培養(yǎng)基中細(xì)胞生長因子增強(qiáng)人間充質(zhì)干細(xì)胞成瘤性風(fēng)險

張可華，賈春翠，吳雪伶，納濤，韓曉燕，吳婷婷，孟淑芳

·論著·

培養(yǎng)基中細(xì)胞生長因子增強(qiáng)人間充質(zhì)干細(xì)胞成瘤性風(fēng)險

張可華，賈春翠，吳雪伶，納濤，韓曉燕，吳婷婷，孟淑芳

100050 中國食品藥品檢定研究院生物制品檢定所細(xì)胞資源保藏研究中心

本中心在人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）第三方復(fù)核檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)某些無血清培養(yǎng)基會促使 hMSCs 在軟瓊脂克隆試驗(yàn)中呈現(xiàn)陽性結(jié)果。為進(jìn)一步明確該現(xiàn)象，探索促使 hMSCs 軟瓊脂克隆陽性的培養(yǎng)基成分并深入分析其風(fēng)險。比較幾種不同品牌的商品化無血清培養(yǎng)基對 hMSCs 軟瓊脂克隆形成的影響，通過細(xì)胞因子抗體芯片和 ELISA 定量檢測篩選并初步確定促使軟瓊脂克隆形成的培養(yǎng)基成分，通過在培養(yǎng)基中添加特定成分進(jìn)一步明確該成分對 hMSCs 成瘤性的影響，并通過長期添加試驗(yàn)和細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析該培養(yǎng)基成分持續(xù)作用對 hMSCs 生長和基因轉(zhuǎn)錄方面的影響。研究結(jié)果顯示，部分品牌無血清培養(yǎng)基可促使 hMSCs 在軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)中呈現(xiàn)陽性。培養(yǎng)基成分分析顯示這些培養(yǎng)基中表皮細(xì)胞生長因子（EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）和血小板源性生長因子（PDGF-BB）呈現(xiàn)出較高水平。在含 10% FBS 的完全培養(yǎng)基中分別或組合添加EGF（50 ng/ml）、bFGF（50 ng/ml）和 PDGF-BB（10 ng/ml），均可促使 hMSCs 軟瓊脂克隆形成。以上述濃度添加生長因子持續(xù)培養(yǎng) hMSCs 10 代后，再撤掉生長因子繼續(xù)培養(yǎng) 3 代，細(xì)胞增殖和基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生顯著改變。培養(yǎng)基中含有的高濃度 EGF、bFGF 和 PDGD-BB 等生長因子成分能夠增強(qiáng) hMSCs 成瘤性風(fēng)險，用這些生長因子長期培養(yǎng) hMSCs 可對細(xì)胞增殖和基因轉(zhuǎn)錄造成顯著影響。本研究提示在 hMSCs 類細(xì)胞治療產(chǎn)品工藝研發(fā)中，需高度關(guān)注培養(yǎng)基關(guān)鍵成分對 hMSCs 特性的影響，結(jié)合成瘤性分析優(yōu)化并篩選最適培養(yǎng)基。

間充質(zhì)干細(xì)胞； 成瘤性； 表皮細(xì)胞生長因子； 成纖維細(xì)胞生長因子； 血小板源性生長因子； 軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)

人間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）是一類具有一定程度的自我復(fù)制更新、多譜系分化能力的成體干細(xì)胞，廣泛存在于人體各組織中，具有獨(dú)特的免疫調(diào)控和促進(jìn)組織再生功能[1-3]。由于 hMSCs 來源相對容易和制備方法相對簡單，具有十分廣泛的臨床適應(yīng)證，已成為目前干細(xì)胞治療研究領(lǐng)域中發(fā)展最為迅速的一類[4-7]。截至 2021 年第一季度，國際上有 10 余例 hMSCs 類藥物問世，在我國有 13 項(xiàng) hMSCs 臨床試驗(yàn)獲國家藥品審評中心默示許可，此外還有 60 余項(xiàng) hMSCs 干細(xì)胞臨床研究項(xiàng)目在國家衛(wèi)生健康委和國家藥品監(jiān)督管理局成功備案。

盡管與胚胎干細(xì)胞、iPSC 等多能干細(xì)胞相比，研究普遍認(rèn)為 hMSCs 成瘤性風(fēng)險較小，但成瘤性檢查仍是 hMSCs 安全性風(fēng)險重要考慮因素之一。采用裸鼠體內(nèi)接種法進(jìn)行細(xì)胞成瘤性檢查是各國藥典收錄且被監(jiān)管部門廣為接受的標(biāo)準(zhǔn)性試驗(yàn)方法，但同時，對于某些弱成瘤性細(xì)胞，體外成瘤性檢查方法也能夠反映細(xì)胞成瘤性的一種或幾種性質(zhì)，可作為體內(nèi)法的補(bǔ)充和參考。軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)是常用的體外成瘤性檢查方法之一，它可以評價細(xì)胞的錨定非依賴性生長能力，而這種錨定非依賴性生長也是腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞所具有的生長特性之一[8]，可以間接地反映細(xì)胞成瘤性風(fēng)險。我們前期大量的研究數(shù)據(jù)顯示，不同來源的 hMSCs 普遍表現(xiàn)為成瘤性陰性的特性，即裸鼠體內(nèi)接種試驗(yàn)陰性，即在接種部位以及各臟器不會形成結(jié)節(jié)；體外軟瓊脂克隆形成陰性，即在軟瓊脂中不會形成包含 16 個以上活細(xì)胞的細(xì)胞克??；端粒酶活性陰性。

