金花菌發(fā)酵對(duì)蘭花香型漳平水仙茶的生化成分及抗氧化性的影響

許文璨，張戀芳，吳 雙，陳文君，王文鳳，王越悅，黃友誼，林細(xì)柳

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.福建省龍巖市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局；3.龍巖市天淳茶葉研究所，福建 龍巖 364000）

漳平水仙茶產(chǎn)自福建省漳平市，外形為扁平四方塊，分為蘭花香型和桂花香型兩種[1]，是唯一緊壓的初加工烏龍茶[2]，其香氣清高悠長(zhǎng)，滋味濃醇鮮爽，深受閩西、廈門、廣東和東南亞等地區(qū)消費(fèi)者喜愛。金花菌是茯磚茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵微生物[3]，茶葉由金花菌發(fā)酵后降脂功能顯著提升[4]，抑菌活性和抗氧化活性等也有所提高[5]。因其獨(dú)特功能，金花菌已應(yīng)用于發(fā)酵綠茶、紅茶、烏龍茶、白茶、黃茶等茶類[6]，開發(fā)出的新產(chǎn)品受到了人們的歡迎。當(dāng)前漳平水仙茶的發(fā)展存在產(chǎn)品種類單一、競(jìng)爭(zhēng)大、經(jīng)濟(jì)效益低等問題[7]，為此嘗試以金花菌發(fā)酵蘭花香型漳平水仙茶，為豐富漳平水仙茶產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)系茶葉加工與生物技術(shù)課題組從茯磚茶中篩選保存的優(yōu)勢(shì)金花菌（E.cristatumHT1）。市售蘭花香型漳平水仙茶為2018年4月生產(chǎn)后放置一年多的產(chǎn)品。

兒茶素標(biāo)品、沒食子酸標(biāo)品和咖啡堿標(biāo)品，均為色譜純，購于美國(guó)Sigma公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），購于梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，甲酸為色譜純購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司、色譜純甲醇購自 Thermo Fisher Scientific 公司，其它試劑均為分析純，為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 金花菌菌種的制備

以馬鈴薯培養(yǎng)基（Potato dextrose agar，PDA）接種培養(yǎng)金花菌，于28℃下恒溫培養(yǎng)約一周。待金花菌的菌落上形成大量孢子粉時(shí)，將孢子粉刮落到無菌水中，振蕩5min，以3000r/min離心5min，取上清液，得孢子懸浮液。經(jīng)計(jì)數(shù)，稀釋制成1×107cfu/mL孢子懸浮液。

1.3 金花漳平水仙茶的制備

取約20g蘭花香型漳平水仙茶裝入250mL發(fā)酵瓶，加入適量水，使茶葉含水量在40%左右，封口膜封口，以121℃高壓蒸汽滅菌20min。待冷卻后，每個(gè)發(fā)酵罐中加入2mL金花菌孢子懸浮液，混合均勻，然后置于28℃靜置發(fā)酵7d，最后在40℃環(huán)境下烘干。設(shè)置不接菌的對(duì)照組，同時(shí)將對(duì)照組也放置在同樣條件下一周，最后以40 ℃烘干。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4 金花漳平水仙茶的生化成分測(cè)定

水分測(cè)定采用快速法（GB/T 8304-2013）。茶多酚測(cè)定為福林酚法（GB/T 8313-2018）。游離氨基酸總量測(cè)定為茚三酮顯色法（GB/T8314-2013）。可溶性糖含量測(cè)定為蒽酮比色法[8]。水浸出物含量測(cè)定為減壓抽濾法（GB/T8305-2013）。茶色素的測(cè)定為系統(tǒng)分析法[9]。

