泡沫分離法純化葫蘆巴中薯蕷皂苷及抗氧化性的研究

王志娟 張 煒 甘文梅 乜世成 高 紅 宋 林

(青海師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，西寧 810008)

葫蘆巴(Trigonellafoenum-graeeum, L.)，又名大葉蕓香草、香苜蓿，是一種生存力極強(qiáng)的一年生草本植物，系豆科植物蝶形花亞科[1]，它起源于南歐、西亞和地中海地區(qū)，自古以來(lái)被用作香料及調(diào)味劑[2]。葫蘆巴種子具有祛寒除濕、溫腎補(bǔ)陽(yáng)、抗腫瘤、降血糖等多種藥用價(jià)值，已被多版《中國(guó)藥典》收錄[3]。隨著葫蘆巴膠和葫蘆巴薯蕷皂素資源的開(kāi)發(fā)，葫蘆巴被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)[4]。

葫蘆巴種子中含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和活性成分，其中，薯蕷皂苷為主要化學(xué)成分[5]，具有舒筋活血、消食利水、脫敏、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等作用[6]。因薯蕷皂苷提取液中雜質(zhì)較多，產(chǎn)品純度低，需經(jīng)純化才能對(duì)其進(jìn)行后續(xù)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。皂苷是一種優(yōu)良的天然非離子型表面活性成分，具有親水性的糖體和疏水性的皂苷元，因此具有良好的起泡性，泡沫分離法(foam separation)作為一種基于溶液中溶質(zhì)組分間表面活性的差異進(jìn)行分離的新型技術(shù)，因具有設(shè)備簡(jiǎn)單和適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，已被成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)、皂苷及中藥有效成分的分離富集[7,8]。

本實(shí)驗(yàn)以利用超高壓提取技術(shù)提取出的薯蕷皂苷溶液為原料，富集比和回收率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定出最佳條件，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行研究，為葫蘆巴中薯蕷皂苷的藥理活性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葫蘆巴種子：西寧市九康藥材市場(chǎng) (經(jīng)青海省食品藥品檢定所鑒定)；薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品、無(wú)水乙醇(AR)、香草醛(AR)、高氯酸(AR)、冰醋酸(AR)。

GX-04多功能粉碎機(jī)，101A-1E 電熱鼓風(fēng)干燥箱，BSA224S-CW 電子天平，TU-1901 雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，實(shí)驗(yàn)室自制泡沫分離裝置如圖1所示。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 葫蘆巴中薯蕷皂苷泡沫分離的評(píng)價(jià)指標(biāo)

采用香草醛-高氯酸顯色法[9]對(duì)葫蘆巴中薯蕷皂苷的濃度進(jìn)行測(cè)定，分別按式(1)、式(2)計(jì)算葫蘆巴中薯蕷皂苷的的回收率和富集比。

(1)

圖1 泡沫分離裝置圖

(2)

式中：ρf、ρs為泡沫層、殘留層中薯蕷皂苷的質(zhì)量濃度/μg/mL，V0、Vs、Vf為原液、殘留層、泡沫層的體積/mL。

1.2.3 泡沫分離葫蘆巴中薯蕷皂苷單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 上樣濃度對(duì)泡沫分離薯蕷皂苷的影響

在裝液量為350 mL，氣速為500 mL/min，溫度為30 ℃條件下進(jìn)行泡沫分離操作，考察上樣質(zhì)量濃度在0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL時(shí)對(duì)泡沫分離薯蕷皂苷的影響。

1.2.3.2 溫度對(duì)泡沫分離薯蕷皂苷的影響

在裝液量為350 mL，氣速為500 mL/min，上樣質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL條件下進(jìn)行泡沫分離操作，考察溫度在25、30、35、40、45 ℃時(shí)對(duì)泡沫分離薯蕷皂苷的影響。

1.2.3.3 氣速對(duì)泡沫分離薯蕷皂苷的影響

在裝液量為350 mL，溫度為30 ℃，上樣質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL條件下進(jìn)行泡沫分離操作，考察溫度在350、400、450、500、550 mL/min時(shí)對(duì)泡沫分離薯蕷皂苷的影響。

