14個(gè)姜荷花品種花粉活力及貯藏力研究

余惠文, 趙志霞, 劉蕓琪, 張燕妮, 梁秀月, 柯玲俊, 陸鑾眉*

（1.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,福建漳州363000；2.閩臺(tái)特色園林植物福建省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建漳州363000）

姜荷花（Curcuma alismatifoliaGagnep.）是姜科、姜黃屬植物，是熱帶球根花卉，在炎熱、潮濕和陽(yáng)光充足的氣候條件下生長(zhǎng)良好.姜荷花的栽培生理、采后生理和分子育種均有相關(guān)研究，朱毅[1]、杜啟蘭[2]和仇碩等[3]報(bào)道了姜荷花栽培技術(shù)和種球貯藏方法，葉遠(yuǎn)俊等[4]研究了姜荷花種子的催芽方法，柯玲俊等[5]研究了姜荷花雜交育種，Li等[6]報(bào)道了姜荷花開(kāi)花相關(guān)的基因，在姜荷花抗性[7-10]及作為鮮切花的采后生理[11-12]也有相關(guān)研究報(bào)道，為姜荷花在國(guó)內(nèi)進(jìn)一步發(fā)展積累了理論基礎(chǔ)，但是姜荷花花粉活力及貯藏方面的研究尚未報(bào)道.

花粉是植物遺傳信息的載體和交流工具，花粉貯藏是保存種質(zhì)資源最簡(jiǎn)潔、高效的途徑之一[13].研究花粉貯藏并得出其適宜的貯藏條件，有助于解決異地授粉和親本花期不遇的問(wèn)題，而花粉活力測(cè)定有利于提高雜交育種時(shí)的授粉效率，對(duì)雜交育種工作的開(kāi)展具有重要意義.本研究開(kāi)展了姜荷花花粉發(fā)育時(shí)期的觀察、花粉生活力的測(cè)定和貯藏的研究，并篩選出適于姜荷花花粉萌發(fā)的條件，研究為姜荷花育種工作提供了理論參考，對(duì)姜荷花新品種培育具有重要的意義.

1 材料與方法

1.1 材料的采集與處理

供試用的姜荷花品種：“白雪公主”“清邁紅”“粉佳人”“蝴蝶”“巧克力”“綠色巧克力”“荷蘭紅”“巨人”“櫻桃安娜公主”“紫精靈”“白衣天使”“玉如意”“紅唇”“清邁粉”，采于漳州市金鑾園藝有限公司溫室大棚.收集當(dāng)天散粉的花粉，測(cè)定活力后，裝入離心管中分別置于4、-7、-20 ℃下遮光保存.

收集“玉如意”“紅唇”“清邁粉”“櫻桃安娜公主”“紫精靈”“白衣天使”6個(gè)品種次日即將開(kāi)放的花朵將花藥剝離，并于28 ℃的烘箱中烘至散粉，然后將收集的花粉分別置于4、-7、-20 ℃下遮光保存.

1.2 花粉發(fā)育時(shí)期以及花粉的觀察

供試用的姜荷花品種：“白雪公主”“綠色巧克力”“荷蘭紅”“巨人”“櫻桃安娜公主”“紫精靈”“白衣天使”“玉如意”“紅唇”“清邁粉”.用解剖針取出姜荷花的花藥，將其放在載玻片上，滴適量的醋酸洋紅染液，然后用鑷子反復(fù)碾壓，將花藥中的花粉碾出，除去殘?jiān)w上蓋玻片，觀察花粉發(fā)育時(shí)期.

將花粉用解剖針均勻地涂抹于載玻片的表面，滴適量的醋酸洋紅染液，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察.

1.3 花粉生活力檢測(cè)

1.3.1 醋酸洋紅染色法

運(yùn)用醋酸洋紅染色法定期觀察新鮮花粉及在各種貯藏條件下花粉發(fā)育情況，并且在顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，對(duì)有活力的花粉進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算出其萌發(fā)率.

