基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的“陳皮-半夏”藥對治療冠脈微循環(huán)障礙的作用機制研究

金頌峰，宮麗鴻，邸靜鑫

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，遼寧沈陽 110034；2. 遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧沈陽 110032；3. 遼寧中醫(yī)藥大學杏林學院，遼寧沈陽 110016）

近年來，約40%的患者由于急性冠脈綜合征入院，但其冠脈造影結(jié)果未見明顯異常，這就與先前心外膜冠狀動脈無狹窄便認為不存在缺血的觀點不相吻合，說明此時可能存在著冠脈微循環(huán)障礙（coronary microvascular dysfunction，CMD）［1］。冠脈微循環(huán)（coronary microvascular）由微動脈（＜300 μm）、毛細血管（平均8 μm）和微靜脈（＜500 μm）構(gòu)成，是心肌組織發(fā)生營養(yǎng)交換、維持心臟各生理功能的重要場所［2］。在各種致病因素的作用下，冠脈微循環(huán)的固有結(jié)構(gòu)、功能以及冠脈微血管的阻力出現(xiàn)異常，引發(fā)心肌細胞灌注不足，導(dǎo)致以心肌缺血為主要癥狀的冠脈微循環(huán)障礙的發(fā)生［3］。CMD 涉及患者人群廣泛，其發(fā)病可增加心血管相關(guān)不良事件的發(fā)生風險，引起急性心血管事件甚至死亡的發(fā)生。

隨著中醫(yī)藥治療CMD 的研究日益深入，迫切需要從多成分、多靶點、多途徑的角度來解釋中醫(yī)藥是如何發(fā)揮的治療作用?！瓣惼?半夏”作為治療心系疾病中藥復(fù)方的核心組成與經(jīng)典藥對，二者常相須為用，可有效改善CMD 的癥狀，在臨床應(yīng)用非常廣泛［4］。正如《太平惠民和劑局方》中的二陳湯，可以充分體現(xiàn)二藥合用之功效。陳皮（Citri Reticulatae Pericarpium）為蕓香科植物橘（Citrus reticulata）及其栽培變種的干燥成熟果皮，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效［5］。研究顯示［6］，陳皮的主要有效成分為黃酮類化合物，其具有調(diào)血脂、抗血栓、抗動脈粥樣硬化、心腦保護等作用，患者對該化合物的攝入可有效改善心血管疾病。半夏（Pinellia ternata（Thunb.）Breit.）為天南星科植物半夏的干燥塊莖，具有燥濕化痰、寬胸散結(jié)之功效，可抗炎、抗血栓、抗心律失常和抗氧化等功效［7］。目前，“陳皮-半夏”藥對治療CMD 的藥效機制尚不明了，故有待進一步探析。

網(wǎng)絡(luò)藥理學作為一門整合了生物信息學、計算機技術(shù)、藥理學等眾多學科的新興學科，能夠從系統(tǒng)層面揭示各類藥物對機體的調(diào)控作用，在推進中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的方面發(fā)揮了至關(guān)重要的作用［8］。因此，本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，探析“陳皮-半夏”藥對治療冠脈微循環(huán)障礙的主要活性成分、主要靶點基因、關(guān)鍵通路及其作用機制，為后續(xù)相關(guān)實驗研究提供依據(jù)與思路。

1 資料與方法

1.1 收集篩選藥對活性成分

以“陳皮”、“半夏”為關(guān)鍵詞在中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺［9］（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索兩味中藥的所有化學成分。為更好地篩選藥對中的有效化合物，本研究聯(lián)合口服利用度（Oral bioavailability，OB 值）、類藥性（Drug-like，DL值）對“陳皮-半夏”藥對活性成分進行ADME 屬性篩選，基于以往研究［10］將OB≥30%、DL≥0.18 作為為篩選藥對主要活性成分的標準。其中OB 值代表生物口服利用度，能夠反映藥物被機體吸收進入循環(huán)的百分比；DL 值代表類藥性，能夠反映化合物中特定的功能基團與大多數(shù)藥物相同或相似的物理特征。

