肺結核病不同進程中差異表達基因的生物信息學分析

史劍權，王雋，趙國紅，張創(chuàng)業(yè)，劉毅

·論著·

肺結核病不同進程中差異表達基因的生物信息學分析

史劍權，王雋，趙國紅，張創(chuàng)業(yè)，劉毅

101149 北京，首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院重癥醫(yī)學科（史劍權），結核內科（王雋）；101500 北京市密云區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內二科（趙國紅）；100120 北京市肛腸醫(yī)院內科（張創(chuàng)業(yè)）；101149 北京市結核病胸部腫瘤研究所/首都醫(yī)科大學附屬北京胸科院耐藥結核病研究北京市重點實驗室細菌免疫室（劉毅）

通過生物信息學分析和數據挖掘，探討肺結核發(fā)病過程中基因表達的變化，尋找潛在的生物標志物，分析肺結核發(fā)生、發(fā)展和治療的分子機制。從 GEO 數據庫下載不同病程肺結核患者的全血基因芯片數據集，利用 R 語言篩選差異表達基因，并進行 GO 和 KEGG 分析，構建 PPI 網絡并篩選關鍵基因。結核潛伏期患者和活動性結核患者共獲得 71 個差異基因，治療后結核患者和活動性結核患者共獲得561個差異基因。在疾病不同病程中，差異基因富集于大量免疫相關過程和通路，如對 I 型和 II 型干擾素的應答、免疫受體激活、參與炎性小體復合物形成、T 細胞活化、中性粒細胞活化、中性粒細胞脫顆粒、中性粒細胞相關免疫應答等過程和功能，NOD 樣受體信號、RIG 樣受體信號、細胞因子與受體相互作用、結核、自噬等通路。篩選出 CXCL10、ISG15、OAS3、XAF1、OAS1、IFIT3、GBP1、RSAD2、GBP5、IFI44 是結核潛伏期患者和活動性結核患者間的前十位關鍵基因；IL-10、NOTCH1、MMP9、SPI1、CREB1、CTNNB1、JUN、ELAVL1、HSPA5、CYCS 是活動性結核患者和治療后結核患者間的前十位關鍵基因。肺結核病不同進程中的差異表達基因的功能富集等分析結果表示與免疫應答密切相關，CXCL10、ISG15、OAS3、XAF1、OAS1、IFIT3、GBP1、RSAD2、GBP5、IFI44、IL-10、NOTCH1、MMP9、SPI1、CREB1、CTNNB1、JUN、ELAVL1、HSPA5、CYCS 等關鍵差異基因有作為診斷標記物的可能。

結核??； 差異表達基因； 生物信息學

結核?。╰uberculosis，TB）是一種嚴重危害人類健康的慢性呼吸道傳染病，主要由結核分枝桿菌（，）感染引起，目前是全世界十大死因之一，也是單一感染性疾病的首要死亡原因[1-2]。近些年來，我國對于結核病的防治已經取得極大進展，但仍是世界上結核病負擔較重的國家之一。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的 2020 全球結核病報告指出[3]，2019 年我國新發(fā)結核病約 83.3 萬人，居世界第三位。同時，COVID-19 全球大流行的對公眾心理健康和社會經濟發(fā)展造成極大影響和負擔的嚴峻背景，給結核病的控制帶來了極大挑戰(zhàn)。

全球約有四分之一的人口感染了結核分枝桿菌，但大多數人可能處于潛伏感染狀態(tài)，而不是發(fā)病狀態(tài)。在從潛伏感染進展到活動性結核的過程中，免疫系統(tǒng)起著重要作用。同時，近年來研究認為結核病不僅是一種感染性疾病，也是一種免疫性疾病。免疫系統(tǒng)對結核分枝桿菌感染的識別、反應和相互作用將極大地影響疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉歸[4]，然而具體的作用機制尚不完全明確。本文通過對數據庫中健康對照者、結核潛伏期患者、活動性結核患者以及治療后結核患者的全血轉錄組測序數據進行分析，篩選差異基因并進行生物信息學分析，以期找到與免疫相關或能成為潛在生物標志物的差異分子，為了解結核的發(fā)病機制和診斷治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 數據選擇