但隨著 hMSCs 產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，hMSCs 培養(yǎng)體系出現(xiàn)多樣化，如科研常用的含胎牛血清（FBS）或牛血清提取物的培養(yǎng)體系、含人血液來源成分（如血小板裂解物）的培養(yǎng)體系以及成分明確的無血清培養(yǎng)體系。不論是從降低外源因子污染引入風(fēng)險，還是從培養(yǎng)基生產(chǎn)可控性以及監(jiān)管角度來講，作為治療用藥品開發(fā)的 hMSCs 產(chǎn)品也在被推薦或建議使用無血清培養(yǎng)體系，目前國內(nèi)外已開發(fā)出幾種適用于 hMSCs 的成分明確的無血清培養(yǎng)基，已申報干細(xì)胞臨床備案第三方復(fù)核檢驗(yàn)的研發(fā)機(jī)構(gòu)中，自 2018 年以來有 38.2% 開始采用成分無血清培養(yǎng)基進(jìn)行 hMSCs 培養(yǎng)。但這些成分明確的無血清培養(yǎng)基中常常會添加多種促進(jìn)細(xì)胞增殖的細(xì)胞生長因子、激素或小分子化合物，如成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、血小板源性生長因子（PDGF）、表皮生長因子（EGF）和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）等，這些添加物的成分和濃度與細(xì)胞在體內(nèi)時的環(huán)境差別可能相對較大，除有效促進(jìn)細(xì)胞生長外，對細(xì)胞產(chǎn)品的安全性和有效性影響尚不明確。

近年來，我們中心在 hMSCs 第三方復(fù)核檢驗(yàn)過程中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)某些無血清培養(yǎng)基可促使 hMSCs 出現(xiàn)軟瓊脂克隆形成陽性，提示成瘤性風(fēng)險可能有所增大，因此，為進(jìn)一步明確該問題，并分析造成此結(jié)果的原因，我們開展了相關(guān)研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及培養(yǎng) CCRC1-hMSCs-S1 為本中心收集和保藏并用于試驗(yàn)對照的臍帶來源 hMSCs[9]；其他臍帶來源 hMSCs 為在本中心進(jìn)行第三方復(fù)核的樣本，并均在本中心完成了全面的 hMSCs 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)內(nèi)容包括細(xì)胞鑒別、活性、純度、微生物學(xué)安全性、分化能力、免疫調(diào)控能力檢測以及體內(nèi)外成瘤性檢測等。

hMSCs 常規(guī)培養(yǎng)培養(yǎng)基為含 10% FBS的 α-MEM。陽性對照細(xì)胞 HeLa-S3 為本室保存，細(xì)胞編號為 CCBC003，代次為 Pn10 ～ Pn14，STR 圖譜正確，無細(xì)菌及支原體污染，培養(yǎng)基為含 10% FBS 的 α-MEM。

1.1.2 試劑 α-MEM 培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國 Hyclone 公司；FBS、胰蛋白酶、Trizol 為美國 Thermo Fisher Scientific 的 Gibco 品牌；瓊脂糖、結(jié)晶紫購自美國 Sigma-Aldrich 公司；bFGF、EGF、PDGF-BB 購自 Peprotech；bFGF和 EGF ED50< 0.1 ng/ml，相應(yīng)的比活性≥ 1 ×107units/mg，PDGF-BB ED50為 1.0 ～ 3.0 ng/ml；Human EGF ELISA Kit 和 Human FGF basic ELISA Kit 購自愛必信（上海）生物科技有限公司；Human PDGF-BB Quantikine ELISA Kit 購自美國R&D 公司；抗體芯片 Human Cytokine Antibody Array G-Series 2000 為美國 Raybiotech 公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)錄組測序建庫試劑盒為 VAHTS Universal V6 RNA-seq Library Prep Kit for Illumina；本研究中所分析的 6 種不同品牌的無血清培養(yǎng)基 SFM 1 ～ 6 均為 hMSCs 產(chǎn)品研發(fā)機(jī)構(gòu)常用的商品化無血清培養(yǎng)基。

1.1.3 關(guān)鍵設(shè)備 Cytation 5 細(xì)胞成像多模式檢測儀為美國 Biotek 公司產(chǎn)品；GenePix 4000B 芯片掃描儀購自美國 Molecular Devices 公司；IX53 倒置熒光顯微鏡購自日本 Olympus 公司；轉(zhuǎn)錄組測序由武漢華大基因科技有限公司完成，所用測序儀為 Illumina Hiseq 平臺。

1.2 方法

1.2.1 軟瓊脂克隆形成試驗(yàn) 待檢細(xì)胞和陽性對照細(xì)胞用 0.25% 胰蛋白酶消化成單細(xì)胞，離心重懸后用細(xì)胞篩過濾計數(shù)。瓊脂糖用 PBS 配制成 5% 濃度，經(jīng)高壓滅菌后形成 5% 瓊脂糖凝膠，稍待冷卻后與預(yù)熱至 39 ℃的含 FBS 培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基混勻配成 0.5% 底層凝膠，以 1.5 ml/孔加到 6 孔板中，置于4 ℃冷卻備用。將 5% 瓊脂糖凝膠、相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞懸液三者混勻制備成終濃度為 0.3% 瓊脂糖和 2000 個/ml 的上層凝膠，混勻后以 1.5 ml/孔加到底層凝膠上，立即置于 4 ℃環(huán)境中，約 10 min 上層瓊脂凝固。從4 ℃取出加入 1 ～ 2 ml 相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基覆蓋于凝膠表面，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3 周，期間每3 ～ 5 天更換表層培養(yǎng)基。培養(yǎng)終止后用 0.025% 結(jié)晶紫染料或 Hoechst 33342 熒光染料對細(xì)胞染色，在顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆形成情況。細(xì)胞克隆計數(shù)采用細(xì)胞成像多模式檢測儀拍照、計數(shù)并計算每一個細(xì)胞克隆的面積，克隆內(nèi)細(xì)胞數(shù)≥ 16 個或克隆面積≥ 1000 μm2視為陽性克隆。