1.2.3.4 裝液量對(duì)泡沫分離薯蕷皂苷的影響

在氣速為500 mL/min，溫度為30 ℃，上樣質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL條件下進(jìn)行泡沫分離操作，考察裝液量在350、350、350、350、350 mL時(shí)對(duì)泡沫分離薯蕷皂苷的影響。

1.2.4 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)了以保壓時(shí)間(A)、保壓壓力(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)、固液比(D)為因素，薯蕷皂苷的回收率和富集比為指標(biāo)，采用響應(yīng)面Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化方案，因素水平設(shè)計(jì)表見(jiàn)表1。

表1 因素水平設(shè)計(jì)表

1.2.5 體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考王雅等[10]的方法，將未純化的提取液、純化的提取液、VC分別稀釋成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL溶液備用。取0.025 mg/mL DPPH 溶液2.5 mL與2.5 mL無(wú)水乙醇混合，測(cè)定溶液在 517 nm的吸光值(A0)；精確吸取上述不同質(zhì)量濃度的待測(cè)液 2.5 mL與質(zhì)量濃度0.025 mg/mL的 DPPH 溶液2.5 mL 混合，搖勻后放置30 min，測(cè)定上述溶液在最大吸收峰處吸光值(Ai)；精確吸取上述不同質(zhì)量濃度的待測(cè)液2.5 mL，分別與2.5 mL 無(wú)水乙醇混合均勻后，測(cè)定各溶液在最大吸收峰波長(zhǎng)處的吸光值(Aj)。按式(3)計(jì)算清除率。

(3)

1.2.5.2 羥自由基清除能力的測(cè)定

參考盧彬等[11]的方法，將未純化的提取液、純化的提取液、VC分別稀釋成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL溶液備用。取待測(cè)液2 mL，然后精確加入2 mL水楊酸-乙醇溶液(9 mmol/L)，2 mL 硫酸亞鐵溶液(9 mmol/L)，2 mL H2O2溶液(8.8 mmol/L)，混勻后在37 ℃下避光反應(yīng)30 min，510 nm處測(cè)其吸光值(Ai)。同時(shí)將對(duì)照將2 mL H2O2溶液換成2 mL蒸餾水，測(cè)其吸光值(Aj)；空白組將2 mL樣品溶液換成2 mL蒸餾水，測(cè)其吸光值(A0)。按式(4)計(jì)算清除率。

(4)

1.2.5.3 超氧陰離子清除能力的測(cè)定

參考盧彬等[12]的方法，將未純化的提取液、純化的提取液、VC分別稀釋成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL溶液備用。取待測(cè)液1 mL，依次加入50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.2) 緩沖溶液4.5 mL，充分混勻之后在37 ℃的水浴中10 min后，移取0.4 mL鄰苯三酚溶液并搖勻，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到4 min后用1.0 mL濃鹽酸終止反應(yīng)(A1)。空白組將1 mL待測(cè)液換成1 mL蒸餾水，測(cè)其吸光值(A0)。按式(5)計(jì)算清除率。

(5)

1.2.5.4總還原能力的測(cè)定

參考?xì)W陽(yáng)凱等[13]的方法，將未純化的提取液、純化的提取液、VC分別稀釋成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL溶液備用。取 1 mL待測(cè)液，依次加入pH 6.6，0.2 mol/L 的磷酸緩沖液 2.5 mL，1%鐵氰化鉀溶液 2.5 mL，混勻，50 ℃ 水浴 20 min，加入 10%三氯乙酸溶液2.5 mL，取2.5 mL 上清液，加入蒸餾水2.5 mL，10%三氯化鐵溶液，700 nm 測(cè)定吸光度，以吸光值的大小來(lái)表示樣品還原能力的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 上樣濃度對(duì)泡沫分離薯蕷皂苷的影響