1.3.2 花粉管萌發(fā)測(cè)定法

配制不同比例濃度（蔗糖、瓊脂、硼酸）的培養(yǎng)基（梯度1：0.001%硼酸+5%蔗糖+1%瓊脂；梯度2：0.001%硼酸+10%蔗糖+1%瓊脂；梯度3：0.001%硼酸+15%蔗糖+1%瓊脂），將配好的培養(yǎng)基滴到載玻片上，待其凝固，將待觀察的花粉均勻地涂抹到培養(yǎng)基上，然后放到裝有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于28 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)5 h后，觀察花粉管的萌發(fā)情況.

2 結(jié)果

2.1 花苞大小與花粉發(fā)育時(shí)期關(guān)系

花粉的發(fā)育時(shí)期與花序大小無(wú)關(guān)，主要與花苞的大小有關(guān).“白雪公主”：花苞在0.8 cm 左右為四分體時(shí)期，1.1~1.6 cm時(shí)處于單核期；“綠色巧克力”：0.5~0.8 cm時(shí)處于四分體時(shí)期，花苞長(zhǎng)0.9~1.75 cm 時(shí)處于單核期；“荷蘭紅”：0.3~0.55 cm時(shí)處于四分體時(shí)期，0.85~1.5 cm時(shí)處于單核期，見(jiàn)圖1（a:二分體、四分體共存時(shí)期;b:單核期;c:雙核期d,e,f分別是對(duì)應(yīng)時(shí)期的花苞）；“巨人”：1.1 cm 時(shí)為單核期；“玉如意”：0.7~1 cm 時(shí)處于二分體和四分體時(shí)期，1.2~1.5cm 多處于單核期，大于1.5 cm 時(shí)多處于雙核期；“紅唇”：0.7~0.9 cm 的處于二分體和四分體共存時(shí)期，1~1.5 cm 的大多數(shù)是單核期，居中期較多，大于1.6 cm 的是雙核期；“清邁粉”：0.7~1 cm大多處于二分體和四分體時(shí)期，1.2~1.8 cm，大多數(shù)處于單核期，靠邊期居多，少數(shù)有雙核期，大于1.8 cm 的多數(shù)為雙核期；“櫻桃安娜公主”：0.5~1 cm 時(shí)，處于單核期；“白衣天使”：大于0.6cm 時(shí)，細(xì)胞多以單核期存在，1 cm 時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)液泡化；“紫精靈”：0.6~0.8 cm 時(shí)細(xì)胞多數(shù)處于二分體四分體共存階段，在1.2 cm左右時(shí)細(xì)胞多數(shù)處于單核期.

圖1 “荷蘭紅”不同花長(zhǎng)及對(duì)應(yīng)花粉發(fā)育時(shí)期Fig.1 Different flower lengths and corresponding pollen development periods of"Holland Red"

2.2 不同品種姜荷花花粉初始生活力比較

用醋酸洋紅染色法對(duì)姜荷花花粉初始活力進(jìn)行測(cè)定，測(cè)出初始活力最好的品種為“白雪公主”，“荷蘭紅”“清邁紅”“清邁粉”等次之.測(cè)出不同品種姜荷花初始活力由大到小分別為：“白雪公主”（99.13%），“荷蘭紅”（98.3%），“清邁紅”（94.6%），“清邁粉”（85.57%），“玉如意”（82.53%），“紅唇”（82.27%），“巧克力”（68.52%），“紫精靈”（42%），“櫻桃安娜公主”（35），“白衣天使”（31%），“粉佳人”（7.54%），“蝴蝶”（7.09%），“綠色巧克力”（5.2%），“巨人”（2.5%）.