沒食子酸、咖啡堿、兒茶素組分的測(cè)定采用高效液相色譜法（HPLC）：稱取0.3g茶粉于10mL離心管，加入5mL于70℃水浴的70%甲醇溶液，混勻，超聲波振蕩15min，然后在4℃下浸提12h。濾液過0.45μm濾膜，然后上樣進(jìn)行HPLC測(cè)定。HPLC儀器型號(hào)：島津高效液相儀，色譜柱為安捷倫TC-C18（250mm×4.60 mm×0.45μm）。流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為100%甲醇。采用梯度洗脫，流動(dòng)相B的濃度為：0-10 min（10%-20%），10-35min（20%-45%），35-45min（45%-45%）。流速為0.5mL/min，進(jìn)樣量5μL，檢測(cè)波長(zhǎng)278nm[10]。

1.5 金花漳平水仙茶的抗氧化活性測(cè)定

將發(fā)酵后的漳平水仙茶用粉碎機(jī)磨碎并過40目篩，然后稱取1.5g過篩茶粉，加入20mL沸蒸餾水于90℃水浴鍋中水浴浸提30min，每15min搖一次。待冷卻后，以3500r/min離心5min，將上清液以蒸餾水定容到25 mL容量瓶中，得待測(cè)樣品液。

1.5.1 清除羥自由基能力的測(cè)定（hydroxyl radical scavenging activity，HSA）

依次取4mmol/L的水楊酸-無水乙醇、FeSO4溶液、H2O2溶液及稀釋6倍的樣品液各1mL于離心管中，于37℃水浴反應(yīng)30min，以3600r/min離心5min得上清液，于510nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)X、AX0和A0（AX為樣品組吸光值；AX0為試劑空白吸光值，以蒸餾水代替H2O2；A0為樣品空白吸光值，是以蒸餾水代替樣品液）。清除率S（%）=[1-（AX-AX0）/A0]×100[11]。

1.5.2 總抗氧化能力的測(cè)定（ferric reducing ability of plasma，F(xiàn)RAP）

取3mL FRAP至試管中，于37℃中水浴預(yù)熱10min后，加入0.1mL的待測(cè)樣品液，反應(yīng)30min，然后將其取出冷卻至室溫，以蒸餾水為對(duì)照，于595nm處測(cè)定其吸光值X。以0.2-2mmol/L FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液代替樣品來測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線：C=0.4026*X+0.0008，R2=0.9993（C表示相當(dāng)于硫酸亞鐵的濃度，單位g/L）。計(jì)算1g茶相當(dāng)于硫酸亞鐵的mg量，單位%：M=C*25*d*10/m*m0（d為稀釋倍數(shù)，m為茶葉質(zhì)量，m0為茶葉干物質(zhì)量）[12]。

1.5.3 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除活性測(cè)定（DPPH free radical scavenging activity，DSA）

取0.1mL茶湯和3.9mL的0.15mmol/L DPPH溶液于試管中混合均勻，室溫避光條件下反應(yīng)30min，于517nm測(cè)定吸光值A(chǔ)X、AX0和A0。（AX為樣品組吸光值；AX0為試劑空白吸光值，以95%乙醇代替DPPH溶液；A0為樣品空白吸光值，是以蒸餾水代替待測(cè)樣品液）。清除率S（%）=[1-（AX-AX0）/A0]×100[13]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2019和SPSS 25處理，然后通過Origin 2019b軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 金花漳平水仙茶中水浸出物、游離氨基酸、可溶性糖、沒食子酸含量

經(jīng)金花菌發(fā)酵后，蘭花香型漳平水仙茶中水浸出物含量極顯著性增加（p ＜0.01），增加了11.44%。這說明經(jīng)過金花菌發(fā)酵，可以將漳平水仙茶中非水溶性大分子物質(zhì)部分分解成水溶性小分子物質(zhì)，從而增加了水浸出物含量，有利于提高茶湯的口感，使其更加醇厚。而游離氨基酸的含量極顯著性降低（p＜0.01），降低了56.90%，這一結(jié)果與金花菌發(fā)酵綠茶[14]和金花菌發(fā)酵茶湯[15]的變化一致，可能與美拉德反應(yīng)和金花菌在生長(zhǎng)過程中利用氨基酸等相關(guān)[16]。

