載量在艾滋病合并巨細(xì)胞病毒肺炎早期診斷中的作用

鄧佳，李寧沙，陳勇

（長沙市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 長沙 410005）

獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）是人類免疫缺陷病毒（HIV）感染機(jī)體后引起的一種免疫缺陷性疾病。在AIDS病程中，機(jī)體的免疫功能被破壞，諸多病原微生物入侵導(dǎo)致機(jī)會性感染[1]。巨細(xì)胞病毒是艾滋病患者重要的機(jī)會性感染病原體之一，當(dāng)機(jī)體免疫功能下降時，病毒被激活導(dǎo)致顯性感染[2-3]。肺是艾滋病最易累及的器官之一，有研究報(bào)道，在AIDS患者尸檢報(bào)告中，16.7%～73.7%合并肺部巨細(xì)胞病毒感染，在有效的抗病毒治療后，CMV終末器官疾病的發(fā)生率大大降低[4-5]。本研究旨在探討不同樣本中CMV DNA 載量在艾滋病合并CMV肺炎早期診斷中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2010年1月至2017年6月在長沙市公共衛(wèi)生救治中心艾滋病科住院首次診治的AIDS合并CMV肺炎患者（AIDS合并CMV肺炎組，n=41）與單純AIDS患者（單純AIDS 組，n=53）的臨床資料。AIDS 合并 CMV 肺炎組，男 29 例，女 12 例；年齡 21～59 歲，平均年齡（39±10）歲。單純 AIDS 組，男 44 例，女 9 例；年齡 22～60 歲，平均年齡（41±10）歲。兩組臨床資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) AIDS診斷標(biāo)準(zhǔn)：所有患者血液HIV抗體檢測初篩及確證實(shí)驗(yàn)均為陽性，臨床表現(xiàn)及體征符合“艾滋病診療指南（2015）”?；顒有訡MV肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)肺部感染臨床表現(xiàn)，影像學(xué)提示間質(zhì)性肺炎，血液及肺泡灌洗液中檢測CMV DNA 陽性，血清中CMV IgM 陽性。肺組織細(xì)胞學(xué)檢查中含CMV的包涵體，并排除其他病原體感染。

1.3 方法

1.3.1 檢測方法 試劑與儀器：使用ABI7500熒光定量PCR儀檢測PBMC和BALF中CMV DNA載量，人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測試劑盒購自湖南圣湘生物科技有限公司；人外周血單個核細(xì)胞分離液（Ficoll）購自天津?yàn)笊锟萍加邢薰尽?/p>

1.3.2 標(biāo)本采集與處理 所有入組患者外周靜脈采集EDTA-K2 抗凝血2 mL，使用人外周血單個核細(xì)胞分離液（Ficoll）分離PBMC，分離步驟嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。支氣管肺泡灌洗液的獲取由艾滋病科專業(yè)臨床醫(yī)師完成。

1.3.3 熒光定量PCR 根據(jù)待測樣本、陰陽對照以及定量參考品的數(shù)量，按比例取相應(yīng)量的反應(yīng)液、酶混合液及內(nèi)標(biāo)，充分混勻后配成PCR-混合液。在每個PCR反應(yīng)管中分別加入上述處理后的待測樣本、陰陽對照以及定量參考品各10μL，再在每管加入PCR-混合液40 μL，混勻后瞬時離心，放入PCR 擴(kuò)增儀。熒光檢測通道選擇及循環(huán)參數(shù)設(shè)定均嚴(yán)格參照說明書，設(shè)置完畢后運(yùn)行反應(yīng)程序。

1.4 觀察指標(biāo) 比較兩組CMV DNA 陽性率和載量，同時采用 ROC 曲線分析 PBMC 和 BALF 中 CMV DNA 載量對AIDS合并CMV肺炎的早期診斷價值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。檢測結(jié)果呈非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，以中位數(shù)（四分位數(shù)）進(jìn)行表示，兩組間采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney檢驗(yàn)），ROC曲線分析用于評估各指標(biāo)最佳截?cái)嘀?、曲線下面積、敏感度及特異度等，并分析聯(lián)合檢測時性能指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 兩組PBMC 和BALF 中CMV DNA 陽性率和載量比較AIDS 合并CMV 肺炎組中CMV DNA 陽性率高于單純AIDS 組，且 BALF 中 CMV DNA 陽性率高于同組中 PBMC樣本（P＜0.05）。其中 AIDS 合并 CMV 肺炎組 PBMC 中CMV DNA 陽性率為 78.0%（32/41），而 BALF 中 CMV DNA陽性率為 100.0%（41/41）；單純 AIDS 組中 PBMC 中 CMV DNA陽性率為28.3%（15/53）,而BALF中CMV DNA陽性率為 50.9%（27/53）。AIDS 合并 CMV 肺炎組 PBMC 中 CMV DNA 載量為2.19×103（5.31×102，6.77×103）Copies/mL，高于單純AIDS組的0（0，4.23×102）Copies/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-5.047，P＜0.01）；同時，AIDS 合并CMV肺炎組BALF中CMV DNA載量為7.43×104（2.02×104，3.11×105）Copies/mL，高于單純AIDS 組的4.98×102（0，8.63×103）Copies/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-5.515，P＜0.01）。此外，兩種樣本類型中CMV DNA 載量進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示二者呈正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)r值為0.533，見表1。

