響應(yīng)面優(yōu)化沙棘果油超聲輔助酶法脫膠工藝

孫靜瑤，曹家樂，遲巖，古力夏提·依明，努爾艾力·托合提，楊海燕

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

沙棘（Hippophae rhamnoides L.）為胡頹子科沙棘屬小喬木或灌木[1]。沙棘果油與沙棘籽油是從沙棘的果實(shí)中提取的一種有特色的、有價(jià)值的油品，具有極高的食用和藥用價(jià)值[2-4]。沙棘果油富含酚類、黃酮類、有機(jī)酸、多糖等生物活性物質(zhì)和人體所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、不飽和脂肪酸、氨基酸、微量元素等[5-8]，具有抗氧化、延緩衰老、抑制腫瘤細(xì)胞生長、止咳祛痰、抗輻射、活血散瘀、防治冠狀動(dòng)脈粥樣硬化等作用[9-12]，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、保健品和化妝品行業(yè)。

油脂精煉為除去沙棘果油中雜質(zhì)的過程，包括脫膠、脫色、脫酸、脫臭等一系列工序[13]。目前植物油常用的脫膠方法有水化脫膠、酸法脫膠、酶法脫膠、吸附脫膠、膜法脫膠和螯合脫膠等[13-15]。目前對沙棘果油的研究，多集中于應(yīng)用超聲輔助酶法提取沙棘果油，有關(guān)超聲輔助酶法對沙棘果油脫膠的工藝鮮有報(bào)道?；诖耍撐脑趦?yōu)化沙棘果油酶法脫膠的基礎(chǔ)上，將超聲波與酶法脫膠相結(jié)合，研究超聲處理對沙棘果油酶法脫膠的作用效果，以期為高品質(zhì)沙棘果油的工業(yè)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘果油（磷脂含量1.210 mg/g）：新疆慧華沙棘生物科技有限公司；磷脂酶A1（酶活≥10 kUL/g）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；氫氧化鈉、檸檬酸、丙酮（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；JJ-1電動(dòng)攪拌器：金壇市醫(yī)療儀器廠；PHB-4型pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；TDL-5-A飛鴿牌離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 pH值和磷含量的測定

反應(yīng)體系pH值的測定，依據(jù)Jahani等[16]報(bào)道的方法測定pH值，校正公式為pH實(shí)際=pH測定－0.26。

樣品磷含量的測定采用重量法，參考GB/T 5537—2008《糧油檢驗(yàn)磷脂含量的測定》。

1.3.2 超聲輔助酶法脫膠工藝

沙棘果油10.00 g，80℃水浴，加入50%檸檬酸0.030 mL，攪拌20 min，取出冷卻至室溫25℃，加入一定量4%NaOH，加入去離子水，400 r/min攪拌5 min，加入磷脂酶，轉(zhuǎn)到超聲波反應(yīng)器中，設(shè)定溫度、時(shí)間和功率，攪拌，反應(yīng)結(jié)束后，95℃水浴加熱滅酶攪拌，3 000 r/min離心15 min，收集上層油相測定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

確定初始提取條件為超聲溫度50℃，去離子水添加量2%，pH 5.0，超聲時(shí)間40 min，超聲功率150 W，酶添加量4%，3 000 r/min離心15 min，在此基礎(chǔ)上考察不同酶添加量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）、超聲時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）、超聲溫度（35、40、45、50、55、60 ℃）、pH 值（4.2、4.5、4.8、5.0、5.3、5.5）、水添加量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）、超聲功率（100、125、150、175、200、225 W）對脫膠效果的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 12對響應(yīng)變量酶添加量（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲溫度（C）、超聲功率（D）和響應(yīng)值磷脂含量（Y）進(jìn)行設(shè)計(jì)與分析，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Experimental factor level and coding table of response surface design

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2019軟件作圖，利用SPSS 22軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，并用Design-Expert 12軟件對參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶添加量對脫膠效果的影響

酶添加量對脫膠效果的影響見圖1。

圖1 酶添加量對脫膠效果的影響Fig.1 Influence of enzyme dosage on degumming effect

由圖1可知，隨著磷脂酶添加量的增加，沙棘果油中的磷脂含量呈先下降后上升的趨勢。當(dāng)磷脂酶添加量為5%時(shí)，磷脂含量為0.259 mg/g，與添加量為4%時(shí)相比明顯降低。這是因?yàn)榱字笇α字M分有水解作用，生成對應(yīng)的溶血磷脂，溶血磷脂生成甘油酰磷脂[17]。當(dāng)磷脂酶添加量達(dá)到5%時(shí)，沙棘果油磷脂含量降至最低，繼續(xù)添加磷脂酶，水解力下降，沙棘果油磷脂含量上升。所以，磷脂酶添加量為5%時(shí)脫膠效果最優(yōu)。