從美國國立生物技術信息中心（NCBI，https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/）的GEO（Gene Expression Omnibus）數據庫中下載基因表達芯片 GSE54992、GSE19491。本研究選取兩組芯片中健康受試者42 例、結核潛伏期患者 75 例、活動性結核患者63 例、治療后結核患者 25 例的全血轉錄組測序芯片數據為研究對象，將其分別命名為健康受試者 HD 組、結核潛伏期患者 LTBI 組、活動性結核患者TB 組、治療后結核患者 TB after treatment 組。

1.2 數據處理和差異表達基因篩選

利用 R 語言的“l(fā)imma”包篩選芯片數據不同組別的差異基因。差異基因的篩選條件為差異倍數 |log2FoldChange| > 1或 2，adjust < 0.05。分別對四組芯片中 HD-LTBI、TB-LTBI、TB-TB after treatment 進行分析比較，篩選結核疾病進展中差異表達基因。通過繪制主成分分析圖和火山圖，將差異表達基因的結果可視化。

1.3 差異基因的GO 和KEGG 富集分析

利用 R 語言的“Cluster Profiler”包對已篩選的差異表達基因分別進行基因本體論（gene ontology，GO）生物學功能富集分析、京都基因與基因組大百科全書（Kyoto Encyclopedia for Genes and Genomes，KEGG）信號通路富集分析。其中 GO 包括生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。認為< 0.05 為富集有統(tǒng)計學意義。

1.4 差異基因編碼蛋白的相互作用PPI 網絡構建與關鍵基因篩選

利用 Cytoscape 軟件對篩選出的差異基因構建蛋白相互作用網絡，進一步通過CytoHubba 模塊篩選得到 10 個最有意義的 Hub 基因。韋恩圖分析不同病程患者篩選出的差異基因中的共有基因，與篩選得到的前十位最有意義的 Hub 基因中的共有基因，進一步篩選更有意義的關鍵基因。

2 結果

2.1 結核進展過程中不同階段全血差異基因篩選

通過預處理后的數據結果進行主成分分析后，發(fā)現四個組別的基因表達存在明顯差異，能夠分為四群（圖 1A）。根據 |log2FoldChange| > 1 或 2 且< 0.05 的差異基因篩選標準，結核潛伏期患者LTBI 組與健康受試者 HD 組共篩選到差異基因 4 個，其中 2 個上調，2 個下調（圖 1B）；結核潛伏期患者 LTBI 組與活動性結核 TB 患者組共篩選到差異基因 71 個，其中 52 個上調，19 個下調（圖 1C），前 10 位上調和下調差異基因見表 1 和表 2；活動性結核患者 TB 組與治療后結核患者 TB after treatment 組共篩選到差異基因561 個，其中 293 個上調，268 個下調（圖 1D），前 10 位上調和下調差異基因見表 3 和表 4。

Figure 1 Identification of different expression genes (DEGs) in the development of TB patients (A: PCA analysis; B: Volcanic map of differential genes between healthy subjects and latent tuberculosis patients; C: Volcanic map of differential genes between latent tuberculosis patients and active tuberculosis patients; D: Volcanic map of differential genes between active tuberculosis and patients with post-treatment tuberculosis)

表 1 TB-LTBI 前 10 位差異上調基因

2.2 差異基因 GO 和 KEGG 富集分析

對篩選出的差異基因進行 GO 和 KEGG 的富集分析，GO 分析結果應用氣泡圖進行展示，橫軸代表富集因子的比例，縱軸代表差異基因參與排名前 10 位的細胞組成、生物過程和分子功能。圓形越大代表某通路富集的基因數越多，顏色越紅代表.adjust 越小，富集越顯著。KEGG 通路富集結果應用橫向柱形圖進行可視化處理，紅色柱子代表上調基因的通路富集結果，藍色柱子代表下調基因的富集結果（圖2）。

