堆肥腐殖酸形成及其電化學活性

油 暢, 崔 駿, 李 強, 劉嬌嫻, 鄭明霞, 楊 超, 何小松,, 張茉莉, 涂 響*

1.中國環(huán)境科學研究院, 國家環(huán)境保護飲用水水源地保護重點實驗室, 北京 100012 2.中國環(huán)境科學研究院, 國家環(huán)境保護地下水模擬與控制重點實驗室, 北京 100012 3.首都經(jīng)濟貿(mào)易大學城市經(jīng)濟與公共管理學院, 北京 100070

隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展、城市人口數(shù)量的急劇增加以及垃圾分類的有效推進，城市生活垃圾中易腐有機組分含量逐年增加，滲濾液和惡臭污染日益加劇[1]. 堆肥是一種生物轉(zhuǎn)化技術，可以實現(xiàn)易腐垃圾、污泥與糞便等有機廢物的生物轉(zhuǎn)化[2-3]，它不僅可高溫消除人類病原體、降低環(huán)境風險，還可形成腐殖酸類物質(zhì)，作為有機肥施用[4-5].

堆肥腐殖酸具有多種環(huán)境功能，包括改變微量元素的遷移、固定及淋溶，間接激活或抑制土壤酶活性，保護和貯存諸多營養(yǎng)元素，在保持土壤結(jié)構穩(wěn)定和提高土壤持水性方面發(fā)揮著重要作用[6]. 此外，堆肥腐殖酸還可加速微生物對礦物、有機污染物的還原轉(zhuǎn)化，被譽為自然環(huán)境中理想的“電子穿梭體”[7-9]，其電子傳遞的主要機理源于腐殖酸中醌-酚結(jié)構的氧化與還原過程[10]. 有研究[11]表明，腐殖酸中含氮和含硫基團也具有電子轉(zhuǎn)移能力. 因此，探究堆肥過程中所形成腐殖酸的組成特征、形成規(guī)律及氧化還原特征，對于堆肥資源化利用和利用堆肥修復土壤污染意義重大.

有學者基于土壤腐殖質(zhì)組成，推測腐殖酸主要由氨基酸和木質(zhì)纖維素形成[12-14]，但堆肥過程中氨基酸組成及其與木質(zhì)纖維素形成腐殖酸的特征，以及堆肥曝氣和厭氧過程中腐殖酸在電子得失過程中被還原和氧化的機理均尚不清楚，因此無法評判氧化還原過程對堆肥腐殖酸形成的影響. 基于此，該研究通過調(diào)查堆肥腐殖酸中氨基酸組成及其含量變化，分析堆肥過程與腐殖酸形成相關多種氮、碳結(jié)構的演化規(guī)律，揭示堆肥腐殖酸的氧化還原活性及得失電子對腐殖酸組成的影響，以期為改善堆肥產(chǎn)品品質(zhì)以及提升其肥效和改善其環(huán)境修復性能提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 堆肥材料

樣品采集于北京市某生活垃圾堆肥廠. 該堆肥廠首先對生活垃圾進行篩分，分揀出塑料、紙張、金屬等不可堆肥物質(zhì)，將剩余殘渣進行生物發(fā)酵. 堆肥分為一次發(fā)酵和二次發(fā)酵：一次發(fā)酵21 d，每2 d翻堆一次進行供氧；二次發(fā)酵30 d，每7 d翻堆一次，堆肥持續(xù)51 d. 分別于第0、7、14、21、28、51天進行取樣，每個樣品采集2份，每份不少于500 g，隨后將其進行混合均勻，剔除大塊物質(zhì)后，過篩，篩下物用于提取腐殖酸.

1.2 腐殖酸測定

將250 g堆肥樣品經(jīng)過磨碎處理后，用100 mL 0.05 mol/L NaOH溶液在氮氣氣氛下提取腐殖酸，搖12 h，10 000 r/min下離心30 min，將50 mL 0.05 mol/L HCl、25 mL 0.15 mol/L HF與腐殖酸混合，去除硅酸鹽，將樣品分解透析，凈化腐殖酸[15]. 運用Folin-Lowry法測定腐殖酸含量，將8 g NaOH與40 g Na2CO3溶解于2 L去離子水中，取0.8 mL該溶液與2 mL凈化后的腐殖酸溶液混合，常溫下靜置20 min，加入Folin-酚試劑，混合后靜置30 min，使用分光光度計(HitachiF-7000，日立集團，Japan)測量其吸光度值.

