海洋產(chǎn)蛋白酶Bacillus amyloliquefaciens MSP05發(fā)酵南美白對蝦蝦殼脫蛋白條件優(yōu)化

武波飛，丁志雯，蘇永成，楊光，侯曉月，房耀維,2，劉姝,2*

(1.江蘇海洋大學 食品科學與工程學院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222000)

南美白對蝦又稱白腳蝦(Penaeusvannamei)，是對蝦科、對蝦屬蝦類，是迄今世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大優(yōu)良蝦種之一[1]。南美白對蝦蛋白質含量較高，富含氨基酸、維生素和礦物質元素，蝦肉中多不飽和脂肪酸(EPA和DHA)含量豐富，具有一定的保健功能[2]。南美白對蝦蝦殼比較柔軟，蝦肉、蝦殼容易剝離，質地松軟[3]。我國南美白對蝦淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量為67.12萬噸，海水養(yǎng)殖產(chǎn)量為114.44萬噸，占甲殼類水產(chǎn)品養(yǎng)殖總產(chǎn)量的32%[4]。蝦肉富含蛋白質和18種氨基酸，其中必需氨基酸占氨基酸總數(shù)的38.78%，是一種營養(yǎng)均衡的優(yōu)質蛋白來源[5-6]。目前，南美白對蝦出口數(shù)量越來越大，會產(chǎn)生大量的蝦殼及蝦頭廢棄物，這部分約占蝦總量的30%～40%[7]。以干基計，這些廢棄物蝦殼中占5.21%的蛋白質、5.32%的礦物質、6.77%的幾丁質和1.29%的脂肪[8]。這些廢棄物不僅造成了營養(yǎng)物質的浪費，而且造成了環(huán)境污染，導致水環(huán)境的富營養(yǎng)化。如果能對這些廢棄物進行開發(fā)利用，則可變廢為寶，既解決了環(huán)境污染，又帶來了經(jīng)濟效益。

幾丁質(chitin)，又稱殼多糖、甲殼素，是自然界中唯一的天然堿性多糖，無毒性、無刺激性、無免疫抗原性，廣泛應用于醫(yī)藥、化工和保健食品等領域[9]。幾丁質的溶解性較差，經(jīng)脫除乙?；_到55%以上后形成殼聚糖。殼聚糖的溶解性能好，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤等多種生物活性，并能進行化學修飾反應。因此，殼聚糖被認為是極具應用潛力的功能性生物材料，廣泛應用于食品、輕工、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、美容等領域[10]。

由蝦殼制備幾丁質最關鍵的步驟之一是脫蛋白。傳統(tǒng)的脫蛋白方法是濃堿法。該方法對幾丁質的結構有一定的破壞，耗能高，其中的蛋白、碳酸鈣和其余礦物質均作為廢棄物排放，會對環(huán)境產(chǎn)生嚴重污染。運用添加蛋白酶水解的方式脫蛋白可以大大降低環(huán)境污染，減少能耗，但是成本較高[11]。運用產(chǎn)蛋白酶微生物對蝦蟹殼進行發(fā)酵脫蛋白綠色環(huán)保，水解產(chǎn)物用回收利用且成本較低，成為極具潛力的蝦蟹殼脫蛋白方式[12-13]。本課題組從海洋樣品中篩選獲得了產(chǎn)耐有機溶劑蛋白酶菌株B.amyloliquefaciensMSP05[14]。本研究利用B.amyloliquefaciensMSP05發(fā)酵南美白對蝦蝦殼脫蛋白，對發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

1 材料

1.1 材料與試劑

南美白對蝦蝦殼：青島康鏡海洋生物科技有限公司；發(fā)酵菌種：B.amyloliquefaciensMSP05菌，于實驗室-80 ℃保藏；酵母粉、蛋白胨：美國OXOID公司；可溶性淀粉、MnSO4、FeSO4、MgSO4、Tween-20、NaH2PO4、K2HPO4：南京化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

MC型電子天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司；FE20型pH計 上海梅特勒-托利多有限公司；JJ-2型組織搗碎勻漿機 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；JXN-26型高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蝦殼預處理

將蝦殼在100 ℃烘干至恒重，使用組織搗碎機破碎，過篩40目粒徑的蝦殼。

1.3.2 菌種活化

在無菌條件下，從斜面接種至LB液體培養(yǎng)基，在37 ℃以180 r/min培養(yǎng)至OD600為0.8后作為種子液。按4%接種量將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，對發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

1.3.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂2 g/L，pH 7.2～7.4，在121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：液體LB培養(yǎng)基。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉14.06 g/L，蛋白胨16.28 g/L，酵母膏2.5 g/L，MnSO40.1 g/L，Tween-20 0.1 g/L，NaH2PO43.46 g/L，K2HPO41 g/L，F(xiàn)eSO40.1 g/L，MgSO40.1 g/L，蝦殼處理物10%，pH 6.7，在121 ℃滅菌20 min。