1.2 收集篩選藥對作用靶點

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中收集并篩選出藥對的活性分子及相對應(yīng)的蛋白靶點后，利用最新版的UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），查詢靶點蛋白對應(yīng)的人類基因名稱，進行名稱標準化處理后錄入Excel 表格。使用Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建“藥對活性成分-有效靶點”網(wǎng)絡(luò)。

1.3 收集篩選疾病靶點基因

以“Coronary microvascular dysfunction”、“CMD”為關(guān)鍵詞分別在使用人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，http：//www.genecards.org/）和在線人類孟德爾遺傳基因數(shù)據(jù)庫（OMIM，https：//omim.org/）進行搜索，查找與冠脈微循環(huán)障礙相關(guān)的疾病靶基因，合并2 個數(shù)據(jù)庫的搜索結(jié)果，去除重復(fù)和假陽性的基因，獲得疾病靶點基因。計算其Relevance score 中位數(shù)為3.44，以Relevance score＞3.44 作為疾病靶點篩選的標準。

1.4 獲取藥對與疾病的共同靶點

將1.2 得到的“陳皮-半夏”藥對靶點基因與1.3得到的冠脈微循環(huán)障礙靶點基因輸入在線韋恩圖平臺（http//bioinfogp. cnb. csic. es/tools/venny/index.html）獲得“陳皮-半夏”藥對與CMD 的交集靶點基因，繪制韋恩圖。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

將1.4 得到的交集靶點基因上傳至String 平臺［11］（https：//string-db.org/），物種設(shè)置為人類“Homo sapiens”，其他參數(shù)設(shè)為默認值，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，下載其數(shù)據(jù)與初步的PPI 蛋白互作關(guān)系圖。為進一步篩選核心靶點基因，將下載的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件中，設(shè)置節(jié)點大小、顏色來反映連接度值（Degree），再次構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)Degree 值篩選核心靶點基因。

1.6 GO 功能、KEGG 通路富集分析

將1.4 得到的交集靶點基因?qū)隓AVID 數(shù)據(jù)庫中（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp），校訂物種信息為人類，設(shè)置P＜0.01 后，對其進行GO（gene ontology）生物學過程富集分析［包括：細胞組成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）］和KEGG 代謝通路（KEGG pathway analysis）富集分析，按P 值升序排列，各選擇前20 條分析結(jié)果，使用在線繪圖工具Bioinformatics 平臺（http//http：//www.bioinformatics.com.cn/）分別繪制對應(yīng)的高級氣泡圖。

1.7 構(gòu)建“藥對活性成分-疾病靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)

在Cytoscape3.7.1 中導(dǎo)入“陳皮-半夏”藥對活性成分、關(guān)鍵靶點基因、前20 條KEGG 富集通路，繪制“藥對活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分及靶點篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中初步收集到179 個“陳皮-半夏”藥對活性成分，其中陳皮63 個、半夏116個。本研究以O(shè)B 值≥30%、DL 值≥0.18 為為篩選藥對主要活性成分的標準，篩選后得到陳皮活性成分5 種，半夏11 種，共計納入“陳皮-半夏”藥對活性成分16 種，成分信息見表1。

表1 “陳皮-半夏”藥對活性成分Tab 1 Active components of Chenpi-Banxia drug pair

將預(yù)測得到的靶點基因去重后，獲得陳皮活性成分作用靶點69 個，半夏128 個，合并去重處理后，共計得到“陳皮-半夏”藥對活性成分潛在作用靶點105 個，“藥對活性成分-有效靶點”網(wǎng)絡(luò)圖見圖1。

圖1 “藥對活性成分-有效靶點”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Network diagram of active components-effective targets

2.2 CMD 疾病靶點及藥對與疾病交集靶點的獲取

合并Genecards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果，去重后共收集到CMD 疾病靶點1 483 個，考慮靶點基因過多，按Relevance Score 分數(shù)由高到低進行排序，篩選大于其中位數(shù)的靶點后，獲742 個靶點。在Venny 平臺中將篩選出的“陳皮-半夏”藥對活性成分靶點與CMD 疾病靶點取交集，得到56 個交集靶點基因，見圖2。