健康人群與結核潛伏期患者之間篩選出的差異基因較少，無法進行 GO 和 KEGG 富集分析（結果未展示），其原因可能與樣本選擇和數量相關，同時也側面反映出潛伏期患者難以診斷鑒別的臨床現狀。結核潛伏期患者與活動性結核患者相比，差異基因多富集于與免疫相關的生物過程和功能，主要包括對病毒的防御應答、對 I 型和 II 型干擾素的應答、免疫受體激活、碳水化合物結合、免疫球蛋白結合、參與炎性小體復合物形成等，上調基因主要富集于 NOD 樣受體信號、RIG 樣受體信號、病毒感染等通路，下調基因主要富集于病毒蛋白與細胞因子和受體相互作用、細胞因子與受體相互作用和原發(fā)性免疫缺陷通路（圖 2A、2C、2E、2G）?；顒有越Y核患者與經過治療后的結核患者相比，差異表達基因主要涉及 T 細胞活化、中性粒細胞活化、中性粒細胞脫顆粒、中性粒細胞相關免疫應答、細胞黏附分子連接等生物過程和分子功能，上調基因主要富集于抗利尿激素調節(jié)的水重吸收、結核、病毒蛋白與細胞因子和受體相互作用、硫胺素代謝、AMPK 信號途徑、細胞因子與受體相互作用等通路，下調基因主要富集于 RNA 降解、自噬、p53 信號途徑、各種 N-聚糖的生物合成、內質網蛋白加工等通路（圖2B、2D、2F、2H）。

表 2 TB-LTBI 前 10 位差異下調基因

表 3 TB-TB after treatment 前 10 位差異上調基因

表 4 TB-TB after treatment 前 10 位差異下調基因

圖 2 GO 和 KEGG 富集分析（A：結核潛伏期患者與活動性結核患者差異基因生物過程分析；B：活動性結核患者與治療后結核患者差異基因生物過程分析；C：結核潛伏期患者與活動性結核患者差異基因細胞組成分析D：活動性結核患者與治療后結核患者差異基因細胞組成分析；E：結核潛伏期患者與活動性結核患者差異基因分子功能分析；F：活動性結核患者與治療后結核患者差異基因分子功能分析；G：結核潛伏期患者與活動性結核患者差異基因通路富集分析；H：活動性結核患者與治療后結核患者差異基因通路富集分析）

Figure 2 GO and KEGG enrichment analysis (A: Biological process analysis of differential genes between latent tuberculosis patients and active tuberculosis patients; B: Biological process analysis of differential genes between patients with active tuberculosis and patients with post-treatment tuberculosis; C: Cell components analysis of differential genes between latent tuberculosis patients and patients with active tuberculosis; D: Cell components analysis of differential genes between patients with active tuberculosis and patients with post-treatment tuberculosis; E: Molecular function analysis of differential genes between latent tuberculosis patients and active tuberculosis patients; F: Molecular function analysis of differential genes between patients with active tuberculosis and patients with post-treatment tuberculosis; G: Pathway enrichment analysis of differential gene pathways between latent tuberculosis patients and active tuberculosis patients; H: Enrichment analysis of differential gene pathways between patients with active tuberculosis and patients with post-treatment tuberculosis)

2.3 蛋白互作分析和關鍵基因篩選

建立 PPI 網絡后，進一步對前十位的 Hub 基因進行分析，以篩選潛在生物標志物并深入探究結核病發(fā)生發(fā)展的分子機制。潛伏期結核患者與活動性結核患者相比，TOP 10 Hub 基因分別為 CXCL10、ISG15、OAS3、XAF1、OAS1、IFIT3、GBP1、RSAD2、GBP5、IFI44（圖 3A）。活動性結核患者與治療后結核患者相比，TOP 10 Hub 基因有上調基因 IL-10、NOTCH1、MMP9、SPI1、CREB1，下調基因 CTNNB1、JUN、ELAVL1、HSPA5、CYCS（圖3B）。同時，韋恩圖（圖 3C）結果顯示 HD-LTBI 組、TB-LTBI 組無共同差異基因；HD-LTBI 組、TB-TB after treatment 組有 2 個共同差異基因，分別是 PSMA7 和 IFI27；LTBI-TB 組、TB-TB after treatment 組有 7 個共同差異基因，分別是 CASP5、FCGR1A、IFIT3、SAMHD1、SLC26A8、TNFSF13M、AP7。