2.1.2 超聲時(shí)間對脫膠效果的影響

超聲時(shí)間對脫膠效果的影響見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對脫膠效果的影響Fig.2 Influence of ultrasonic time on degumming effect

由圖2可知，超聲時(shí)間在10 min～40 min時(shí)，隨時(shí)間的延長沙棘果油中的磷脂含量逐漸下降，超聲時(shí)間在30 min～40 min時(shí)，磷脂含量迅速下降且降幅明顯。當(dāng)超聲時(shí)間在40 min～60 min時(shí)，隨時(shí)間的延長磷脂含量逐漸增加。當(dāng)超聲時(shí)間為40 min，磷脂含量為0.420 mg/g，與超聲時(shí)間30 min時(shí)相比明顯降低，因此選擇超聲時(shí)間為40 min。脫膠時(shí)間過長，磷脂會(huì)重新擴(kuò)散到油相中，使膠體和油相發(fā)生局部的乳化現(xiàn)象[18]，超聲時(shí)間是否充分，直接影響脫膠的效果[19]。

2.1.3 超聲溫度對脫膠效果的影響

超聲溫度對脫膠效果的影響見圖3。

圖3 超聲溫度對脫膠效果的影響Fig.3 Influence of ultrasonic temperature on degumming effect

由圖3可知，超聲溫度在35℃～50℃時(shí)，隨著溫度的升高，脫膠效率不斷上升，磷脂含量降低；超聲溫度在50℃～60℃時(shí)，磷脂含量逐漸增加。當(dāng)超聲溫度為50℃，磷脂含量為0.419 mg/g，與超聲溫度45℃時(shí)相比明顯降低，因此選擇超聲溫度為50℃。原因是溫度對磷脂酶活性有著不同程度的影響。溫度過低，影響磷脂酶與底物的結(jié)合，酶促反應(yīng)效果差；當(dāng)溫度過高時(shí)酶的穩(wěn)定性和酶活力降低[20]。

2.1.4 pH值對脫膠效果的影響

pH值對脫膠效果的影響見圖4。

圖4 pH值對脫膠效果的影響Fig.4 Influence of pH value on degumming effect

由圖4可知，隨著pH值的增加，沙棘果油的磷脂含量隨著pH值的升高呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。pH值在4.2～4.8時(shí)，磷脂含量隨pH值的增加迅速降低，當(dāng)pH值在4.8～5.6時(shí)，磷脂含量逐漸升高。當(dāng)pH值為4.8時(shí)，磷脂含量為0.589 mg/g，與pH值為4.5時(shí)相比明顯降低。原因是酶在適宜的pH值范圍內(nèi)才能保持較高的活性，當(dāng)酸堿度高于一定范圍時(shí)，酶的活性降低甚至失活。因此，脫膠最佳pH值為4.8時(shí)脫膠效果最優(yōu)。

2.1.5 水添加量對脫膠效果的影響

水添加量對脫膠效果的影響見圖5。

圖5 水添加量對脫膠效果的影響Fig.5 Influence of water addition amount on degumming effect

由圖5可知，當(dāng)水添加量在1.5%～2.5%時(shí)，沙棘果油中的磷脂含量隨著水添加量的增加不斷下降，脫膠效率不斷上升。當(dāng)水添加量大于2.5%時(shí)磷脂含量迅速上升，漲幅明顯。當(dāng)水添加量為2.5%時(shí)，磷脂含量為0.588 mg/g，與添加量2%時(shí)相比明顯降低。說明隨著水添加量的不斷增加，部分磷脂會(huì)發(fā)生凝固和沉淀的現(xiàn)象，水添加量過多則會(huì)發(fā)生膠體和油體乳化現(xiàn)象，導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)束后難以分離[21]。所以，水添加量為2.5%時(shí)脫膠效果最優(yōu)。