圖2 “陳皮-半夏”-CMD 交集基因韋恩圖Fig 2 Venny map of intersection target genes of Chenpi-Banxia-CMD

2.3 “陳皮-半夏”藥對治療CMD 的關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

在String 平臺上傳56 個交集靶點基因，下載其數(shù)據(jù)與初步的PPI 蛋白互作關(guān)系圖，見圖3。為篩選核心靶點基因，將下載的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1，繪制高級PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。該PPI 網(wǎng)絡(luò)由56 個節(jié)點和556 條邊構(gòu)成，節(jié)點越大，顏色越深，連線越密集，則地位越重要。節(jié)點度值前5 的靶點為AKT1、VEGFA、BCL2、BAX、JUN，分別對應(yīng)45、41、38、37、37，提示這些靶點可能是“陳皮-半夏”藥對治療CMD 的關(guān)鍵核心靶點。

圖3 “陳皮-半夏”藥對與CMD 的初步PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Preliminary PPI network diagram of Chenpi-Banxia drug pair and CMD

圖4 ”陳皮-半夏”藥對與CMD 的高級PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 Advanced PPI network diagram of Chenpi-Banxia drug pair and CMD

2.4 GO 功能和KEGG 通路富集分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫對“陳皮-半夏”藥對活性成分治療CMD 的關(guān)鍵靶點進行GO 功能和KEGG 通路富集分析，共有409 個GO 術(shù)語條目，其中細胞組成（CC）41 個，分子功能（MF）67 個，生物過程（BP）301 個，KEGG 富集顯示106 條通路。按P 值排序后，取前20 條通過Bioinformatics 網(wǎng)站繪制高級氣泡圖，見圖5～8。

GO 功能富集分析結(jié)果顯示，細胞組成（CC）主要集中于胞漿（cytosol）、質(zhì)膜（plasma membrane）、核（nucleus）等部位，見圖5；分子功能（MF）主要集中于蛋白質(zhì)結(jié)合（protein binding）、蛋白質(zhì)同源二聚活性（protein homodimerization activity）、相同蛋白結(jié)合（identical protein binding）等方面，見圖6；生物過程（BP）主要集中于轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、DNA 模板化（positive regulation of transcription，DNA-templated）、凋亡過程的負調(diào)控（negative regulation of apoptotic process）、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控（positive regulation of protein phosphorylation）等方面，見圖7。

圖5 “陳皮-半夏”藥對治療CMD 關(guān)鍵靶點的GO-CC 分析Fig 5 GO-CC bubble diagram of Chenpi-Banxia drug pair in the treatment of CMD key targets

圖6 “陳皮-半夏”藥對治療CMD 關(guān)鍵靶點的GO-MF 分析Fig 6 GO-MF bubble diagram of Chenpi-Banxia drug pair in the treatment of CMD key targets

圖7 “陳皮-半夏”藥對治療CMD 關(guān)鍵靶點的GO-BP 分析Fig 7 GO-BP bubble diagram of Chenpi-Banxia drug pair in the treatment of CMD key targets

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，PI3K-Akt 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌癥蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer）、癌癥通路（Pathways in cancer）、鞘脂信號通路（Sphingolipid signaling pathway）、低氧細胞應(yīng)激信號通路（HIF-1 signaling pathway）等20 條關(guān)鍵通路與“陳皮-半夏”藥對治療CMD 可能相關(guān)，見圖8。根據(jù)以上KEGG 通路富集結(jié)果，并結(jié)合文獻查閱，篩選出與CMD 相關(guān)的通路，涉及PI3K-Akt、TNF、VEGF、Apoptosis、HIF-1等信號通路。

圖8 “陳皮-半夏”藥對治療CMD 關(guān)鍵靶點的KEGG 通路富集分析Fig 8 KEGG bubble diagram of Chenpi-Banxia drug pair in the treatment of CMD key targets