1.3 氨基酸測定

稱取氨基酸標準樣品溶于0.1 mol/L HCl水溶液中，配置成10 mmol/L的單標溶液，取適量單標溶液混合配制成濃度為0.6 mmol/L的混標溶液，備用. 將氨基酸化合物衍生處理后，采用高效液相色譜法(HPLC)測定氨基酸含量. 選用LiChrospher 100 RP-18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A為25 mmol/L醋酸鈉水溶液(pH=5.8)；四氫呋喃與水的體積比為95∶5，超聲15 min，過0.45 μm濾膜；流動相B為甲醇(色譜級)；流速為1.0 mL/min；λEm=340 nm，λEx=450 nm；進樣量為10 μL. 分梯度洗脫.

1.4 XPS、FTIR、NMR與同步熒光的測定

使用X射線光電子能譜儀(K-Alpha，Thermo Scientific，USA)測定腐殖酸中氮形態(tài)的分布情況，以C 1s(284.6 eV)為定標標準[16].

使用傅里葉變換紅外分光光度計(FT-IR，Nicolet6700/8700，Thermo Scientific，USA)測定500～4 000 cm-1范圍內(nèi)堆肥腐殖酸官能團的組成[17-20].

采用BrukermodelAV-300光譜儀(Bruker，Billerica，MA，USA)，直接測量堆肥腐殖酸的固態(tài)CP/MAS13C NMR譜[21]. 此外，將腐殖酸樣品溶解后，采用熒光分光度計(HitachiF-7000，日立集團，Japan)，在270～550 nm范圍內(nèi)測定腐殖酸的同步熒光光譜，測試波長差為30 nm，掃描速度240 nm/min[22].

1.5 電化學測定

使用電化學工作站(CHI660D，上海晨華有限公司)以石墨板、Pt和Ag/AgCl分別為工作電極、對電極和參比電極，電解液為飽和二甲基亞砜(DMSO)溶液(pH=7.0)，測定線性伏安曲線(LSV). 在氮飽和磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)中，測量腐殖酸的電子供給能力(EDC)和電子接受能力(EAC)，掃描電壓范圍為-1.5～1.0 V，掃描速率設定為10 mV/s，在氮飽和磷酸鹽緩沖溶液的腐殖酸樣品中，通過正電流，電壓為0.5 V，然后測定氧化后樣品的同步熒光光譜；在氮飽和磷酸鹽緩沖溶液的腐殖酸樣品中，通過負電流，電壓為0.6 V，然后測定還原后樣品的同步熒光光譜；在氮飽和磷酸鹽緩沖溶液的腐殖酸樣品中，先通過正電流，電壓為0.5 V，隨后通過負電流，電壓為0.6 V，再通過正電流，馴化循環(huán)反復多次，隨后測定經(jīng)過氧化和還原處理的腐殖酸溶液的同步熒光光譜[23].

2 結(jié)果與討論

2.1 堆肥過程腐殖酸中有機氮轉(zhuǎn)化特征

從生活垃圾堆肥提取的腐殖酸共檢測出15種氨基酸(見表1)，將其按電荷類分為酸性氨基酸(Asp和Glu)、堿性氨基酸(Lys、His、Arg)、中性氨基酸(Val、Ala、Ile、Gly、Leu)、帶羥基氨基酸(Ser、Thr)、芳香基氨基酸(Tyr、Phe)及甲硫氨基酸(Met). 在氨基酸含量大于100 mg/g的堆肥樣品中，酸性氨基酸(Asp和Glu)含量最高，占氨基酸總含量的比值為25.8%；在氨基酸含量為50～100 mg/g的堆肥樣品中，堿性氨基酸(His和Lys)含量最高，占氨基酸總含量的11.3%. 在氨基酸含量小于50 mg/g的堆肥樣品中，中性氨基酸(Gly、Ile、Val)含量最高，占氨基酸總含量的9.23%，最少的是Ser，平均含量只有3.78 mg/g.

表1 堆肥樣品中氨基酸含量描述性分析

隨堆肥發(fā)酵的進行，腐殖酸中氨基酸含量總體呈下降趨勢，但在部分時段出現(xiàn)上升. 堆肥初期(0～7 d)，各類型氨基酸含量均呈增加趨勢，其中Arg(70.1%)、His(43.3%)和Val(38.5%)的增幅較高；Met(0.78%)和Gly(7.02%)的增幅較低. 在堆肥中期(7～14 d)，氨基酸含量呈兩極分化趨勢，Ser(-100%)的降幅最高，Met(100%)、Val(69.3%)、Phe(55.6%)的增幅較高. 在堆肥后期(14～51 d)，各類氨基酸含量均呈降解趨勢，Ile、Gly的降解速率始終較高，Ser的降解速率隨堆肥時間的增加而遞增，Val、Met、Phe的降解速率則遞減. 堆肥發(fā)酵過程中氨基酸含量總體呈下降趨勢，表明與腐殖酸中其他結(jié)構相比，氨基酸生物活性較高，易被生物降解和利用.