2.4 免疫浸潤分析

隨后通過 CIBERSORT 算法對健康人群和活動性結核患者的全血轉錄組測序數據進行了 22 種免疫細胞浸潤分析并繪制了免疫細胞浸潤豐度圖（圖 4）。結果顯示，無論是在健康人群還是活動性結核患者中，單核細胞在免疫微環(huán)境中豐度最高。通過比較后發(fā)現，活動性結核患者外周血中 CD8+T 細胞、活化的 NK 細胞、單核巨噬細胞、活化的肥大細胞、樹突狀細胞等均顯著增高，記憶 B 細胞、幼稚 CD4+T 細胞、活化的記憶 CD4+T 細胞、Treg 細胞、靜息的 NK 細胞比例有所降低。

3 討論

結核病是一種主要由結核分枝桿菌感染而引起的嚴重危害健康的慢性呼吸道傳染性疾病，主要累及肺部，同時也累及全身的其他組織器官[1]。宿主免疫反應與結核病的發(fā)病機制密切相關，但其具體的發(fā)病機制尚不完全清楚，一般認為以細胞免疫為主，近年來固有免疫的作用日益受到重視[4-6]。本研究通過將 GEO 數據庫中的研究對象分為健康人群、結核潛伏期患者、活動性結核患者、治療后結核患者四個組別，對全血轉錄數據進行差異基因篩選，并進行數據挖掘和生物信息學分析，以揭示結核病的發(fā)病機制，篩選診斷和治療的生物標志物。

對差異基因進行 GO 和 KEGG 功能分析的結果提示多富集于免疫相關的功能和通路，如 NOD 樣和 RIG 樣受體相關信號通路，通路中的蛋白與固有免疫和適應性免疫抗病毒感染密切相關[7-10]。細胞因子分泌、細胞因子與其受體相互作用、細胞因子及其受體與病毒蛋白的相互作用相關基因也大量富集，宿主免疫微環(huán)境與病毒的相互作用極大影響疾病的進展過程。我們發(fā)現，活動性結核患者與治療后結核患者相比，差異基因富集于 T 細胞活化和大量中性粒細胞相關途徑。Abengozar-Muela 等[11]發(fā)現結核分枝桿菌感染肉芽腫中 CD68+巨噬細胞和 CD8+T 細胞明顯增多，我們的全血免疫細胞浸潤分析也得到了類似的結果。結核分枝桿菌增殖能夠延遲 CD4+T 細胞啟動，使得 T 輔助體（Th）1 向 Th17 反向分化，增加了肺中性粒細胞，從而降低長期生存[5]。蔣秀娣等[12]發(fā)現結核感染期間，患者外周血中性粒細胞的 CD64、TLR2 和 TLR4 的表達水平均明顯升高，且其吞噬功能下降明顯。結核分枝桿菌依賴活性氧（ROS）誘導中性粒細胞胞外誘捕網（NETs）形成，NETs 能夠捕獲和殺傷結核分枝桿菌，同時參與免疫調節(jié)和機體病理損傷過程[13]。

圖 3 PPI 互作分析和關鍵基因篩選

Figure 3 Intersection analysis of PPI network and crucial genes screening

Figure 4 Analysis of immune cell infiltration in healthy subjects and tuberculosis patients