1.2.2 抗體芯片檢測 取新鮮配制的含 10% FBS 的 α-MEM 培養(yǎng)基和各品牌的無血清培養(yǎng)基檢測。檢測步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，簡要描述如下：將玻片取出，室溫干燥 2 h，每孔加入 100 μl 的封閉液，室溫?fù)u床上孵育 30 min。吸棄緩沖液后加入 100 μl樣品到孔中，設(shè)復(fù)孔，4 ℃孵育過夜。吸棄樣本，150 μl洗液 I 洗 5 次，150 μl洗液 II 洗5 次，每次洗時在搖床上振蕩 5 min。加入新鮮配好的檢測抗體 80 μl/孔，室溫?fù)u床上孵育 1.5 h 后用洗液 I 和洗液 II 洗滌。加入 Cy3-鏈霉親和素80 μl/孔，在搖床上避光孵育 1 h 后用洗液 I 清洗5 次，洗液 II 清洗 5 次。拆掉玻片框架，用洗液 I 洗 10 min，洗液 II 洗 2 min，去離子水沖洗玻片，避光晾干。用芯片掃描儀采集信號，采用 Cy3 或者綠色通道（激發(fā)頻率= 532 nm）。

1.2.3 ELISA 檢測 將各品牌無血清培養(yǎng)基用試劑盒中的稀釋液分別稀釋 10、100 和 1000 倍檢測。bFGF、EGF、PDGF-BB 檢測按照廠家說明書進(jìn)行。簡述如下：按照試劑盒說明系列稀釋配置標(biāo)準(zhǔn)溶液，將稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品分別加入到相應(yīng)孔中，100 μl/孔，設(shè)復(fù)孔。室溫孵育 2 h，用 1 × 洗滌液洗板 3 次。加入 100 μl鏈霉親和素-HRP，室溫孵育 20 min，用 1 × 洗滌液洗板 3 次。加入新鮮配制的顯色底物 100 μl，室溫孵育 15 min，加入 50 μl終止液。使用酶標(biāo)儀檢測 450 nm處吸光度值（450），參考波長設(shè)為 540 nm。將每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的校正吸光度值（450～540）復(fù)孔讀數(shù)取平均值，然后減去零標(biāo)準(zhǔn)品平均值。采用四參數(shù)邏輯回歸曲線（4-PL）擬合創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算出樣本濃度，乘以稀釋倍數(shù)后即為待測樣本實(shí)際含量。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組測序 收集添加不同生長因子培養(yǎng)至各個代次的 CCRC1-hMSCs-S1約 5 × 106個，用 PBS 洗滌后加入 1 ml Trizol 試劑，提取總 RNA。使用 DNaseI 消化后，應(yīng)用 Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測 RNA 濃度和完整性，用帶有 Oligo（dT）的磁珠富集 mRNA，加入破碎緩沖液將其打斷成短片段，以 mRNA 為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成第一條 cDNA 鏈，然后加入 RNase H 和 DNA 聚合酶 I 合成第二條 cDNA 鏈。經(jīng)純化后的雙鏈 cDNA 末端修復(fù)、加 poly A 尾并連接測序接頭，PCR 擴(kuò)增，使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 對文庫的插入片段范圍進(jìn)行檢測以及使用 ABI StepOnePlus Real-Time PCR System 對文庫的濃度進(jìn)行定量，質(zhì)檢合格后，使用 Illumina HiSeq 測序儀進(jìn)行測序。

對測序得到的 raw data 過濾后得到 clean reads 比對到參考序列 hg19?；诒葘Y(jié)果進(jìn)行基因定量分析，根據(jù)基因在不同樣品組中的表達(dá)量進(jìn)行差異表達(dá)分析，對篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 功能分析、KEGG 通路功能分析、聚類分析等。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 抗體芯片數(shù)據(jù)分析、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析、細(xì)胞克隆數(shù)量和面積分析以及做圖采用 R語言中的 tidyverse、ggplot2、pheatmap、factoextra、DESeq2 和 clusterProfiler 等包。轉(zhuǎn)錄組測序熱圖分析采用 pheatmap 包，各組待分析細(xì)胞的篩選條件為 CV（FPKM）> 0.5且 max（FPKM）> 10。

2 結(jié)果

2.1 無血清培養(yǎng)促使 hMSCs 軟瓊脂克隆試驗(yàn)結(jié)果陽性

在 hMSCs 第三方質(zhì)量復(fù)核檢驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)一些使用無血清培養(yǎng)基工藝生產(chǎn)的 hMSCs 軟瓊脂克隆試驗(yàn)呈現(xiàn)陽性結(jié)果，為進(jìn)一步證實(shí)該現(xiàn)象，我們選用一株常規(guī)用含 10% FBS 的 α-MEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)且軟瓊脂克隆試驗(yàn)陰性的臍帶來源 hMSCs 細(xì)胞株進(jìn)行研究。對該細(xì)胞用 6 種無血清培養(yǎng)基 SFM 1 ～ 6 或 10% FBS 的培養(yǎng)基配制瓊脂糖膠進(jìn)行軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)，培養(yǎng) 21 d 后對細(xì)胞克隆形成數(shù)量和克隆面積進(jìn)行分析。結(jié)果顯示在 SFM 4、5 和 6 無血清培養(yǎng)基組可見一定數(shù)目的明顯的陽性細(xì)胞克隆，克隆數(shù)分別為 24、32 和 21 個，陽性克隆的平均面積為 1627.7、1865.3 和 1958.5 μm2，而在含 10% FBS 培養(yǎng)基和 SFM 1、2 和 3 無血清培養(yǎng)基組中未見到陽性克隆形成（表 1，圖 1）。陽性對照細(xì)胞 HeLa-S3 結(jié)果為陽性，表明試驗(yàn)成立。