2.1.6 超聲功率對脫膠效果的影響

超聲功率對脫膠效果的影響見圖6。

圖6 超聲功率對脫膠效果的影響Fig.6 Influence of ultrasonic power on degumming effect

由圖6可知，隨著超聲功率的增加，沙棘果油的磷脂含量呈先下降后上升的趨勢。當(dāng)超聲功率增加到175 W時(shí)，磷脂含量降至最低且降幅明顯，磷脂含量為0.294 mg/g。當(dāng)超聲功率在175 W～225 W范圍時(shí)，磷脂含量逐漸升高。說明在低強(qiáng)度超聲波對酶催化反應(yīng)具有協(xié)同加速作用[22-23]，當(dāng)超聲波過高時(shí)會(huì)改變酶分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其失活[24]。因此，選擇超聲功率為175 W。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以酶添加量（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲溫度（C）、超聲功率（D）為自變量，以磷脂含量（Y）為響應(yīng)值，通過使用Design-Expert 12軟件，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)為四因素三水平，其設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Continue table 2 Response surface test design and results

2.2.1 以磷脂含量為響應(yīng)值的回歸方程方差分析

由Design-Expert 12分析得到回歸方程如下。

方差分析結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface test results

由表3可知，回歸模型在統(tǒng)計(jì)學(xué)上呈極顯著（P＜0.01），說明該沙棘果油脫膠試驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A、D、A2、B2、C2和 D2對磷脂含量的影響極顯著，交互項(xiàng)AD和BD對模型的影響顯著，說明試驗(yàn)因素與響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系；失擬項(xiàng)結(jié)果為不顯著（P＝0.053 5＞0.05），說明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂休^好的擬合度，方程模型的殘差可能來源于試驗(yàn)過程中的隨機(jī)誤差。模型的R2Adj=0.911 6說明試驗(yàn)可靠、誤差小，該模型能解釋91.16%的響應(yīng)值變化，R2為0.955 8,表明磷脂含量的實(shí)測值與預(yù)測值之間具有較好的擬合度，該模型可預(yù)測沙棘果油超聲輔助酶法脫膠工藝的實(shí)際情況。在試驗(yàn)所選取的各因素中，影響順序?yàn)槊柑砑恿浚境暪β剩境晻r(shí)間＞超聲溫度。

2.2.2 響應(yīng)曲面分析

響應(yīng)面磷脂含量與酶添加量對沙棘果油脫膠效果的結(jié)果見圖7～圖8。

圖7 超聲功率與超聲時(shí)間對沙棘果油脫膠效果的響應(yīng)面和等高線Fig.7 Response surface diagram and contour of ultrasonic power and ultrasonic time on deguming effect of seabuckthorn fruit oil

圖8 超聲功率與酶添加量對沙棘果油脫膠效果的響應(yīng)面和等高線Fig.8 Response surface and contour of ultrasonic power and enzyme addition to degumening effect of seabuckthorn fruit oil

由圖7和圖8可知，隨著酶添加量、超聲時(shí)間和超聲功率的增大或延長，沙棘果油磷脂含量也隨之下降，但當(dāng)酶添加量、超聲時(shí)間、超聲功率增大或延長到一定程度后，沙棘果油磷脂含量呈上升的趨勢，超聲功率和超聲時(shí)間、酶添加量和超聲功率的交互作用對模型影響顯著，其余均不顯著，從等高線圖中可以看出其橢圓程度和疏密程度，與模型回歸中的方差分析一致。

2.3 最佳脫膠條件的驗(yàn)證

由響應(yīng)面法試驗(yàn)分析數(shù)據(jù)可得出沙棘果油超聲輔助酶法脫膠的最佳工藝為酶添加量5.140%、超聲時(shí)間39.230 min、超聲溫度49.970℃、超聲功率179.730 W，磷脂含量為0.095 mg/g。為了試驗(yàn)的可行，修正后工藝條件為酶添加量5%、超聲時(shí)間39 min、超聲溫度50℃、超聲功率為180 W，在此工藝條件下試驗(yàn)重復(fù)3次得到磷脂含量為0.097 mg/g。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助酶法脫膠，通過單因素試驗(yàn)確定最佳酶添加量、超聲時(shí)間、超聲溫度和超聲功率，以磷脂含量作為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)建立回歸方程進(jìn)行分析。工藝條件為酶添加量5%、超聲時(shí)間39 min、超聲溫度50℃、超聲功率為180 W時(shí)，影響順序?yàn)槊柑砑恿浚境暪β剩境晻r(shí)間＞超聲溫度，酶添加量和超聲功率對沙棘果油脫膠后磷脂含量影響極顯著。在最佳工藝條件下模型預(yù)測沙棘果油的磷脂含量為0.095 mg/g，驗(yàn)證試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，得到沙棘果油的磷脂含量實(shí)際值為0.097 mg/g，與預(yù)測值相差2.100%，說明該模型可行。利用超聲輔助酶法對沙棘果油進(jìn)行脫膠處理，磷脂含量降至最低。