1.3.4 南美白對蝦蝦殼蛋白質的測定

參照國標GB 5009.5-2016《食品中蛋白質的測定》。

1.3.5 南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的測定

稱取20 g南美白對蝦蝦殼，用200 mL 6% NaOH溶液煮沸1 h，用紗布過濾，將濾渣水洗至中性，用5%的HCl溶液浸泡24 h，每4 h攪拌一次，紗布過濾，將濾渣水洗至中性后烘干，測定蛋白質含量，計算脫蛋白率[15]。

蛋白質去除率(%)=(原料中總蛋白質量-濾渣中蛋白質量)/原料中總蛋白質量×100。

1.3.6 發(fā)酵條件對產(chǎn)蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05發(fā)酵南美白對蝦蝦殼脫蛋白的影響

發(fā)酵時間60 h，發(fā)酵轉速200 r/min，初始pH 6.7，發(fā)酵溫度37 ℃，裝液量20%，接種量4%，蝦殼處理物10%。依次對發(fā)酵時間(0，12，24，36，48，60，72 h)、發(fā)酵轉速(160，180，200，220 r/min)、初始pH值(6.3，6.5，6.7，6.9，7.1)、發(fā)酵溫度(35，37，39，41 ℃)、裝液量(10%、20%、30%、40%、50%、60%)、接種量(0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%)進行單因素試驗，以脫蛋白率為指標，探討蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05發(fā)酵南美白對蝦殼脫蛋白的影響。

1.3.7 響應面優(yōu)化產(chǎn)蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05發(fā)酵南美白對蝦蝦殼脫蛋白條件

根據(jù)單因素結果，選擇對發(fā)酵脫蛋白影響最顯著的轉速、溫度和裝液量為因素，以脫蛋白率高低為響應值，運用Design Expert 11設計3因素3水平共17個Box-Behnken響應面分析試驗[16]。在最佳條件下對響應面分析結果進行驗證，測定脫蛋白率。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)均為重復3次試驗后的平均值，響應值試驗結果采用Design Expert 11軟件進行分析處理，數(shù)據(jù)繪圖采用Origin 2018軟件。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵條件對B. amyloliquefaciens MSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響

2.1.1 發(fā)酵時間對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響

發(fā)酵時間對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵時間對B. amyloliquefaciens MSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響Fig.1 Effect of fermentation time on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

由圖1可知，脫蛋白率隨著發(fā)酵時間的延長而不斷增加，在菌株發(fā)酵培養(yǎng)48 h時，脫蛋白率達到最高值91.94%，之后隨著發(fā)酵時間的延長，脫蛋白率下降。隨著反應的進行，培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質及生長因子不斷地消耗，菌株產(chǎn)蛋白酶水平下降[17]。

2.1.2 發(fā)酵轉速對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響

由圖2可知，轉速為200 r/min時脫蛋白率最高，為94.99%，轉速在160～200 r/min之間，隨著轉速的增加，蛋白酶活力增大，說明轉速增大，溶氧增大，有利于產(chǎn)酶；當轉速大于200 r/min時，蛋白酶活力不再升高反而有所下降，可能是轉速繼續(xù)增大，剪切力會導致蛋白酶失活[18]。

圖2 發(fā)酵轉速對發(fā)酵時間對B. amyloliquefaciens MSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響Fig.2 Effect of rotating speed on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

2.1.3 初始pH對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響

發(fā)酵初始pH對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響見圖3。

圖3 初始pH對B. amyloliquefaciens MSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響Fig.3 Effect of initial pH value on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

由圖3可知，隨著初始pH的升高，脫蛋白率先升高后下降，在初始pH值為6.7時最高，脫蛋白率為91.65%。pH影響酶的活性和穩(wěn)定性，從而影響脫蛋白效率[19]。

2.1.4 發(fā)酵溫度對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響

由圖4可知，在39 ℃時脫蛋白率達到最高95.49%，當溫度超過39 ℃時，脫蛋白率持續(xù)下降。溫度影響微生物發(fā)酵產(chǎn)酶水平，也影響酶活性，從而影響蛋白脫除率[20]。

圖4 發(fā)酵溫度對B. amyloliquefaciens MSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

續(xù) 表

2.1.5 裝液量對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響

裝液量對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響結果見圖5。

圖5 裝液量對B. amyloliquefaciens MSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響Fig.5 Effect of liquid loading volume on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

由圖5可知，當搖瓶的裝液量為20%時，脫蛋白率達到最高值，為90.75%。裝液量與發(fā)酵液溶氧相關，裝液量過高，溶氧偏低，導致菌株生長變緩，發(fā)酵產(chǎn)酶水平降低。

2.1.6 接種量對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響

由圖6可知，接種量的大小影響脫蛋白的效率。接種量為4%時，脫蛋白率達到最高值90.35%。進一步增加接種量，脫蛋白率不再顯著增加。接種量過小會導致菌株延滯期變長、發(fā)酵產(chǎn)酶水平低?？紤]到成本問題，選擇4%為最佳接種量。