2.2 促使軟瓊脂克隆陽性的無血清培養(yǎng)基含有較高的生長因子

為了研究無血清培養(yǎng)基促進(jìn)細(xì)胞軟瓊脂克隆形成的原因，通過細(xì)胞因子抗體芯片分析了 4 種無血清培養(yǎng)基（SFM 1、SFM 4、SFM 5、SFM 6）中 174 種細(xì)胞生長因子的情況。這 4 種無血清培養(yǎng)基中均檢測到了大量的細(xì)胞因子、生長因子、趨化因子。分析結(jié)果顯示，在這些檢測到的因子中，與其他細(xì)胞因子相比，PDGF-BB、EGF 和 bFGF 這3 種生長因子在 4 種無血清培養(yǎng)基中的含量均排在前列（圖 2A），其中 EGF 在 SFM 4、5 和 6 中的含量明顯高于 SFM 1（圖 2B）。對這4 種無血清培養(yǎng)基中的 EGF、bFGF 和 PDGF-BB 3 種生長因子的定量檢測結(jié)果顯示，不同的無血清中添加的這 3 種因子的含量差別明顯，其中 EGF 在 SFM 4、5 和 6 中含量均比較高，分別為41.2、63.0 和 11.7 ng/ml，在 SFM 1 ～ 3 中則均< 1.1 ng/ml。bFGF 在 SFM 4 中含量最高，為55.0 ng/ml，其他組均 < 3.6 ng/ml。PDGF-BB 則在 SFM 6、1 和 5 中表達(dá)最高，分別為 5.1、3.8 和1.8 ng/ml，其他組均 < 0.8 ng/ml（圖 2C）。

表 1 不同的培養(yǎng)基條件下 hMSCs 軟瓊脂克隆形成情況

圖 1 不同培養(yǎng)基對 hMSCs 軟瓊脂克隆形成的作用（A：hMSCs 在不同培養(yǎng)基條件下形成克隆的數(shù)量和面積，SFM：無血清培養(yǎng)基；PS：陽性對照細(xì)胞 HeLa-S3；B：細(xì)胞克隆的代表性圖片，比例尺：500 μm）

Figure 1 Cell colony formation in soft agar of hMSCs under different culture conditions (A: Numbers and areas of cell colonies formed by hMSCs, SFM: Serum free medium; PS: Positive control cell HeLa-S3; B: Representive picture of cell colonies, scale:500 μm)

2.3 添加生長因子促使 hMSCs 軟瓊脂克隆試驗(yàn)結(jié)果陽性

為進(jìn)一步驗(yàn)證這 3 種生長因子對 hMSCs 成瘤性的影響，我們用前期開發(fā)的 hMSCs標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株 CCRC1-hMSCs-S1 進(jìn)行了分析，該細(xì)胞在含 10% FBS 的 α-MEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)中軟瓊脂克隆檢測為陰性。在含血清的完全培養(yǎng)基中將這 3 種細(xì)胞因子分別或組合添加后進(jìn)行軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)，終濃度分別為 EGF 50 ng/ml、bFGF 50 ng/ml 及 PDGF-BB 10 ng/ml。結(jié)果顯示在完全培養(yǎng)基中分別添加 EGF（E 組）、bFGF（F 組）、PDGF-BB（P 組）以及混合添加 3 種因子（E/F/P 組）克隆形成為陽性，陽性克隆數(shù)分別為 6、23、5 和25 個/孔，且 3 種因子混合添加組（E/F/P 組）陽性克隆面積最大，最大克隆達(dá)到 3389 μm2，陽性克隆平均面積（2058.3 ± 1092.1）μm2（圖 3，表 2）。這些結(jié)果表明細(xì)胞培養(yǎng)基中的 EGF、bFGF 和 PDGF-BB 細(xì)胞生長因子水平升高到一定濃度時能促使原本軟瓊脂克隆陰性的 hMSCs 轉(zhuǎn)為陽性，有可能增加 hMSCs 成瘤的安全性風(fēng)險。

2.4 添加生長因子長期培養(yǎng)后hMSCs基因表達(dá)發(fā)生不可逆的改變

為了進(jìn)一步闡明含有較高濃度的 EGF、bFGF 和 PDGF-BB 的培養(yǎng)基長期培養(yǎng) hMSCs 后會對細(xì)胞產(chǎn)生的影響，仍以 CCRC1-hMSCs-S1 為模型，在培養(yǎng)基中按如上濃度分別或混合添加這3種生長因子，將 hMSCs 從 P10 代培養(yǎng)至 P20 代，之后再更換為未添加生長因子的原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至 P23 代（圖 4A）。結(jié)果顯示，添加細(xì)胞生長因子后細(xì)胞形態(tài)變得更小更細(xì)長，增殖速度明顯加快（圖 4B），其中以添加 bFGF 組和 3 種生長因子組變化更為顯著。隨著培養(yǎng)時間延長，添加生長因子組和未添加的對照組相比，形態(tài)和增殖變化差異逐漸變小，培養(yǎng)到 P20 時不同組之間基本未見差異。然而，撤出生長因子后，添加因子組細(xì)胞明顯呈現(xiàn)形態(tài)大而扁圓的老化特征，尤其是再次培養(yǎng)3 代后，撤出生長因子組細(xì)胞寬度顯著增大（圖 4C、4D），細(xì)胞增殖速度也相應(yīng)降低。