干擾素在結核病的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用[14]。γ-干擾素釋放試驗也在臨床上成為診斷結核感染的一種重要技術手段[15]。我們的分析結果表明，活動性結核患者與結核潛伏期患者相比，干擾素相關基因表達增加且多為排名靠前的關鍵基因。趨化因子 CXCL10，又稱干擾素誘導蛋白IP-10，是 CXCR3 的配體之一[16]。IL-18/IL-37/IP-10 信號復合物作為鑒別結核活動性和潛伏性的潛在生物標志物[17]，CXCL10 還被認為與肺結核治療不良結果風險增加相關，可以作為一種預測預后的生物標志物[18]。此外，Xu 等[19]發(fā)現細胞色素 B-245 β 鏈（CYBB）、基質金屬肽酶 9（MMP9）和 CXCL10 通過趨化和激活巨噬細胞抵抗結核分枝桿菌感染，可作為脊柱結核治療的分子靶點，改善患者的生活質量和預后。2'-5'寡聚腺苷酸合成酶（OAS）是一種干擾素誘導產生的抗病毒蛋白，通過激活 RNA 切割通路被稱為抗病毒反應系統(tǒng)的介質。OAS1、OAS2 和 OAS3 在許多區(qū)分活性結核和潛伏結核感染的基因表達特征中表達上調，其基因表達與分枝桿菌的致病性和毒力有關，能夠限制細胞內致病性分枝桿菌的復制，增強促炎細胞因子的分泌[20]，OASs 還具有其他細胞功能，包括誘導凋亡、增強 IFNα/β 信號轉導、免疫細胞受體調節(jié)和自噬。Leisching 等[21]認為，在結核的晚期，通過 OAS 激活持續(xù)的 RNaseL 表達增強 I 型IFN 信號，OAS 也可表現出免疫調節(jié)能力。鳥苷酸結合蛋白（guanylate-binding protein, Gbp）家族基因，是 IFN-γ 誘導的鳥苷三磷酸酶（GTPase）超家族的一部分，能夠通過激活細胞降解機制，保護細胞免于潛藏侵入的致病菌造成的侵害，GBP1 缺陷和功能喪失后能夠賦予對李斯特菌或分枝桿菌感染的細胞自主免疫。盡管感染后 Gbp 大量產生，但其具體功能和機制仍需進一步探究[22]。

篩選活動性結核患者與治療后結核患者的關鍵基因，結果發(fā)現抗炎細胞因子 IL-10 為最顯著上調基因，IL-10 影響 IFN-γ 的分泌，被認為與結核分枝桿菌的免疫逃避及潛伏性感染有關[23]。然而目前不同研究結果關于 IL-10 的結果并不一致，夏小學等[24]發(fā)現抗結核治療前后結核患者血清 IL-10 表達水平無明顯變化。還有研究發(fā)現肺結核患者治療過程中，治療兩個月末與治療前血清 IL-10 顯著增加，而治療六個月末又恢復到治療前水平[25]。初治、復治肺結核和肺外結核患者外周血 IL-10 水平顯著回升[26]。不同人群隊列的結果不同，這可能與選取的治療時間點有關，說明同一種細胞因子在疾病的不同階段處于動態(tài)變化過程，與疾病進展密切相關。此外，人種差異也會影響分析結果。我們的數據來源主要是外國受試者，所處的環(huán)境和接受的治療方法的差異都可能導致結果有所差異。NOTCH1 基因在活動性結核患者外周血中表達顯著高于潛伏期患者和正常對照者，可能參與肺結核患者外周血中 Th1/Th2 比例變化，尤其與 Th2 細胞比例異常升高相關。CTNNB1 在結核病中可能起關鍵作用，其低表達與感染發(fā)病有關[27]。除了篩選關鍵 Hub 基因外，還通過韋恩圖篩選了不同階段結核患者的差異基因交集，有趣的是，我們發(fā)現干擾素誘導基因 IFIT3 是結核潛伏期患者、活動性結核患者、治療后結核患者的共同差異基因，也是篩選潛伏期和活動期患者的關鍵 Hub 基因。IFIT 是重要的 IFN 誘導基因，包括 IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFIT5，與抗病毒感染關系密切，與既往研究結果相一致[28]。關于 IFIT3 等其他干擾素誘導基因在結核進展中的具體分子機制并不十分明確，有研究發(fā)現被結核分枝桿菌感染人類 THP-1 單核細胞分泌的微粒子 I 型干擾素誘導蛋白，ISG15、IFIT1、IFIT2 和 IFIT3 表達大量增加，促炎細胞因子表達增加，這些蛋白可能成為結核分枝桿菌感染的潛在生物標志物[29]。

