人參-附子體外心衰細(xì)胞保護(hù)作用配伍研究

王野，劉雪瑩，竇德強(qiáng)*，陳飛谷*

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院·遼寧大連·116600）

心力衰竭(心衰)是一種復(fù)雜的臨床癥狀群,是各種心臟病的嚴(yán)重階段。根據(jù)多年前的流行病學(xué)調(diào)查,隨著老齡化社會(huì)的到來,中國心力衰竭患者數(shù)量必將呈逐年增長的態(tài)勢(shì)[1]。國際上多用西藥對(duì)心衰進(jìn)行治療,但由于西藥治療常伴隨明顯的不良反應(yīng)[2],在國內(nèi)中醫(yī)藥對(duì)于心衰治療強(qiáng)調(diào)整體辯證,在穩(wěn)定病情、改善心功能、提高生存質(zhì)量等方面具有優(yōu)勢(shì)[3],因此現(xiàn)代中醫(yī)常利用西醫(yī)診斷、中醫(yī)辨證論治的方法對(duì)心衰進(jìn)行治療[4]。人參附子配伍常在用治療心衰的方劑中出現(xiàn),但不同方劑之間人參附子配伍比例存在相當(dāng)差異,因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同配伍比例的人參附子水煎液對(duì)體外心衰細(xì)胞的保護(hù)作用進(jìn)行研究,對(duì)人參附子的不同配伍比例進(jìn)行篩選,尋找對(duì)心衰療效較好的配伍比例。

1 試驗(yàn)方法及材料

1.1 材料與儀器

1.1.1 動(dòng)物

出生1～3 d SD大鼠的乳鼠,SPF級(jí),雌雄不限,SD大鼠孕鼠由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供（許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001）。

1.1.2 藥材

人參藥材與附子藥材（來源于中國中醫(yī)科學(xué)院）。

1.1.3 試劑

四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）（批號(hào)：303H0525；北京Solarbio公司）；二甲基亞砜（DMSO）（批號(hào)：520C0313；美國Sigma公司）；高糖DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)：；美國Gibco公司）；0.25%胰蛋白酶（含EDTA）（批號(hào)：1830857；美國Gibco公司）；胎牛血清（批號(hào)：8166872；美國Gibco公司）；青、鏈霉素（批號(hào)：J160035；美國Hyclone公司）；PBS磷酸鹽緩沖液（批號(hào)：113I0215；北京Solarbio公司）；Ⅱ型膠原酶（批號(hào)：607C1312；北京Solarbio公司）；D-Hank's液（批號(hào)：20170706；北京Solarbio公司）；去乙酰毛花苷注射液（批號(hào)：161105；上海禾豐制藥有限公司）。

1.1.4 儀器與設(shè)備

NU-4750型CO2培養(yǎng)箱（美國NUAIRE公司）；HD2-BCN-1360B生物潔凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；Caretium酶標(biāo)儀（深圳市凱特生物醫(yī)療電子科技有限公司）；AE31EF型倒置顯微鏡（Motic公司）；U570-86 Premium系列超低溫冰箱（-80℃）（美國NBS公司）；TDZ4-WS低速臺(tái)式離心機(jī)（湘儀離心機(jī)）；濾器（0.22μm）（Millex.GP）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning公司）；96孔無菌培養(yǎng)板（Corning公司）；6孔無菌培養(yǎng)板（Corning公司）；24孔無菌培養(yǎng)板（Corning公司）；HH-4電子恒溫水浴鍋（金壇市億通公司）；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；200目孔徑不銹鋼濾網(wǎng)（北京Solarbio公司）；眼科剪與眼科鑷。

1.1.5 主要試劑的配制

10%高糖DMEM培養(yǎng)液：取適量高糖DMEM培養(yǎng)基,并加入1%雙抗10%于56℃滅活胎牛血清,0.22μm濾膜過濾,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

0.8%戊巴比妥鈉：用不含血清的高糖DMEM培養(yǎng)基溶解戊巴比妥鈉粉末(現(xiàn)配現(xiàn)用),將濃度稀釋為0.8%。

1.1.6 待測(cè)物藥液的配制

人參藥材與附子藥材分別用粉碎機(jī)粉碎后過60目篩,干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