圖 2 無血清培養(yǎng)基成分檢測（A：細(xì)胞因子抗體芯片檢測 SFM 1、4、5、6 中細(xì)胞因子水平，圖示平均水平最高的 36 種細(xì)胞因子；B：表達(dá)水平最高的 9 種細(xì)胞因子分別在 SFM 1、4、5、6 中的表達(dá)情況；C：ELISA 測定 SFM 1、2、3、4、5 和 6 中 EGF、bFGF 和 PDGF-BB 的濃度）

Figure 2 SFM composition analysis (A: The level of 36 cytokines in SFM 1, 4, 5, and 6 semi-quantified by cytokine antibody array; B: The level of top 9 cytokines in SFMs; C: EGF, bFGF, and PDGF-BB levels in SFMs quantified by ELISA)

取添加生長因子后培養(yǎng)至 P15 代、P17 代、P20 代以及撤掉因子后至 P23 代的hMSCs 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果顯示各組細(xì)胞在添加生長因子后基因表達(dá)出現(xiàn)顯著變化，尤其是培養(yǎng)到 P20 后同初始細(xì)胞相比出現(xiàn)完全不同的基因表達(dá)模式，撤出生長因子后基因表達(dá)模式再次發(fā)生改變，且同最初始狀態(tài) P10 代細(xì)胞存在顯著差異（圖 5A）。這些結(jié)果表明較高濃度生長因子長期培養(yǎng) hMSCs 的基因表達(dá)模式同基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下存在顯著差異，且差異不因生長因子的撤除而發(fā)生逆轉(zhuǎn)。以 E/F/P 組為代表進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，結(jié)果顯示同初始細(xì)胞狀態(tài)相比，表達(dá)倍數(shù)改變在 2 倍以上的差異基因在 P20 和 P23 代顯著增多，P20 代細(xì)胞上調(diào)、下調(diào)基因分別為 445 和 950 個，P23 代細(xì)胞分別為 406 和 1218 個（圖 5B）。對 E/F/P組差異基因進(jìn)行 KEGG 信號通路分析，P20 代細(xì)胞上調(diào)基因多為參與蛋白合成和絲裂原活化蛋白激酶通路相關(guān)蛋白，下調(diào)基因多為負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期和有絲分裂的蛋白以及細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白（圖 5C）；相反，P23 代細(xì)胞上調(diào)基因則多為細(xì)胞衰老和 TGF-β 信號通路相關(guān)蛋白，而下調(diào)蛋白則多為 DNA 復(fù)制和蛋白質(zhì)合成的相關(guān)基因（圖 5D）?；虮磉_(dá)信號通路分析結(jié)果與細(xì)胞增殖和衰老表現(xiàn)相一致。此外，還觀察到腫瘤相關(guān)基因、matrix metallopeptidase 1（1）、RAS like proto-oncogene A（）在添加生長因子培養(yǎng)至 P17 ～ P20 代時 mRNA 表達(dá)水平顯著上調(diào)，特別是 E/F/P 組表達(dá)水平最高。在撤除生長因子后這些基因水平將會下降至低于對照組水平（圖 5E）。

Figure 3 Cytokines could induce colony formation of hMSCs in soft agar (A: Numbers and areas of colonies formed by CCRC1-hMSCs-S1 under different conditions; B: Showed the representive colonies, scale: 500 μm)

表 2 添加生長因子 hMSCs 軟瓊脂克隆形成情況

3 討論

細(xì)胞在瓊脂內(nèi)非錨定性生長是惡性腫瘤細(xì)胞的重要特性之一，軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)是研究細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的金標(biāo)準(zhǔn)，也常常用來評價細(xì)胞惡性程度，作為抗腫瘤藥物篩選指標(biāo)。許多研究表明，軟瓊脂克隆形成能力與動物體內(nèi)成瘤性具有相關(guān)性。例如，在研究腫瘤組織中存在少量側(cè)群細(xì)胞（SP）的特性時發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤細(xì)胞（卵巢癌、宮頸癌、肺癌等）的 SP 細(xì)胞軟瓊脂克隆形成率較非側(cè)群細(xì)胞明顯升高，且注射到免疫缺陷小鼠體內(nèi)腫瘤形成率和腫瘤的大小均明顯高于非側(cè)群細(xì)胞，兩者具有高度的一致性[10-12]。在對一些關(guān)鍵致癌基因過表達(dá)或敲除后，癌細(xì)胞軟瓊脂克隆陽性特性和體內(nèi)成瘤性同時增強(qiáng)或減弱，兩者也呈現(xiàn)一致性[13-15]。軟瓊脂克隆形成所反映的細(xì)胞非錨定性生長能力是與體內(nèi)成瘤最相關(guān)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞特性[16]，而且該試驗(yàn)具有檢測時限短，待測細(xì)胞需要量少，符合動物福利 3R 原則，在國際及國外相關(guān)法規(guī)或指導(dǎo)原則中，將其作為體內(nèi)成瘤性檢查的補(bǔ)充。另外，軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)檢測靈敏度較動物體內(nèi)接種法更高，有研究者將軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)同熒光染色和圖像捕捉和識別技術(shù)相結(jié)合，檢測 hMSCs 中混有的 HeLa 細(xì)胞時的最低檢測限（LOD）可達(dá)到 0.00001%，即單個 HeLa 細(xì)胞即可檢測出[17]。相比較而言，免疫缺陷動物體內(nèi)接種 HeLa 細(xì)胞，檢出限通常在 104細(xì)胞/只動物，當(dāng)前最靈敏的檢測方法也至少需要 101個 HeLa 細(xì)胞[18]。這些特點(diǎn)使得軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)特別適用于細(xì)胞治療類產(chǎn)品的成瘤性檢查[19-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，可促使軟瓊脂克隆形成陽性的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的 hMSCs 進(jìn)行裸鼠體內(nèi)接種法檢查，在接種部位未觀察到結(jié)節(jié)，這表明此條件下（一般為培養(yǎng) 5 ～ 10 代）細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化程度未達(dá)到體內(nèi)成瘤，但已到達(dá)軟瓊脂克隆形成檢測的靈敏度范圍，提示具有成瘤性風(fēng)險。