經(jīng)過人工接種金花菌發(fā)酵后，蘭花香型漳平水仙的可溶性糖含量與對(duì)照組相比略有增加，這一結(jié)果與金花菌發(fā)酵藤茶、白茶類似[17,18]，而沒食子酸含量極顯著性增加（p＜0.01），增加了182.71%，這與用金花菌發(fā)酵普洱茶（熟茶）的結(jié)果一致[19]。

2.2 金花漳平水仙茶中茶多酚和咖啡堿含量

由圖1可知，經(jīng)過金花菌發(fā)酵后，蘭花香型漳平水仙的茶多酚含量與對(duì)照組相比極顯著性降低（p＜0.01），降低了17.30%，可能是金花菌發(fā)酵使茶多酚氧化聚合[20]，這與金花菌發(fā)酵其它茶的結(jié)果類似[14,17,21-23]。茶多酚在茶葉中主要呈現(xiàn)澀的滋味特性[24]，經(jīng)過金花菌發(fā)酵后含量顯著降低，可見能在一定程度上降低茶葉的澀味，改善茶葉的口感。而發(fā)酵前后咖啡堿含量分別為27.33g/kg和27.36g/kg，幾乎沒有變化，這一結(jié)果與金花菌發(fā)酵鐵觀音的結(jié)果一致[20]，可能是金花菌難以分解利用咖啡堿[22]。

2.3 金花漳平水仙茶中兒茶素組分

如圖2可知，漳平水仙茶經(jīng)金花菌發(fā)酵后，沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（C）和表兒茶素（EC）等4種簡(jiǎn)單兒茶素極顯著性增加（p＜0.01），分別增加了65.19%、80.23%、25.17%和77.49%，而表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和兒茶素沒食子酸酯（CG）等4種酯型兒茶素極顯著性降低（p＜0.01），分別降低63.07%、77.02%、63.10%和69.41%，應(yīng)該是金花菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶將酯型兒茶素水解成了簡(jiǎn)單兒茶素，而且酯型兒茶素是茶葉中重要的苦澀味物質(zhì)[25]，可見金花菌發(fā)酵能降低茶葉的苦澀口感，有利于改善茶葉滋味。而鄒金美等人[20]的研究也發(fā)現(xiàn)鐵觀音經(jīng)過金花菌發(fā)酵后，EGC、CE和C顯著性增加，而EGCG和ECG顯著性降低。

2.4 金花漳平水仙茶中茶色素含量

茶色素是茶葉中具有生物活性的一類氧化聚合物，有一定的保健功能[26]。由圖3可知，經(jīng)過接種金花菌發(fā)酵，蘭花香型漳平水仙的茶黃素含量與對(duì)照組相比極顯著性降低（p＜0.01），降低了38.54%，這一結(jié)果與金花菌發(fā)酵綠茶類似[27]，而茶紅素含量與對(duì)照組相比有所降低但并不顯著（p＞0.05）。茶褐素有較高的生物學(xué)活性，其含量的增加使茶湯呈現(xiàn)褐色，同時(shí)它可能是發(fā)酵茶的主要呈味物質(zhì)[14]。經(jīng)過金花菌發(fā)酵后，蘭花香型漳平水仙的茶褐素含量增加了13.92%。在金花菌發(fā)酵黑茶茶湯中，發(fā)現(xiàn)初期兒茶素被酶氧化為茶黃素，而茶黃素繼續(xù)氧化聚合形成茶紅素和茶褐素[28]。鄒金美等[20]人用金花菌發(fā)酵鐵觀音發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵茶中的茶紅素和茶褐素含量均顯著增加，而茶黃素減少。這些可能是金花菌在生長(zhǎng)的過程中分泌了氧化酚類的酶，促使茶葉中的酚類物質(zhì)氧化成茶黃素，然后使茶黃素繼續(xù)氧化成茶紅素和茶褐素[6,29]。