3：1（人參：附子）水煎液：取15g人參粉末與5g附子粉末,加10倍量水浸漬30min,文火煎煮提取1h,靜置冷卻后,水煎液用200目濾布過濾,濾渣加10倍量水,文火再次煎煮1h,水煎液靜置放涼后,濾布過濾,合并兩次水煎液濾液,3000r/min離心10min,除去沉淀,上清液減壓濃縮定容至100mL（以生藥計(jì)200mg/mL）即得。分裝,置冰箱中-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?：1（人參：附子）水煎液：取10g人參粉末與5g附子粉末,加10倍量水浸漬30min,文火煎煮提取1h,靜置冷卻后,水煎液用200目濾布過濾,濾渣加10倍量水,文火再次煎煮1h,水煎液靜置放涼后,濾布過濾,合并兩次水煎液濾液,3000r/min離心10min,除去沉淀,上清液減壓濃縮定容至100mL（以生藥計(jì)150mg/mL）即得。分裝,置冰箱中-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5：1（人參：附子）水煎液：取15g人參粉末與5g附子粉末,加10倍量水浸漬30min,文火煎煮提取1h,靜置冷卻后,水煎液用200目濾布過濾,濾渣加10倍量水,文火再次煎煮1h,水煎液靜置放涼后,濾布過濾,合并兩次水煎液濾液,3000r/min離心10min,除去沉淀,上清液減壓濃縮定容至100mL（以生藥計(jì)200mg/mL）即得。分裝,置冰箱中-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?：1（人參：附子）水煎液：取10g人參粉末與10g附子粉末,加10倍量水浸漬30min,文火煎煮提取1h,靜置冷卻后,水煎液用200目濾布過濾,濾渣加10倍量水,文火再次煎煮1h,水煎液靜置放涼后,濾布過濾,合并兩次水煎液濾液,3000r/min離心10min,除去沉淀,上清液減壓濃縮定容至100mL（以生藥計(jì)200mg/mL）即得。分裝,置冰箱中-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1：2（人參：附子）水煎液：取5g人參粉末與10g附子粉末,加10倍量水浸漬30min,文火煎煮提取1h,靜置冷卻后,水煎液用200目濾布過濾,濾渣加10倍量水,文火再次煎煮1h,水煎液靜置放涼后,濾布過濾,合并兩次水煎液濾液,3000r/min離心10min,除去沉淀,上清液減壓濃縮定容至100mL（以生藥計(jì)150mg/mL）即得。分裝,置冰箱中-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)

取出生1～3 d SD大鼠的乳鼠若干用于實(shí)驗(yàn),超凈臺(tái)下進(jìn)行以下操作：乳鼠經(jīng)75%酒精消毒后斷頭處死,立即使用眼科剪與眼科鑷開胸取出心臟,將跳動(dòng)的心臟在夾持到盛有預(yù)冷PBS平衡溶液的無菌EP管中使心臟自動(dòng)泵出血液,操作過程中盡量注意防止損傷心臟。將心室部分剪下放入D-Hank's液中沖洗3次。將心肌組織轉(zhuǎn)移至離心管中,將心室肌部分用眼科剪剪成1mm3的組織塊,然后加入0.25%胰蛋白酶溶液及0.5%Ⅱ型膠原酶按1：1比例混合成消化酶3mL加入已剪碎的心肌組織中,吸管吹打,置于CO2培養(yǎng)箱（37℃,5% CO2,95%空氣）中消化5 min,棄去上層混懸液。再次加入消化酶3 mL消化5 min,收集上清液,并加入培養(yǎng)液終止消化。重復(fù)消化3次并收集上清液（若心肌組織未消化徹底,可增加消化次數(shù),消化總時(shí)間應(yīng)盡可能小于30 min）。將細(xì)胞混懸液經(jīng)200目孔徑不銹鋼濾網(wǎng)過濾,離心機(jī)離心后,得到心肌細(xì)胞,接種于培養(yǎng)瓶中,然后置于CO2培養(yǎng)箱中,差速貼壁1.5 h。取差速貼壁后細(xì)胞懸液用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞存活率,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)后將純化后的細(xì)胞懸液種至各規(guī)格培養(yǎng)板中,于37℃5% CO2環(huán)境中培養(yǎng),隔天換培養(yǎng)液,待細(xì)胞生長成熟(5 d)后,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[5-8]。

1.2.2 藥物濃度篩選

取差速貼壁后細(xì)胞懸液,每孔100μL接種于96孔板中,當(dāng)細(xì)胞生長成熟(5 d)后,每孔分別加入終濃度為10、5、1、0.5、0.1 mg/mL的比例為1.5（人參）：1（附子）的人參附子水煎液及終濃度為80、40、20、10 mg/mL的去乙酰毛花苷注射液,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組（只接種細(xì)胞）和空白對(duì)照組（不接種細(xì)胞,只加培養(yǎng)液）。24 h后,每孔加入10μL濃度為5 mg/mL的MTT,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h,吸出含MTT的培養(yǎng)液,每孔加入100μL的DMSO,震蕩10 min,在酶標(biāo)儀492 nm處檢測(cè)吸光度（參考波長為630 nm）,并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