Figure 4 Morphologic changes of hMSCs after growth factors treatment [A: Schematic illustrating of the experiment. HMSCs before P10 were grown in complete culture medium containing 10% FBS. From P10 to P20, the cells were treated with 50 ng/ml of EGF, 50 ng/ml of bFGF, 10 ng/ml of PDGF-BB, and then were passaged to P23 with complete cultrue medium. The cells of P10, P15, P17, P20 and P23 were collected for RNA-Seq; B: Morphologic changes of hMSCs in treatment of growth factors (ctl: control; E: EGF; F: bFGF; P: PDGF-BB); C: Cell width of hMSCs with different treatments; D: The representive figure of hMSCs (ctl vs E/F/P)]

含 FBS 的培養(yǎng)基是 hMSCs 前期研究中最常用的培養(yǎng)基，hMSCs 的大多數(shù)生物學(xué)特性包括低成瘤性風(fēng)險的資料大都是在此培養(yǎng)條件下得到的。在 hMSCs 臨床轉(zhuǎn)化或藥物開發(fā)過程中，國內(nèi)外監(jiān)管部門基于安全性考慮建議盡可能替換掉動物源性原材料，改為更加安全的成分明確的培養(yǎng)基。在這一原則下，許多國內(nèi)干細(xì)胞研發(fā)機(jī)構(gòu)在進(jìn)行培養(yǎng)基的更新選擇。但本研究結(jié)果明確了某些無血清培養(yǎng)基促使 hMSCs 出現(xiàn)軟瓊脂克隆形成陽性，培養(yǎng)基中添加的 bFGF、EGF和 PDGF-BB 三種生長因子可以促使原本不具有錨定非依賴性生長能力的 hMSCs 獲得此能力。此外，高濃度生長因子長期培養(yǎng)的 hMSCs 生長特性和基因轉(zhuǎn)錄組會發(fā)生顯著變化。同時，從本研究也明確提示，無血清培養(yǎng)基成分選擇和配比對細(xì)胞生物學(xué)特性有非常大的影響，選擇無血清培養(yǎng)基時不僅要考察細(xì)胞的增殖、老化、凋亡等活性因素，促使分化、免疫調(diào)控等干性和生物學(xué)有效性因素，同樣要關(guān)注細(xì)胞成瘤性風(fēng)險。

圖 5 生長因子長期處理hMSCs 轉(zhuǎn)錄組分析[A：轉(zhuǎn)錄組測序熱圖分析，1 ～ 5 分別為圖 4A 所示 P10、P15、P17、P20 和P23 代細(xì)胞，6 為未添加生長因子從 P10 傳代至 P23 代細(xì)胞；B：E/F/P 組各代次細(xì)胞同P10 代細(xì)胞相比，差異表達(dá)基因數(shù)量，其中FoldChange > 2 視為上調(diào)基因，F(xiàn)oldChange < 0.5 視為下調(diào)基因；C ～ D：E/F/P 組P20 代細(xì)胞（C）以及 P23 代細(xì)胞（D）與初始P10 代細(xì)胞差異基因的KEGG 通路分析，上圖為上調(diào)基因，下圖為下調(diào)基因；E：Myc、MMP1 和RALA基因在各組表達(dá)情況]

Figure 5 RNA-seq analysis of hMSCs treated with grow factors [A: Heat map analysis of gene expression of hMSCs. 1 - 5: P10, P15, P17, P20 and P23 cells as described in Fig4 A; 6: control P23 cells which were expanded from P10 without any additional grow factors during the whole procedure of culture; B: Numbers of differentally expressed gene between P10 and other passages in hMSCs treated with E/F/P. Genes with Foldchange > 2 were regarded as up-regulated genes, and those with Foldchange < 0.5 were regarded as down-regulated gene; C - D: KEGG pathway analysis of gene expression of hMSCs between P10 and P20 (C), or P10 and P23 (D); Upper: up-regulated genes; bottom: down-regulated genes; E: Gene expression levels (FPKM values) of,1, andin different groups of cells as indicated in figure]