上樣濃度對(duì)泡沫分離薯蕷皂苷的影響如圖2所示，富集比隨濃度的增大而逐漸降低，而回收率隨濃度的增大而逐漸升高。當(dāng)溶液濃度較低時(shí)，泡沫穩(wěn)定性較差，溶液黏度較小，泡沫持液率較低[14,15]，因此呈現(xiàn)富集比高而回收率低的現(xiàn)象。隨著溶液濃度的不斷增大泡沫穩(wěn)定性逐漸提高，同時(shí)溶液的黏度不斷增大，泡沫夾帶率變高，液體不易回流[16]，因此回收率逐漸升高。

圖2 濃度對(duì)泡沫分離薯蕷皂苷的影響

2.1.2 溫度對(duì)泡沫分離薯蕷皂苷的影響

溫度對(duì)泡沫分離薯蕷皂苷的影響如圖3所示，富集比隨溫度的升高先增大后減小，回收率不斷減小。當(dāng)溫度較低時(shí)，溶液黏度及泡沫穩(wěn)定性高，泡沫具有較高持液率，因此回收率較高[17]。當(dāng)溫度較高時(shí)，泡沫持液率降低，泡沫層夾帶的薯蕷皂苷含量降低，因此回收率降低[18]。

圖3 溫度對(duì)泡沫分離薯蕷皂苷的影響

2.1.3 氣速對(duì)泡沫分離薯蕷皂苷的影響

氣速對(duì)泡沫分離薯蕷皂苷的影響如圖4所示，隨著氣速的增加，富集比不斷降低，回收率先升高后降低。當(dāng)氣速較低時(shí)，泡沫在分離柱中停留的時(shí)間較長(zhǎng)，氣泡并聚、排液較充分，可攜帶出的薯蕷皂苷較少，因此富集比高，回收率低。當(dāng)氣速增大時(shí)，泡沫的生成速度及上升速度加快，持液率較高，因此，回收率升高[19]。

圖4 氣速對(duì)泡沫分離薯蕷皂苷的影響

圖5 裝液量對(duì)泡沫分離薯蕷皂苷的影響

2.1.4 裝液量對(duì)泡沫分離薯蕷皂苷的影響

裝液量對(duì)泡沫分離薯蕷皂苷的影響如圖5所示，當(dāng)裝液量較少時(shí)，泡沫在分離柱中停留的時(shí)間較長(zhǎng)，泡沫中攜帶的薯蕷皂苷較大程度上回流至原液中，因此，富集比升高。而當(dāng)裝液量增加時(shí)，泡沫的持液率較高，泡沫中的夾帶液在回流前被鼓出來(lái)，因此，回收率升高[20]。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

選取濃度(A)、溫度(B)、氣速(C)、裝液量(D)進(jìn)行四因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2 回歸模型的建立與檢驗(yàn)

對(duì)表2進(jìn)行多元線性回歸擬合后，得到回歸方程并對(duì)此方程進(jìn)行方差分析，方差分析結(jié)果，富集比的線性回歸表見(jiàn)表3和表回收率的線性回歸表見(jiàn)4。富集比(E)=+1.85-0.83A+ 0.15B-0.52C-0.21D-0.040AB+0.32AC+0.21AD-0.017BC+0.070BD+0.080CD-1.083E-003A2-0.050B2+0.23C2+0.50D2；回收率(R)=+89.13+2.69A+1.96B+0.87C+1.19D-0.54AB-3.02AC-4.24AD+ 2.62BC-6.70BD-5.33CD-1.50A2-6.80B2-1.89C2-3.11D2。

表3 富集比的線性回歸表

表4 回收率的線性回歸表

2.2.3 響應(yīng)曲面分析及最佳工藝條件的確定

利用Design-Experter 8.0.6軟件對(duì)葫蘆巴中薯蕷皂苷的純化工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳純化工藝參數(shù)為：上樣濃度0.03 mg/mL，溫度28.36 ℃，氣速450 mL/min，裝液量400 mL，在此條件下，薯蕷皂苷的回收率為88.31%，富集比為3.65。為驗(yàn)證預(yù)測(cè)模型的可靠性，從實(shí)際情況出發(fā)，將最佳工藝條件進(jìn)行調(diào)整：上樣質(zhì)量濃度0.03 mg/mL，溫度28 ℃，氣速450 mL/min，裝液量400 mL。在此條件下，薯蕷皂苷的回收率為86.57%，富集比為3.82，接近其預(yù)測(cè)值，說(shuō)明由Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì)軟件得到的最佳工藝條件可行。