增殖抑制率（%）=[（1-（A實(shí)驗(yàn)組-A空白對(duì)照組）/（A陰性對(duì)照組-A空白對(duì)照組）]×100%

1.2.3 戊巴比妥鈉致心肌細(xì)胞心衰模型建立

將0.8%戊巴比妥鈉加入到種有心肌細(xì)胞的培養(yǎng)板中,作用7 min,得到心衰模型細(xì)胞。造模成功標(biāo)準(zhǔn)為:于顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞,搏動(dòng)停止,原本梭形兩端變細(xì)中部變圓,且有脫壁傾向。

1.2.4 藥物對(duì)心衰模型細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)酶活力的影響

取差速貼壁后細(xì)胞懸液接種于6孔板,每孔2mL,按照2.3下操作進(jìn)行造模,造模成功后,棄去造模液。實(shí)驗(yàn)分為以下幾組：

①空白對(duì)照組；

②模型組；

③陽性（去乙酰毛花苷）對(duì)照組（20mg/mL）；

④3：1組（人參：附子0.5mg/mL）；

⑤2：1組（人參：附子0.5mg/mL）；

⑥1.5：1組（人參：附子0.5mg/mL）；

⑦1：1組（人參：附子0.5mg/mL）；

⑧1：2組（人參：附子0.5mg/mL）；

各組分別加入相應(yīng)的藥液,每組3個(gè)復(fù)孔,每孔1mL。將細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h,收集細(xì)胞:用0.25%EDTA胰酶消化,收集消化液于離心管中用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化,以1000r/min離心5min收集細(xì)胞,生理鹽水洗2遍以除掉殘留的培養(yǎng)液或磷酸緩沖鹽溶液,棄上清,留下層細(xì)胞,用生理鹽水制備106～107/ml的細(xì)胞懸液（500μl）,經(jīng)超聲波細(xì)胞破碎機(jī)破碎細(xì)胞后（功率10%,4s/次,間隔8s,重復(fù)8～10次）,按超微量ATP酶測(cè)試盒說明書進(jìn)行測(cè)定,得到Na+-K+ATPase的活力,同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞總蛋白濃度。

破碎后按照試劑盒說明書測(cè)定細(xì)胞Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶與總ATP酶的活力。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)液中BNP及TNF-α含量的測(cè)定

取差速貼壁后細(xì)胞懸液接種于24孔板中,每孔1mL,按2.3項(xiàng)下方法分組、造模與給藥,每組6個(gè)復(fù)孔,每孔0.5mL。給藥作用1 h后,棄去藥液,用PBS清洗細(xì)胞1次,然后每孔加入140μL不含血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,收集培養(yǎng)液,采用ELISA法按照相關(guān)試劑盒說明書測(cè)定培養(yǎng)液中腦鈉肽(BNP)與腫瘤壞死因子(TNF-α)含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0處理數(shù)據(jù),組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察

臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞存活率達(dá)96%。在倒置顯微鏡下觀察,剛接種的心肌細(xì)胞尚未貼壁,呈圓形,懸浮于培養(yǎng)液中。培養(yǎng)72h后,心肌細(xì)胞已全部貼壁生長,細(xì)胞核凸出明顯,貼壁后心肌細(xì)胞為梭形、菱形或多角形,伸出偽足,出現(xiàn)自發(fā)性節(jié)律性搏動(dòng),詳見圖1。

圖1 造模前心肌細(xì)胞（1×200）

戊巴比妥鈉造模后的乳鼠心肌細(xì)胞搏動(dòng)停止,原本梭形兩端變細(xì)中部變圓,且有脫壁傾向,詳見圖2。

圖2 造模后心肌細(xì)胞（1×200）

2.2 藥物濃度篩選結(jié)果

按上述實(shí)驗(yàn)方法,得到以下結(jié)果。1.5：1（人參：附子）水煎液及去乙酰毛花苷注射液對(duì)原代心肌細(xì)胞的增殖抑制率如表1所示。

表1 藥物濃度篩選結(jié)果

高濃度1：1.5比例人參附子水煎液對(duì)原代心肌細(xì)胞有抑制作用,而0.5 mg/mL與0.1 mg/mL的1：1.5比例人參附子水煎液對(duì)原代心肌細(xì)胞無抑制作用,因此選取0.5 mg/mL的1：1.5比例人參附子水煎液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。陽性藥去乙酰毛花苷在20 mg/mL時(shí)對(duì)原代心肌細(xì)胞無抑制作用,故選取20 mg/mL去乙酰毛花苷進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 不同比例人參附子水煎液對(duì)心衰模型細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)酶活力的影響

按上述實(shí)驗(yàn)方法,得到以下結(jié)果。不同比例人參附子水煎液對(duì)心衰模型細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)酶活力的影響結(jié)果如表2所示。