據(jù)報道，bFGF、PDGF 均可促使二倍體成纖維細(xì)胞發(fā)生錨定非依賴性生長[23-25]，其中 PDGF-D 甚至促使 NIH3T3 成纖維細(xì)胞發(fā)生顯著惡性轉(zhuǎn)化，不僅軟瓊脂克隆陽性，且在裸鼠體內(nèi)成瘤[24, 26-28]。EGF 和 TGF-β 組合也具有相似的作用[26]。細(xì)胞生長因子通過細(xì)胞表面受體激活受體酪氨酸激酶，進(jìn)而激活 MAPK-PI3K-Akt 通路、STAT 家族、Src 家族酪氨酸激酶，磷脂酶 C-γ、SHP-2 酪氨酸磷酸酶通路等向細(xì)胞傳遞促進(jìn)增殖、存活和遷移的信號。生長因子信號通路過度激活與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。不僅如此，F(xiàn)GF、EGF、PDGF 以及TGF-β 等有細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用的生長因子胞內(nèi)信號通路之間存在一定程度的交叉和協(xié)同促進(jìn)作用，多種生長因子的組合會使細(xì)胞轉(zhuǎn)化的風(fēng)險大大增加。本研究中也發(fā)現(xiàn)添加 EGF、bFGF和 PDGF-BB 培養(yǎng) hMSCs7 代以后腫瘤相關(guān)基因、1和表達(dá)水平均有顯著升高，高于單獨(dú)添加其中一種生長因子組。EGF、bFGF 和 PDGF-BB 長期培養(yǎng)除了增加 hMSCs 成瘤性風(fēng)險以外，結(jié)果還表明會對細(xì)胞增殖產(chǎn)生極大影響。表現(xiàn)為在完全培養(yǎng)基中添加生長因子高度促進(jìn)細(xì)胞增殖，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生高速增殖相應(yīng)的變化，如細(xì)胞變小，更細(xì)長，折光明顯；然而撤掉生長因子后細(xì)胞明顯出現(xiàn)增殖緩慢，甚至生長停滯。推測其原因一方面是由于生長因子促進(jìn)細(xì)胞增殖，細(xì)胞的群體倍增時間縮短，細(xì)胞形態(tài)變小，會導(dǎo)致同樣傳代至 P20 代，實(shí)際擴(kuò)增倍數(shù)（實(shí)際代次）遠(yuǎn)高于未添加生長因子組，因此撤掉生長因子后細(xì)胞老化程度更加明顯。另一方面，生長因子持續(xù)處理導(dǎo)致細(xì)胞本身逐漸適應(yīng)高水平生長因子環(huán)境，基因表達(dá)也發(fā)生了改變，撤掉生長因子后則不能適應(yīng)低生長因子環(huán)境。在臨床應(yīng)用細(xì)胞治療時，此類 hMSCs 進(jìn)入人體后將會由高濃度生長因子環(huán)境改變?yōu)轶w內(nèi)環(huán)境，其體內(nèi)增殖、老化和生物學(xué)活性需要進(jìn)一步研究和闡明。

本研究中所用到的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株 CCRC1-hMSCs-S1 為一株符合 MSC 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、各質(zhì)量屬性均具代表性的臍帶組織來源 MSC，在含 FBS 的培養(yǎng)條件下可傳代至 30 代后出現(xiàn)衰老特征，穩(wěn)定性檢測表明在 20 代之前細(xì)胞活性、生物學(xué)有效性等質(zhì)量屬性均穩(wěn)定，具有較好的代表性。臨床應(yīng)用 hMSCs 代次常在 P5 代之前，生長特性和成瘤性特性可能存在不同，需要進(jìn)一步闡明。綜上所述，hMSCs 類細(xì)胞治療產(chǎn)品在工藝研發(fā)中，需高度關(guān)注培養(yǎng)基關(guān)鍵成分對hMSCs 特性的影響，特別是對于 EGF、bFGF 和 PDGF 這類能促進(jìn)成瘤性的細(xì)胞因子，對其添加量、組合配比進(jìn)行詳細(xì)研究，對細(xì)胞成瘤性、活性以及生物學(xué)有效性等方面綜合考察，選擇適宜的培養(yǎng)基。

[1] Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science, 1999, 284(5411): 143-147.

[2] Parekkadan B, Milwid JM. Mesenchymal stem cells as therapeutics. Annu Rev Biomed Eng, 2010, 12:87-117.

[3] Zhang KH, Na T, Han XY, et al. Immunomodulatory properties-based strategy for the assessment of biological effectiveness of mesenchymaistem cells. Chin J New Drugs, 2016, 25(3):283-290. (in Chinese)

張可華, 納濤, 韓曉燕, 等. 基于免疫調(diào)控功能的間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)有效性質(zhì)量評價策略. 中國新藥雜志, 2016, 25(3):283-290.

[4] Wang Y, Chen X, Cao W, et al. Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications. Nat Immunol, 2014, 15(11):1009-1016.

[5] Alfaifi M, Eom YW, Newsome PN, et al. Mesenchymal stromal cell therapy for liver diseases. J Hepatol, 2018, 68(6):1272-1285.

[6] Moreira A, Kahlenberg S, Hornsby P. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for diabetes. J Mol Endocrinol, 2017, 59(3): R109-R120.

[7] Volkman R, Offen D. Concise review: mesenchymal stem cells in neurodegenerative diseases. Stem Cells, 2017, 35(8):1867-1880.

[8] Sato Y, Bando H, Di Piazza M, et al. Tumorigenicity assessment of cell therapy products: The need for global consensus and points to consider. Cytotherapy, 2019, 21(11):1095-1111.

[9] Zhang KH, Na T, Han XY, et al. Establishment of a reference cell line, CCRC-hMSC-S1, for the evaluation of biological effectiveness of human mesenchymal stem cells. Chin J New Drugs, 2020, 29(21): 2502-2510. (in Chinese)

張可華, 納濤, 韓曉燕, 等. 人間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)有效性質(zhì)量評價用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株CCRC-hMSC-S1的建立及評價. 中國新藥雜志, 2020, 29(21):2502-2510.

[10] Wei Z, Lv S, Wang Y, et al. Biological characteristics of side population cells in a self-established human ovarian cancer cell line. Oncol Lett, 2016, 12(1):41-48.

[11] Wei ZT, Yu XW, He JX, et al. Characteristics of primary side population cervical cancer cells. Oncol Lett, 2017, 14(3):3536-3544.

[12] Xie T, Mo L, Li L, et al. Identification of side population cells in human lung adenocarcinoma A549 cell line and elucidation of the underlying roles in lung cancer. Oncol Lett, 2018, 15(4):4900-4906.

[13] Zhou CF, Ji J, Cai Q. MTA2 enhances colony formation and tumor growth of gastric cancer cells through IL-11. BMC Cancer, 2015, 15:343.

[14] Lennartsson J, Ma H, Wardega P, et al. The Fer tyrosine kinase is important for platelet-derived growth factor-BB-induced signal transducer and activator of transcription 3(STAT3) protein phosphorylation, colony formation in soft agar, and tumor growth in vivo. J Biol Chem, 2013, 288(22):15736-15744.