2.5 “藥對活性成分-疾病靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

將“陳皮-半夏”藥對活性成分、關(guān)鍵靶點基因、前20 條KEGG 富集通路導(dǎo)入Cytoscape3.7.1，繪制“藥對活性成分-疾病靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖9。其中粉色V 形節(jié)點代表通路，紅色與綠色圓形節(jié)點分別代表兩種藥物活性成分，紫色菱形節(jié)點代表關(guān)鍵靶點基因，對應(yīng)標記見表1。該網(wǎng)絡(luò)圖反映出“陳皮-半夏”藥對治療CMD“多成分、多靶點、多通路”的調(diào)控特點。

圖9 “藥對活性成分-疾病靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 9 Active ingredients-disease target-pathway network diagram

3 討論

自20 世紀中期以來，生理學家已經(jīng)認識到冠脈微循環(huán)對于維持心肌灌注具有重要意義［12］，因此對冠脈微循環(huán)障礙的研究顯得尤為重要。冠脈微循環(huán)障礙（CMD）主要指冠脈微循環(huán)血管的結(jié)構(gòu)、形態(tài)、功能障礙，從而導(dǎo)致微血流異常及血液流變性紊亂［13］。目前的硏究認為，CMD 與介入后無復(fù)流、慢血流、微血栓形成、心肌缺血再灌注損傷等有關(guān)［14］。根據(jù)CMD 的臨床表現(xiàn)，可將其歸屬為中醫(yī)學的“胸痹”范疇?，F(xiàn)代人嗜食肥甘，導(dǎo)致脾氣虛弱，健運失施，水濕內(nèi)阻，聚濕生痰。痰凝可致血瘀，二者膠結(jié)而生內(nèi)熱，進而熱盛風動，導(dǎo)致脈絡(luò)絀急，這就與CMD 血管栓塞痙攣的發(fā)病機制相似［15］?！瓣惼?半夏”作為祛濕化痰、寬胸散結(jié)的經(jīng)典藥對，是中醫(yī)治療心系疾病中藥復(fù)方中的核心組成。但目前尚缺乏“陳皮-半夏”藥對治療CMD 的相關(guān)實驗研究，故在此運用網(wǎng)絡(luò)藥理學進行初步探討。

研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討“陳皮-半夏”藥對治療冠脈微循環(huán)障礙的潛在作用機制，通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫得到“陳皮-半夏”藥對關(guān)鍵化學成分179 個，參與調(diào)節(jié)冠脈微循環(huán)障礙的關(guān)鍵化學成分105 個，且度數(shù)在前三位為柚皮素［16］、諾比林［17］、黃芩素［18］、β-谷甾醇［19］，均被報道在CMD 等心血管疾病的治療過程中發(fā)揮良好的作用。通過PPI 網(wǎng)絡(luò)圖的分析中可知，“陳皮-半夏”藥對作用靶點與CMD靶點之間相互影響，靶點間的關(guān)系錯綜復(fù)雜，表明其治療作用機制復(fù)雜多樣。統(tǒng)計其中關(guān)聯(lián)性最高的靶點，位于前幾位的靶點分別為AKT1、VEGFA、BCL2、BAX、JUN。AKT1 是PI3K 下游直接的重要蛋白，是AKT 三個同種型蛋白結(jié)構(gòu)中的一種［20］，AKT 活化后可以調(diào)節(jié)VEGF 介導(dǎo)的血管生長［21］，使內(nèi)皮細胞遷移來減慢心功能受損速度，還可通過抑制心肌細胞凋亡來增加心肌細胞活性，磷酸化的AKT 具有抗凋亡、促細胞生存及促蛋白合成等活性［22］。BCL2 和BAX 是BCL2 家族中被公認的一對調(diào)控凋亡的關(guān)鍵基因［23］，BAX 可降低BCL2表達并升高細胞內(nèi)Ca2+，促進細胞凋亡；而BCL2 則通過一種抗氧化劑或抑制氧自由基生成，改變細胞內(nèi)Ca2+外流，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)cGMP 含量，抑制細胞凋亡［24］。JUN 是組成轉(zhuǎn)錄因子AP-1（激活蛋白-1）的一類蛋白族，包括c-JUN、v-JUN、JUN B 和JUN D。研究表面［25］AP-1 通過對各種生長因子和細胞因子的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡以及炎癥等多種細胞過程，其中c-JUN 蛋白對誘導(dǎo)炎性介質(zhì)分泌起重要作用［26］。通過可視化網(wǎng)絡(luò)可見“陳皮-半夏”藥對治療CMD 是通過激活A(yù)KT1 抗凋亡與促細胞生存以保護心肌細胞、調(diào)節(jié)VEGF 介導(dǎo)冠脈微循環(huán)血管內(nèi)皮細胞生長、調(diào)控BCL2 和BAX 抑制凋亡保護冠脈微循環(huán)、調(diào)節(jié)JUN 蛋白調(diào)控炎性介質(zhì)分泌以減慢CMD 形成過程中的炎癥反應(yīng)等多途徑多靶點發(fā)揮用，具有多種潛在作用機制。