圖6 接種量對B. amyloliquefaciens MSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響Fig.6 Effect of inoculation amount on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

2.2 響應面優(yōu)化產(chǎn)蛋白酶B. amyloliquefaciens MSP05發(fā)酵南美白對蝦蝦殼脫蛋白

2.2.1 響應面試驗設計

以發(fā)酵轉速B(r/min)、溫度(℃)和裝液量(%)為顯著影響因素，見表1。運用Design Expert 11設計三因素三水平共17個試驗點的Box-Behnken進行組合優(yōu)化，其中包括5個最優(yōu)試驗點，試驗結果見表2。

表1 響應面優(yōu)化法各因素和水平設計Table 1 The factors and levels of response surface experiment

表2 響應面試驗設計結果Table 2 The response surface experiment design and results

利用Design Expert 11軟件對表3中的數(shù)據(jù)進行分析處理，得到以Y為因變量，發(fā)酵轉速、溫度和裝液量為自變量的二次多項式方程：Y=93.89+2A-2.4B+0.4775C+0.1075AB-3.57AC+3.92BC-0.1278A2-3.04B2-8.92C2。

使用Design Expert進一步對擬合出的回歸方程進行誤差統(tǒng)計分析，對方差和多元相關系數(shù)進行計算，對此模型進行方差分析及顯著性變化，結果見表3。

表3 回歸模型方差分析和系數(shù)顯著性檢驗Table 3 The variance analysis and coefficient significance test of regression model

由表3可知，回歸模型的P值為0.0001，顯著性分析(P<0.01)為極顯著；失擬項的P值為0.8511>0.05，說明模型的擬合程度良好，影響擬合的因素對試驗結果干擾很小[21]。A、B、AC、BC、B2和C2對脫蛋白效果的影響極顯著。方程的決定系數(shù)R2=0.9760>0.9，表明產(chǎn)蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05發(fā)酵南美白對蝦殼脫蛋白率預測結果具有一致性，模型相關度好。試驗模型的校正系數(shù)RAdj2=0.9450，表明模型的擬合程度較高[22]，說明有94.5%的試驗結果可以用此模型來解釋，因此結果可靠，模型可以對產(chǎn)蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05發(fā)酵南美白對蝦殼脫蛋白率值進行分析和預測，由回歸方程式中一次項系數(shù)可知，各因素對產(chǎn)蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05發(fā)酵南美白對蝦蝦殼脫蛋白率作用大小順序為：溫度(B)>轉速(A)>裝液量(C)。

2.2.2 響應面分析與條件優(yōu)化

響應曲面的形狀反映各因素間的交互作用的顯著性，響應曲面越陡峭，表明該因素對試驗結果的影響越顯著，曲面頂點為交互因素最佳取值的試驗結果[23-24]。由圖7可知，溫度與轉速、轉速與裝液量以及裝液量與溫度交互作用的顯著性與表3中交互項P值的分析結果一致，(a)，(c)，(e)均呈橢圓形，表明因素間的交互作用顯著，等高線的形狀可以判斷交互作用的強弱，3組等高線圖中轉速和溫度作用最好，等高線中的曲面圍繞著響應面在中間處形成頂點，即脫蛋白率最大值，a，c，e響應面圖開口朝下，隨著每個因素的增加而響應值減小，響應面的頂點即為最大響應值。

(a)

2.2.3 響應面優(yōu)化驗證試驗

利用Design Expert 11軟件得到脫蛋白的最佳發(fā)酵工藝：轉速200.5 r/min、溫度38.5 ℃、裝液量19.5%。為方便實際操作，將最佳工藝條件設為：轉速200 r/min、溫度39 ℃、裝液量20%。在此條件下做3次試驗，脫蛋白率達95.40%±0.014%，接近理論預測值96.47%。

2.2.4 熱堿法脫南美白對蝦蝦殼蛋白

利用熱堿法脫除南美白對蝦蝦殼蛋白，脫蛋白率達到 97.8%±2.1%，高于最佳條件下發(fā)酵法脫除南美白對蝦蝦殼蛋白率。但是熱堿法能耗高，排出大量污染廢水，污染環(huán)境。另外，強酸、強堿對幾丁質的分子結構有一定的破壞[25]。因此，本研究優(yōu)化獲得的發(fā)酵法脫除南美白對蝦蝦殼蛋白綠色環(huán)保、能耗較低，具有工業(yè)應用潛力。

3 結論

以 南美白對蝦蝦殼為原料，采用產(chǎn)蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05通過發(fā)酵南美白對蝦蝦殼脫蛋白，以脫蛋白率為考察指標，脫蛋白率為80.28%。在單因素優(yōu)化的基礎上，通過Box-Behnken試驗設計和響應面分析，最終獲得最佳發(fā)酵脫蛋白參數(shù)為：轉速200 r/min、溫度39 ℃、裝液量20%。在此條件下得到的脫蛋白率為96.47%，較優(yōu)化前提高了16.7%。