[15] Lombardi APG, Cavalheiro RP, Porto CS, et al. Estrogen receptor signaling pathways involved in invasion and colony formation of androgen-independent prostate cancer cells PC-3. Int J Mol Sci, 2021, 22(3):1153-1168.

[16] Shin SI, Freedman VH, Risser R, et al. Tumorigenicity of virus-transformed cells in nude mice is correlated specifically with anchorage independent growth in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A, 1975, 72(11):4435-4439.

[17] Kusakawa S, Yasuda S, Kuroda T, et al. Ultra-sensitive detection of tumorigenic cellular impurities in human cell-processed therapeutic products by digital analysis of soft agar colony formation. Sci Rep, 2015, 5:17892.

[18] Kanemura H, Go MJ, Shikamura M, et al. Tumorigenicity studies of induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived retinal pigment epithelium (RPE) for the treatment of age-related macular degeneration. PLoS One, 2014, 9(1):e85336.

[19] Yin Z, Wang Q, Li Y, et al. A novel method for banking stem cells from human exfoliated deciduous teeth: lentiviral TERT immortalization and phenotypical analysis. Stem Cell Res Ther, 2016, 7:50.

[20] Kuroda T, Yasuda S, Kusakawa S, et al. Highly sensitive in vitro methods for detection of residual undifferentiated cells in retinal pigment epithelial cells derived from human iPS cells. PLoS One, 2012, 7(5):e37342.

[21] Qin SQ, Kusuma GD, Al-Sowayan B, et al. Establishment and characterization of fetal and maternal mesenchymal stem/stromal cell lines from the human term placenta. Placenta, 2016, 39:134-146.

[22] Matheni C, Dsouza W. Xeno-free human Wharton's Jelly mesenchymal stromal cells maintain their characteristic properties after long-term cryopreservation. Cell J, 2021, 23(2):145-153.

[23] Wieder R, Wang H, Shirke S, et al. Low level expression of basic FGF upregulates Bcl-2 and delays apoptosis,but high intracellular levels are required to induce transformation in NIH 3T3 cells. Growth Factors, 1997, 15(1):41-60.

[24] Li H, Fredriksson L, Li X, et al. PDGF-D is a potent transforming and angiogenic growth factor. Oncogene, 2003, 22(10):1501-1510.

[25] Kwan RW, Wong RW, Chan SY. Expression of full length or truncated epidermal growth factor precursor transforms NIH3T3 fibroblasts. Int J Oncol, 1999, 15(2):281-284.

[26] Palmer H, Maher VM, McCormick JJ. Platelet-derived growth factor or basic fibroblast growth factor induce anchorage-independent growth of human fibroblasts. J Cell Physiol, 1988, 137(3):588-592.

[27] Kim HR, Upadhyay S, Korsmeyer S, et al. Platelet-derived growth factor (PDGF) B and A homodimers transform murine fibroblasts depending on the genetic background of the cell. J Biol Chem, 1994, 269(48):30604-30608.

[28] Forough R, Xi Z, MacPhee M, et al. Differential transforming abilities of non-secreted and secreted forms of human fibroblast growth factor-1. J Biol Chem, 1993, 268(4):2960-2968.

Growth factors in a culture medium may enhance tumorigenic potency of human mesenchymal stem cells

ZHANG Ke-hua, JIA Chun-cui, WU Xue-ling, NA Tao, HAN Xiao-yan, WU Ting-ting, MENG Shu-fang

Cell Collection and Research Center, Institutes for Biological Products Control, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China

In the third-party review of human mesenchymal stem cells (hMSCs), some serum-free mediums were found to promote colony formation of hMSCs in soft agar gels. In order to further clarify this phenomenon, this study was conducted to explore the components of the medium that led to the positive cloning of hMSCs soft agar and to further analyze their risks.Colony formation abilities were compared between hMSCs grown under different brands of commercial serum-free medium. The components of these culture media that promoted the colony formation of cells were screened and determined by cytokine antibody chip assay and ELISA. Tumor promotion ability of these components was further confirmed by adding these specific components to the medium. Long term effects of these components on the growth and gene transcription of hMSCs were further clarified through culturing cells for a long period with those gradients.This study confirmed that some brands of serum-free medium could promote the colony formation of hMSCs in soft agar. The data from medium composition analysis showed the high levels of epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF) and platelet-derived growth factor (PDGF-BB) in these media. Adding EGF (50 ng/ml), bFGF (50 ng/ml) and PDGF-BB(10 ng/ml) to the complete medium containing 10% FBS could induce the colony formation of hMSCs in soft agar. The proliferation and gene transcription of hMSCs were significantly changed after 10 passages of culture with the above concentration of growth factors and additional 3 passages of culture without these growth factors.High concentration of growth factors, such asEGF, bFGF, and PDGF-BB, in cell culture medium can enhance the tumorigenicity risk of hMSCs. Long term culture of hMSCs with these growth factors can cause significant effects on cell proliferation and gene expression profiles. This study suggests that the researchers and developers of hMSCs products should pay close attention in the critical components in cell culture media and analyze their effects on tumorigenicityduring the development of hMSCs products.

mesenchymal stem cells; tumorigenicity; epithelial growth factors; fibroblast growth factor; platelet-derived growth factor; soft agar colony formation

MENG Shu-fang, Email: mengsf@nifdc.org.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.06.001

中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)（XDA16040502）；中國藥品監(jiān)管科學(xué)行動計劃細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品技術(shù)評價與監(jiān)管體系研究

孟淑芳，Email：mengsf@nifdc.org.cn

2021-05-24