2.3 體外抗氧化活性分析

2.3.1 薯蕷皂苷對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖6 薯蕷皂苷對(duì)DPPH自由基的清除能力

薯蕷皂苷對(duì)DPPH自由基的清除能力如圖6所示，未純化的薯蕷皂苷、純化后的薯蕷皂苷、VC對(duì)DPPH自由基的清除能力隨而增強(qiáng)，與李霄等[21]的結(jié)論一致。在0.01～0.05 mg/mL范圍內(nèi)，VC對(duì)DPPH自由基的清除率最高，但當(dāng)溶液質(zhì)量濃度達(dá)0.05 mg/mL時(shí)，純化后的薯蕷皂苷對(duì)DPPH自由基的清除效果與VC相接近。

2.3.2 薯蕷皂苷對(duì)羥自由基的清除能力

薯蕷皂苷對(duì)羥自由基的清除能力如圖7所示，在0.02～0.04 mg/mL范圍內(nèi)，未純化的薯蕷皂苷與純化后的薯蕷皂苷對(duì)羥自由基的清除效果相接近，與VC相比略低。

圖7 薯蕷皂苷對(duì)羥自由基的清除能力

2.3.3 薯蕷皂苷對(duì)超氧陰離子的清除能力

薯蕷皂苷對(duì)超氧陰離子的清除能力如圖8所示，薯蕷皂苷對(duì)超氧陰離子的清除能力隨濃度的增大而增加，這與王占一等[22]的研究結(jié)果一致。但在所測(cè)濃度范圍內(nèi)，VC對(duì)超氧陰離子的清除效果明顯高于薯蕷皂苷。

圖8 薯蕷皂苷對(duì)超氧陰離子的清除能力

圖9 薯蕷皂苷的總還原能力

2.3.4 薯蕷皂苷的總還原能力

薯蕷皂苷的總還原能力如圖9所示，在較低濃度時(shí)，純化后的薯蕷皂苷與VC的總還原能力極其吻合。吸光度值越大，表明總還原能力越強(qiáng)，薯蕷皂苷的總還原能力隨濃度的增大而增加，這與鄒小靈等[23]的研究結(jié)果一致。當(dāng)純化后的薯蕷皂苷質(zhì)量濃度達(dá)到0.04 mg/mL，總還原能力趨于平緩，低于VC但高于未純化的薯蕷皂苷。

薯蕷皂苷的總還原能力如圖10所示，在較低濃度時(shí)，純化后的薯蕷皂苷與VC的總還原能力極其吻合。吸光度值越大，表明總還原能力越強(qiáng)，薯蕷皂苷的總還原能力隨濃度的增大而增加，這與鄒小靈等[23]的研究結(jié)果一致。當(dāng)純化后的薯蕷皂苷濃度達(dá)到0.04 mg/mL，總還原能力趨于平緩，低于VC但高于未純化的薯蕷皂苷。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以葫蘆巴中薯蕷皂苷為研究對(duì)象，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化泡沫分離法純化葫蘆巴中薯蕷皂苷的工藝條件，得出最佳工藝條件為：上樣質(zhì)量濃度0.03 mg/mL，溫度28 ℃，氣速450 mL/min，裝液量400 mL，在此條件下，薯蕷皂苷的回收率為86.57%，富集比為3.82。其體外抗氧化活性研究結(jié)果表明，經(jīng)純化后的薯蕷皂苷對(duì)DPPH·、·OH、超氧陰離子有較好的清除效果，具有較強(qiáng)的還原能力，且體外抗氧化活性與皂苷質(zhì)量濃度相關(guān)性顯著。