為進一步證實上述結(jié)果，該研究測定了腐殖酸的N、C含量，計算了氨基酸N、C含量在腐殖酸N、C含量中的占比，結(jié)果如圖1所示. 堆肥初期(0～14 d)，腐殖酸中將近75%的N為氨基酸態(tài)N，隨堆肥發(fā)酵的進行，氨基酸迅速降解，到堆肥末期50%左右的N為氨基酸態(tài)N. 與之類似，堆肥起始氨基酸C含量/腐殖酸C含量小于20%，隨堆肥發(fā)酵的進行，氨基酸C含量/腐殖酸C含量增加，高溫期可在25%左右，但隨后氨基酸迅速降解，氨基酸C含量/腐殖酸C含量又降至不足20%.

圖1 堆肥過程中氨基酸和腐殖酸中 N、C含量的變化Fig.1 Changes in N and C contents in amino acids and humic acids during composting

為進一步探討堆肥過程中主要是哪些形態(tài)的氮發(fā)生降解，使用XPS對堆肥氨基酸中氮形態(tài)進行甄別，共監(jiān)測到吡啶(N-6)、吡咯(N-5)、質(zhì)子化吡啶(N-Q)及氮氧化合物形態(tài)的氮(N-X)(見圖2). 堆肥起始時(第0天)，樣品中檢測到N-5(399.84 eV)和N-X(407.3 eV)，二者的積分面積在不同形態(tài)氮的總積分面積中占比分別為74.6%和25.4%；堆肥第7天后檢測到N-6特征峰，其面積占比為47.15%，而N-5的面積占比為51.66%；堆肥第14天后出現(xiàn)N-Q，其面積占比為54.68%；堆肥第21天，N-6、N-5、N-Q、N-X的含量較為均衡，面積占比分別為24.48%、29.84%、24.13%、21.55%；堆肥第28天及以后，除N-X含量較低外，其余形態(tài)氮的含量均保持穩(wěn)定. 以上結(jié)果表明，吡咯是堆肥腐殖酸中氮的主要存在形態(tài)，而質(zhì)子化吡啶在堆肥第14天才產(chǎn)生，表明大量的有機氮(包括吡啶和吡咯)被氧化，開始形成質(zhì)子化吡啶[24-30].

注：N-6表示吡啶，N-5表示吡咯，N-Q表示質(zhì)子化吡啶，N-X表示氮氧化合物.圖2 氮元素形態(tài)變化的XPS譜圖Fig.2 XPS spectrum of the morphological changes of N element

2.2 堆肥過程腐殖酸中碳的形態(tài)轉(zhuǎn)化特征

2.2.1堆肥腐殖酸的含碳官能團變化特征

圖3 堆肥腐殖酸的FTIR譜圖Fig.3 FTIR spectrum of humic acid in compost

2.2.2堆肥腐殖酸中碳骨架的變化特征

不同堆肥階段腐殖酸的核磁共振(13C NMR)譜分析結(jié)果(見圖4)顯示，在14、23、30、33、38、55、130、182 ppm處出現(xiàn)了多個峰，14和23 ppm處分別對應于CCH和CCH2，55 ppm處的峰可能為木質(zhì)素單元芳香環(huán)上的甲基取代物，130 ppm處的峰歸因于芳香碳和不飽和碳，182 ppm處的峰歸因于COO-[40]. 堆肥0～21 d，13C NMR譜無顯著差異，堆肥21～51 d內(nèi)100～175 ppm處的峰呈小幅增加，表明隨發(fā)酵的進行，木質(zhì)纖維素降解形成的芳香官能團和羧基不斷增強. CCH、CCH2的含量在堆肥前最高，之后逐漸減少，結(jié)合之前的羧基、羰基變化特征，表明堆肥過程腐殖酸中大量脂肪官能團被降解和氧化，形成羧基、羰基等極性官能團.