GO 生物學富集過程提示冠脈微循環(huán)障礙的治療與抑制細胞凋亡、保護冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞功能、抑制炎性反應(yīng)等密切相關(guān)，這與PPI 得到的結(jié)果相吻合。通過KEGG 通路富集分析及相關(guān)文獻查閱可知，陳皮-半夏”藥對治療CMD 主要涉及PI3K-Akt、TNF、VEGF、Apoptosis、HIF-1 等信號通路。近年來有研究發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt 信號通路的下調(diào)可以抑制冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞的遷移、增殖和血管形成，提示冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞功能障礙可能與PI3K-Akt 信號通路障礙相關(guān)［27］。TNF 作為炎癥相關(guān)通路，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的生物學活性占其總活性的70%～95%，可促使大量白細胞活化、聚集，并黏附于冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞，從而阻塞微血管，同時其也可以活化血小板促進冠脈微循環(huán)內(nèi)血栓形成，加重組織炎癥，最終導(dǎo)致CMD 的發(fā)生［28］。冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞功能障礙是CMD 發(fā)生的主要病理生理機制，VEGF 作為介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子的重要信號通路能夠促進血管內(nèi)皮細胞增生、促進血管增生、增加血管通透性，故VEGF 通路對冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞功能的保護起到至關(guān)重要的作用［29］。研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡可能是引發(fā)血管內(nèi)皮功能障礙進而導(dǎo)致CMD 發(fā)生的重要原因［30］，因此基于Apoptosis 相關(guān)通路，從抑制細胞凋亡的角度保護血管內(nèi)皮功能，已成為保證冠脈微循環(huán)穩(wěn)定、治療CMD 不可替代的基礎(chǔ)［31］。HIF-1 作為低氧細胞應(yīng)激信號通路，其生物活性主要是由HIF-1α 決定。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 的穩(wěn)定表達對心血管系統(tǒng)有一定保護作用，當HIF-1α 表達水平增高時，可使患者血清缺氧和炎癥反應(yīng)程度明顯增加，導(dǎo)致冠脈微循環(huán)血管內(nèi)皮細胞損傷更加嚴重［32］。

綜上所述，“陳皮-半夏”藥對主要通過保護冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞功能、抑制細胞凋亡、影響炎性反應(yīng)等途徑治療冠脈微循環(huán)障礙。研究通過構(gòu)建“藥對活性成分-疾病靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)對“陳皮-半夏”藥對的關(guān)鍵活性成分以及靶標進行了預(yù)測，并將研究結(jié)果與已知實驗結(jié)果進行對比，所得結(jié)果真實可靠，為后續(xù)的“陳皮-半夏”藥對的臨床應(yīng)用以及CMD 相關(guān)疾病的基礎(chǔ)與臨床研究提供了數(shù)據(jù)支持。