表1 兩組CMV DNA陽性率和載量比較（）Table 1 Comparison of the CMV DNA positive rate and load between the two groups()

表1 兩組CMV DNA陽性率和載量比較（）Table 1 Comparison of the CMV DNA positive rate and load between the two groups()

注：CMV，巨細(xì)胞病毒；PBMC，外周血單核和細(xì)胞；BALF，支氣管肺泡灌洗液。與單純AIDS組比較，aP＜0.01

組別AIDS 合并CMV肺炎組單純AIDS組BALF 7.43×104（2.02×104，3.11×105）a 4.98×102（0，8.63×103）例數(shù)41 53 CMV DNA陽性率（%）PBMC 78.0 28.3 BALF 100.0 50.9 CMV DNA載量（Copies/mL）PBMC 2.19×103（5.31×102，6.77×103）a 0（0，4.23×102）

2.2 ROC 曲線分析兩種樣本的診斷價值 ROC 曲線分析顯示，PBMC 的曲線下面積（AUC）為0.899，最佳診斷界值為4.27×102Copies/mL，診斷靈敏度為80.8%，特異度為88.5%；樣本為 BALF 時，AUC 為 0.945，最佳診斷界值為1.62×104Copies/mL，診斷靈敏度為92.3%，特異度為81.2%。PBMC與BALF聯(lián)合檢測結(jié)果顯示，AUC為0.963，診斷靈敏度為96.2%，特異度為92.3%，見圖1。

圖1 ROC曲線Figure 1 ROC curve

3 討論

巨細(xì)胞病毒是人類病毒性肺炎的常見病原體之一，可通過胎盤、接觸、飛沫、性交或器官移植等途徑感染[6-7]。目前診斷CMV肺炎依據(jù)主要包括病理學(xué)發(fā)現(xiàn)CMV包涵體、病毒培養(yǎng)、CMV DNA檢測以及血清CMV抗體檢測等。Tan SK等[8]發(fā)起一項(xiàng)成人CMV 肺炎的臨床研究發(fā)現(xiàn)，在分別使用CMV PCR、CMV 快速培養(yǎng)和傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測BALF CMV 時，CMV PCR 較病毒培養(yǎng)具有更高的敏感度和陰性預(yù)測值，由于PCR檢測具有較高的敏感度，故即使結(jié)果為陰性，仍有診斷價值，可基本排除病毒感染。Honda J 等[9]開展了一項(xiàng)對363例CMV肺炎患者的回顧性研究，所有患者共采集了317份痰標(biāo)本、94 份 BALF 標(biāo)本、291 份血標(biāo)本及 180 份尿標(biāo)本。所有樣本采用PCR 檢測CMV DNA，其陽性率BALF 為10.6%、尿液為7.8%、痰液為6.9%和血液為4.1%。應(yīng)用肺組織病理學(xué)檢測CMV 包涵體的方法診斷CMV 肺炎34 例，陽性率為9.4%。表明BALF有較高的CMV DNA陽性率，故通過檢測BALF中CMV DNA的診斷CMV肺炎，具有快速，安全，特異性和陽性率高等優(yōu)點(diǎn)。

在AIDS 的病程中，患者免疫力被逐步破壞，CMV 激活導(dǎo)致肺炎的發(fā)生，由于臨床表現(xiàn)缺乏特異性，無明顯前驅(qū)癥狀，增加了疾病診斷的難度，故早期診斷艾滋病并發(fā)CMV肺炎對改善患者預(yù)后具有重大意義[10]。謝周華等[11]對6例艾滋病合并巨細(xì)胞病毒肺炎患者進(jìn)行臨床特點(diǎn)、各項(xiàng)檢驗(yàn)與影像學(xué)指標(biāo)以及治療與預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，6例患者臨床表現(xiàn)及影像學(xué)檢查無明顯特異性，血清學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，CMV-IgM 陽性僅3例，CMV-PP65抗原檢測陽性僅2例，最終結(jié)局為發(fā)展到后期6例患者均出現(xiàn)呼吸衰竭而死亡。賈春輝等[12]通過對48 例艾滋病合并巨細(xì)胞病毒感染患者的臨床表現(xiàn)以及免疫功能分析發(fā)現(xiàn)，CMV 感染多發(fā)生于晚期AIDS 患者，可導(dǎo)致AIDS 患者T 淋巴細(xì)胞亞群發(fā)生異常，如異常激活、比例倒置等，最終引起多器官、多系統(tǒng)病變，嚴(yán)重威脅AIDS 患者的生命安全，因此，需早期篩查CMV 感染指標(biāo)以協(xié)助臨床早期診療。

綜上所述，對于 AIDS 合并 CMV 肺炎患者，PBMC 和BALF 中CMV DNA 載量的檢測相當(dāng)關(guān)鍵，結(jié)果無論陽性與否均具有診斷價值。聯(lián)合檢測PBMC 和BALF 中CMV DNA載量的診斷價值優(yōu)于單項(xiàng)檢測，可顯著提高AIDS合并CMV肺炎患者的早期確診率，為臨床及時使用抗病毒藥物，改善AIDS合并CMV肺炎患者的預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。