本研究利用生物信息學分析的方法對不同病程的結核患者血液中的差異表達基因進行了篩選和進一步分析，證明了 CXCL10、ISG15、OAS3、XAF1、OAS1、IFIT3、GBP1、RSAD2、GBP5、IFI44、IL-10、NOTCH1、MMP9、SPI1、CREB1、CTNNB1、JUN、ELAVL1、HSPA5、CYCS等有作為診斷標記物的可能，未來需要對國內結核患者進行進一步的深入驗證和分析。這些結果對深入了解結核的發(fā)病機制以及篩選結核診斷和治療的潛在生物標志物提供理論依據。

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Bioinformatics analysis of differentially expressed genes in different stages of pulmonary tuberculosis

SHI Jian-quan, WANG Jun, ZHAO Guo-hong, ZHANG Chuang-ye, LIU Yi

Department of ICU (SHI Jian-quan), Department of Tuberculosis (WANG Jun), Beijing Chest Hospital, Capital Medical University, Beijing 101149, China; Department of Medicine, Miyun District Hospital of Traditional Chinese Medicine, Beijing 101500, China (ZHAO Guo-hong); Department of Medicine, Beijing Rectum Hospital, Beijing 100120, China (ZHANG Chuang-ye); Department of Bacteriology and Immunology, Beijing Key Laboratory on Drug-Resistant Tuberculosis Research, Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute/Beijing Chest Hospital, Capital Medical University, Beijing 101149, China (LIU Yi)

Toexplore the changes in gene expression during the progression of tuberculosis disease by bioinformatics analysis and data mining and to further search for potential biomarkers and analyzing the molecular mechanism of tuberculosis occurrence,development and treatment.Whole blood gene chip data sets of tuberculosis patients with different stages were downloaded from GEO database. Genes with different expression were screened by R language, and then analyzed through GO and KEGG pathway. PPI network was built and Hub gene screening was performed.71 differentially expressed genes were obtained from patients with latent and active tuberculosis, and 561 differentially expressed genes were done from post-treated tuberculosis and active tuberculosis patients. In different course of the disease, the enrichment of differentially expressed genes associated with a large number of immune process and pathways, such as the response to type I and type II interferon, the immune receptor activation, inflammasome complex, T cell activation and neutrophil activation, neutrophil degranulation, neutrophils mediated immunity, NOD-like receptor signaling pathway, RIG-like receptor signaling pathway, cytokines-cytokine receptors interaction, tuberculosis, autophagy. CXCL10, ISG15, OAS3, XAF1, OAS1, IFIT3, GBP1, RSAD2, GBP5 and IFI44 were identified as top 10 Hub genes between latent and active tuberculosis patients. IL-10, NOTCH1, MMP9, SPI1, CREB1, CTNNB1, JUN, ELAVL1, HSPA5 and CYCS are top 10 Hub genes between active and post-treated tuberculosis patients.The functional enrichment of differentially expressed genes at different stages of pulmonary tuberculosis progression was closely related to immune responses. Key differentially expressed genes, such as CXCL10, ISG15, OAS3, XAF1, OAS1, IFIT3, GBP1, RSAD2, GBP5, IFI44, IL-10, NOTCH1, MMP9, SPI1, CREB1, CTNNB1, JUN, ELAVL1, HSPA5 and CYCS, may be used as diagnostic markers.

Tuberculosis; differentially expressed genes; bioinformatics

LIU Yi, Email: liuyilotus@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.06.006

首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項（2020-2-1042）；北京市教育委員會科技計劃一般項目（KM202010025001）

劉毅，Email：liuyilotus@hotmail.com

2021-03-15