表2 不同比例人參附子水煎液對(duì)心衰模型細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)酶活力影響結(jié)果

圖3 不同比例人參附子水煎液對(duì)心衰模型細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)酶活力影響

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,與空白組相比,模型組Na+-K+ATPase活力顯著增強(qiáng)（P＜0.01）,Ca2+-Mg2+ATPase活力有下降趨勢(shì),總ATPase活力顯著降低,心肌收縮力減弱。與模型組相比,陽性藥去乙酰毛花苷組能夠顯著降低由0.8%戊巴比妥鈉所致心衰引起的Na+-K+ATPase及總ATPase活力增強(qiáng),而對(duì)Ca2+-Mg2+ATPase活力影響較小。其他各給藥組均有逆轉(zhuǎn)由0.8%戊巴比妥鈉所致心衰引起的Na+-K+ATPase及總ATPase活力增強(qiáng)的趨勢(shì),以2：1、1.5：1與1：1這三個(gè)配伍比例作用最顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01）。

2.4 不同比例人參附子水煎液對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中BNP及TNF-α含量影響

按上述實(shí)驗(yàn)方法,得到以下結(jié)果。不同比例人參附子水煎液對(duì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中BNP及TNF-α含量影響結(jié)果如表3所示。

表3 不同比例人參附子水煎液對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中BNP及TNF-α含量影響結(jié)果

注：*P＜0.05,**P＜0.01與模型組比較；#P＜0.05,##P＜0.01與空白組比較

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,與空白組相比,模型組TNF-α及BNP含量顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比,陽性藥去乙酰毛花苷組能夠顯著降低TNF-α及BNP含量（P＜0.01）。綜合BNP與TNF-α數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析可知2：1（人參：附子）組,1.5：1（人參：附子）組及1：1（人參：附子）組對(duì)心衰細(xì)胞恢復(fù)正常水平具有顯著療效（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01）。

3 討論

心力衰竭是由各種心臟疾病導(dǎo)致心功能不全的一種臨床綜合征,大多指心肌收縮力下降使心排血量不能滿足機(jī)體代謝的需要,導(dǎo)致器官、組織血液灌流不足,同時(shí)出現(xiàn)體循環(huán)或肺循環(huán)淤血的表現(xiàn)[9]。

Na+-K+ATPase,Ca2+-Mg2+ATPase是維持細(xì)胞內(nèi)外離子濃度的重要酶[10],目前研究表明,細(xì)胞膜內(nèi)外各離子濃度具有調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞收縮力的能力,當(dāng)心衰發(fā)生時(shí),細(xì)胞外鈣離子含量高于細(xì)胞內(nèi),心肌收縮力減弱[11]。當(dāng)心肌組織缺氧、血流動(dòng)力學(xué)改變時(shí)均可促使心肌組織合成TNF-α,TNF-α在心肌重塑和心力衰竭的發(fā)生與發(fā)展中有重要作用,目前研究表明TNF-α可反映心力衰竭的嚴(yán)重程度,是判定心功能及其觀察療效的一項(xiàng)有價(jià)值的指標(biāo)[12]。腦尿鈉肽（BNP）主要由心室肌細(xì)胞產(chǎn)生,是一種對(duì)機(jī)體各組織器官的多種生理功能具有調(diào)節(jié)作用的活性多肽[11]。當(dāng)心室容量負(fù)荷過重、室壁壓力增加、心室肌細(xì)胞發(fā)生損傷、心室肌細(xì)胞受牽拉等因素時(shí)會(huì)導(dǎo)致BNP分泌增多。目前BNP對(duì)于早期診斷和鑒別心衰有十分重要的臨床價(jià)值,也是評(píng)估預(yù)后、危險(xiǎn)層次級(jí)別劃分、判斷治療心衰效果的“金指標(biāo)”[13]。

自古以來,人參附子配伍應(yīng)用與多種方劑方中,如參附湯、人參四逆湯等。目前此類方劑多用于治療心力衰竭、心源性休克等心血管疾病。但不同方劑中其配伍比例存在差異[14],因此,本實(shí)驗(yàn)通過建立體外心衰模型,對(duì)不同比例配伍的人參附子水煎液進(jìn)行優(yōu)選,結(jié)果表明2：1（人參：附子）組,1.5：1（人參：附子）組及1：1（人參：附子）組療效較好,能夠顯著降低由心衰引起的TNF-α及BNP水平改變,通過調(diào)節(jié)心室肌細(xì)胞膜上Na+-K+ATPase,Ca2+-Mg2+ATPase及總ATPase含量,使心肌的收縮性加強(qiáng),發(fā)揮抗心衰作用。