圖4 堆肥腐殖酸的NMR譜圖Fig.4 NMR spectra of humic acid in compost

有機質(zhì)的13C NMR光譜帶可分為5個化學區(qū)域：脂肪族碳(0～50 ppm)、甲氧基碳(50～60 ppm)、多糖碳(60～100 ppm)、芳香結(jié)構碳(100～160 ppm)及羧基/羰基碳(160～200 ppm)[41]. 堆肥過程中腐殖酸NMR峰的面積占比如表2所示. 脂肪族碳(0～50 ppm)和甲氧基碳(50～60 ppm)的強度最強，在積分總面積中的占比為49.7%～78.8%. 其中，堆肥第0天脂肪族碳含量最高，隨堆肥時間的延長其含量逐漸下降，顯示脂肪碳在堆肥過程中快速被降解. 芳香族碳(100～160 ppm)的面積占比為10.0%～23.2%，隨堆肥發(fā)酵的進行，其含量逐漸增加，至第28天達到最高，顯示大量木質(zhì)纖維素在堆肥過程中被降解和轉(zhuǎn)化形成腐殖酸. 羧基/羰基碳(160～200 ppm)的面積占比為10.5%～17.1%，隨堆肥時間的延長，羧基/羰基碳的峰面積占比增加，顯示堆肥發(fā)酵過程中羧基/羰基碳含量增加.

表2 腐殖酸NMR峰的面積占比

2.3 腐殖酸的電化學氧化還原活性分析

為探究堆肥腐殖酸的氧化還原活性，利用電化學技術進行腐殖酸伏安曲線掃描，結(jié)果如圖5和表3所示. 在負向掃描中，電子從電極轉(zhuǎn)移到與腐殖酸上的氧化還原活性基團，形成負電流. 在電極界面發(fā)生還原反應，消耗還原材料，導致陰極電流較少，從而在LSV圖中形成還原峰. 在正向掃描中，電子從腐殖酸轉(zhuǎn)移到電極，形成氧化峰. 峰值電位之差(ΔEp)>0.059 V，IpA/IpC絕對值的最大值接近1，屬于準可逆反應. 隨著堆肥時間的延長，正向掃描和負向掃描的LSV峰值強度及峰值電位之差均呈增加趨勢，顯示隨著堆肥發(fā)酵的進行，腐殖酸的氧化和還原能力逐漸增強，即堆肥發(fā)酵增加了腐殖酸中具有電子轉(zhuǎn)移的官能團含量.

圖5 DMSO溶液LSV線性掃描伏安曲線Fig.5 LSV linear sweep voltammetry curve of phosphate buffer solution

表3 電化學參數(shù)

腐殖酸的電子轉(zhuǎn)移能力(ETC)對土壤環(huán)境中污染物去除相關的氧化還原反應有極為重要的影響. 在電化學工作站上，正電壓掃描模式下加入腐殖酸后電極材料會失去電子，形成氧化峰，獲得經(jīng)氧化后的腐殖酸溶液；負電壓掃描模式加入腐殖酸后電極材料會得到電子，通過還原反應形成還原峰，獲得經(jīng)還原后的腐殖酸溶液. 在正電壓—負電壓—正電壓—負電壓掃描模式下，溶液中同步進行著腐殖酸的氧化還原反應，最終獲得腐殖酸反復得失電子后的溶液. 測定腐殖酸經(jīng)氧化、還原和反復氧化-還原后溶液的同步熒光光譜，分析氧化還原反應對腐殖酸組成的影響，結(jié)果如圖6所示.

圖6 腐殖酸的同步熒光光譜Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of humic acid

對上述經(jīng)氧化、還原和反復氧化-還原反應得到的腐殖酸，采用同步熒光光譜進行結(jié)構和組成分析. 6個腐殖酸樣品在280 nm處均有一個強熒光峰，由芳香性氨基酸引起，即類蛋白物質(zhì)；340、370、480 nm附近出現(xiàn)的特征熒光峰對應類富里酸和類胡敏酸[42]. 隨堆肥時間的延長，類蛋白物質(zhì)熒光強度存在一定程度的降低，而腐殖質(zhì)類物質(zhì)熒光強度逐漸增加. 熒光強度也能反映腐殖酸的氧化還原能力，腐殖酸的熒光猝滅幅度與其電子供給能力呈正相關；熒光增強程度與其電子接受能力成正比.