2.5 金花漳平水仙茶的抗氧化能力

2.5.1 清除羥自由基活性。由圖4可知，蘭花香型漳平水仙茶經(jīng)過金花菌發(fā)酵后，其清除羥自由基能力有所提高，提高了12.84%（p＞0.05），這一結(jié)果與金花菌發(fā)酵普洱茶類似[4]。

2.5.2 總抗氧化活性。由圖4可知，蘭花香型漳平水仙經(jīng)過人工接種金花菌發(fā)酵后，其總抗氧化活性與對(duì)照組相比極顯著性增加（p＜0.01），增加123.30%，這一結(jié)果與金花菌發(fā)酵普洱茶和甜茶類似[4,30]。由此可見，人工接種金花菌發(fā)酵漳平水仙能有效提高茶葉的總抗氧化活性。

2.5.3 DPPH自由基清除活性。由圖4可知，在DPPH自由基清除活性方面，接種金花菌的蘭花香型漳平水仙與對(duì)照組相比，其清除活性極顯著性降低（p＜0.01），降低了20.39%，這與陳皓睿等[15]用前期從六堡茶中篩選并鑒定的三株金花菌發(fā)酵茶葉和朱雯等[30]用金花菌發(fā)酵甜茶的結(jié)果類似。

2.6 金花漳平水仙茶中生化成分與抗氧化活性的相關(guān)性

為了解蘭花香型漳平水仙茶中內(nèi)含成分與抗氧化活性之間的關(guān)系，進(jìn)一步進(jìn)行了相關(guān)性分析。由圖5可知，DPPH自由基清除活性（DSA）與茶多酚、CG、ECG和EGCG的含量呈顯著正相關(guān)（p＜0.05），這與周琦等研究不同品種花茶的抗氧化能力的結(jié)果類似[31]，DSA與游離氨基酸、茶黃素和GCG的含量呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01），而與茶褐素和水浸出物的含量呈顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.05），與GA和四種簡(jiǎn)單兒茶素（C、EC、EGC和GC）呈極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01）。總抗氧化能力（FRAP）與四種酯型兒茶素（GCG、CG、ECG、EGCG）、茶多酚、游離氨基酸和茶黃素的含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01），Wang Z[32]等用七種茶源真菌發(fā)酵熟普時(shí)也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RAP與茶多酚、GCG、CG、ECG呈極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01）。FRAP與水浸出物和C呈顯著正相關(guān)（p＜0.05），與EC、GA、EGC和GC呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01）。清除羥自由基能力（HAS）僅與GCG呈極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01），與茶多酚、游離氨基酸、茶黃素、ECG和EGCG呈顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.05），與水浸出物含量呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01），與C、EC、GA、EGC和GC呈顯著正相關(guān)（p＜0.05）。

3 小結(jié)

蘭花香型漳平水仙經(jīng)人工接種金花菌發(fā)酵后，其水浸出物、沒食子酸和4種簡(jiǎn)單兒茶素（GC、EGC、C 和EC）等含量極顯著性增加（p＜0.01），其可溶性糖含量無明顯變化，其茶多酚、游離氨基酸、4種酯型兒茶素（EGCG、GCG、ECG、CG）和茶黃素含量極顯著性降低（p＜0.01），咖啡堿和茶紅素含量無顯著性變化（p＞0.05），茶褐素含量有所增加。漳平水仙茶生化成分的變化影響其生物活性[6]，蘭花香型漳平水仙接種金花菌發(fā)酵后，其總抗氧化活性極顯著性增加（p＜0.01），而清除羥自由基能力略有增加，DPPH自由基清除活性極顯著性降低（p＜0.01）?？傊?，漳平水仙經(jīng)過金花菌發(fā)酵后，其有助于茶湯醇厚的水浸出物含量增加，具有苦澀味的茶多酚和酯型兒茶素含量降低，茶褐素增加，散發(fā)獨(dú)特菌香[33]，且總抗氧化能力提高，由此可見，利用金花菌發(fā)酵漳平水仙茶能賦予漳平水仙新的風(fēng)味，在一定程度上提高漳平水仙的品質(zhì)和抗氧化活性，具有一定的開發(fā)前景。