圖6中“循環(huán)”表示反復氧化-還原反應后的樣品. 堆肥第0天，未處理樣品(原始樣品)所含類蛋白物質(zhì)的熒光強度最高，經(jīng)過氧化、還原反應后類蛋白物質(zhì)呈降解趨勢，不同反應的降解強度表現(xiàn)為氧化>還原>循環(huán)，顯示氧化反應對腐殖酸的降解能力最強，還原反應其次，反復氧化-還原對腐殖酸降解的影響最??；與第0天相比，堆肥第7天原始樣品中類蛋白物質(zhì)大量被降解，類腐殖酸物質(zhì)逐漸生成，但在單一的氧化反應與還原反應作用下，大分子類富里酸和胡敏酸物質(zhì)降解形成了少量類蛋白物質(zhì). 與堆肥第7天相比，第14天原始樣品中類蛋白與類腐殖酸物質(zhì)含量又有小幅增加，其中氧化后類蛋白物質(zhì)的降解幅度最大，還原后也有少量降解，在氧化與還原反復作用下呈現(xiàn)一定量的生成趨勢. 類腐殖酸物質(zhì)在單一的氧化與還原反應后均呈現(xiàn)一定量的降解，但在氧化、還原反復作用下呈激增趨勢，顯示在還原過程中，部分小分子類蛋白物質(zhì)可能結(jié)合形成了類腐殖酸物質(zhì).

堆肥第21天，原始樣品中類蛋白物質(zhì)含量的變化較小，類腐殖酸物質(zhì)有少量生成，其中，類蛋白物質(zhì)的降解強度表現(xiàn)為氧化>還原，而氧化、還原的反復進行下類蛋白物質(zhì)含量不斷增加，類腐殖酸在氧化與還原反應后均有不同程度的降解，降解強度表現(xiàn)為氧化>還原>循環(huán)；堆肥第28天與第51天，類蛋白物質(zhì)的含量在氧化還原反應后均有增加，增加強度均表現(xiàn)為循環(huán)>還原>氧化，類腐殖酸物質(zhì)均呈現(xiàn)降解趨勢，顯示氧化和還原過程(即電子轉(zhuǎn)移過程)會促進腐殖酸降解，形成小分子有機物.

在堆肥第7、21、28、51天的樣品中，經(jīng)過氧化和還原電流后，腐殖酸的最大熒光峰發(fā)生藍移，從長波段向短波段移動，意味著氧化和還原過程都可能造成腐殖酸物質(zhì)分子結(jié)構的破壞. 腐殖酸物質(zhì)屬于含苯環(huán)小分子有機物通過疏水作用、氫鍵和范德華等結(jié)合在一起的大分子有機物，氧化還原過程中這些弱結(jié)合力(即特征官能團)被破壞，腐殖酸發(fā)生解聚和部分降解，形成小分子有機物，導致類蛋白物質(zhì)含量增加.

以上結(jié)果也表明，采用堆肥腐殖酸修復污染土壤，很多官能團只能利用一次，經(jīng)電子轉(zhuǎn)移后，其本身結(jié)構會發(fā)生破壞，不能再發(fā)生作用，故需要適當再補充活性腐殖酸，以提升其土壤修復和改良效果.

3 結(jié)論

a) 堆肥腐殖酸共檢測出15種氨基酸，其中，酸性氨基酸(Asp和Glu)含量最高，在氨基酸總含量中的占比為25.8%；其次是堿性氨基酸(His和Lys)的含量，在氨基酸總含量中的占比為11.3%；再次是中性氨基酸(Gly、Ile、Val)的含量，在氨基酸總含量中的占比為9.23%；Ser含量最低，平均含量只有3.78 mg/g. 與腐殖酸中其他物質(zhì)相比，氨基酸生物活性高，易被生物降解和利用，隨著堆肥發(fā)酵過程的進行，氨基酸含量總體呈下降趨勢.

b) 堆肥初期(0～14 d)，腐殖酸中75%左右的氮為氨基酸態(tài)氮，隨堆肥發(fā)酵的進行，氨基酸迅速降解，到堆肥末期50%左右的氮為氨基酸態(tài)氮. 氨基酸中碳含量占腐殖酸中碳含量的比例不到25%，并隨發(fā)酵的進行而不斷降解，氨基酸中碳含量占腐殖酸中碳含量的比例最終不足20%. 吡咯是堆肥腐殖酸中氮的主要存在形態(tài)，而質(zhì)子化吡啶在堆肥第14天才產(chǎn)生，大量的有機氮(包括吡啶和吡咯)在堆肥過程中被氧化和降解.

c) 隨著發(fā)酵的進行，木質(zhì)纖維素降解形成腐殖酸，并且腐殖酸中大量脂肪族官能團被降解，羧酸類、醛、酮及苯環(huán)官能團增加，提升了腐殖酸中氧化還原活性官能團含量，導致腐殖酸的氧化和還原性能增加. 但腐殖酸通過得失電子，進行氧化和還原反應會造成部分氧化還原活性官能團降解，大分子腐殖酸被降解和轉(zhuǎn)化為小分子有機物. 因此，利用腐殖酸環(huán)境修復過程，需要適當補充活性腐殖酸.