2.3 不同貯藏條件對(duì)姜荷花花粉生活力的影響

“白雪公主”花粉在4 ℃條件下，花粉染色隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸變淺，活力逐漸降低；在-20 ℃條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，花粉染色情況變化不明顯，染色較深，活力較好，因此其適宜的貯藏條件是-20 ℃下進(jìn)行貯藏.“荷蘭紅”花粉，在4 ℃條件下，貯藏110 d 后仍具有活力，但是活力較低，約25%左右；在-20 ℃條件下，貯藏110 d 后花粉的活力仍具有較高的活力，90%以上，與初始活力相近，因此適宜-20 ℃下貯藏其花粉.“清邁紅”在4 ℃條件下，前期花粉染色較深，活力較明顯，花粉染色隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸變淺，活力逐漸下降.-20 ℃條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，“清邁紅”花粉染色情況變化不大，染色明顯，花粉活力較好，在貯藏120 d 后，其花粉活力為69.7%，-20 ℃較適于其花粉貯藏.“巧克力”在-20 ℃下的密封避光保存效果最好，花粉活力仍保持在較高的狀態(tài)，120 d 后花粉活力為30%左右.“玉如意”在烘干散粉4 ℃下貯藏230 d，花粉活力為71.62%；烘干散粉-7 ℃下貯藏230 d，花粉活力為78.53%；烘干散粉-20 ℃貯藏230 d，花粉活力為69.24%，“玉如意”花粉適宜的貯藏條件是烘干散粉，-7 ℃保存.“紅唇”在烘干散粉4 ℃下貯藏230 d，花粉活力為75.56%；烘干散粉-7 ℃下貯藏230 d 時(shí)花粉活力為81.2%；烘干散粉-20 ℃下貯藏230 d，花粉活力為91.07%，“紅唇”花粉適宜的貯藏條件是烘干散粉，-20 ℃保存.“清邁粉”在烘干散粉4 ℃下貯藏230 d，花粉活力為72.73%；烘干散粉-7 ℃下貯藏230 d，花粉活力為81.82%；烘干散粉-20 ℃下貯藏230 d，花粉活力為78.92%，見(jiàn)圖2（a:烘干散粉，4 ℃保存;b:烘干散粉，-7 ℃保存;c:烘干散粉，-20 ℃保存;d:自然散粉，4 ℃保存;e:自然散粉，-7 ℃保存;f:自然散粉，-20 ℃保存），“清邁粉”花粉最適宜的貯藏條件為烘干散粉，-7 ℃保存.“紫精靈”的花粉活力較低，但是烘干散粉，-20 ℃條件下貯藏的花粉活力較高，在貯藏90 d后，花粉基本就失去了活力.“櫻桃安娜公主”“白衣天使”的初始活力在30%左右，相對(duì)來(lái)說(shuō)活力較差，貯藏60 d 后花粉活力就低于16%（表1）.“粉佳人”“蝴蝶”“綠色巧克力”“巨人”這4個(gè)品種的花粉活力較低，60 d左右基本就完全失活，花粉生活力過(guò)低，作為種質(zhì)資源保存的價(jià)值較低，雜交育種挑選親本時(shí)不宜做父本.

圖2 不同貯藏條件對(duì)“清邁粉”花粉活力的影響(貯藏230 d)Fig.2 Effect of different store environment on the pollen germination of"Chiang Mai Pink"

表1 不同貯藏條件對(duì)6個(gè)姜荷花品種花粉生活力的影響Tab.1 Pollen viability of 6 Curcuma alismatifolia varieties effected by different storage conditions

續(xù)表1

2.4 姜荷花花粉萌發(fā)活力檢測(cè)

“白雪公主”新鮮花粉在5%蔗糖濃度培養(yǎng)基中萌發(fā)率為74.33%；在10%蔗糖濃度培養(yǎng)基中花粉萌發(fā)率為0.07%；在15%蔗糖濃度培養(yǎng)基中花粉萌發(fā)率為0%.“清邁紅”花粉在5%蔗糖濃度培養(yǎng)基中萌發(fā)率為65.09%；在10%蔗糖濃度培養(yǎng)基中花粉萌發(fā)率為7.65%；在15%蔗糖濃度培養(yǎng)基中花粉萌發(fā)率為0.07%，見(jiàn)圖3（a:蔗糖濃度5%;b:蔗糖濃度10%;c:蔗糖濃度15%）。新鮮的“紅唇”和“清邁粉”花粉在5%蔗糖濃度培養(yǎng)基中萌發(fā)情況最好，萌發(fā)率分別為68.42%和46.67%，得出這四種姜荷花花粉適宜萌發(fā)培養(yǎng)基配方0.001%硼酸+5%蔗糖+1%瓊脂.“粉佳人”和“蝴蝶”花粉在不同蔗糖濃度下萌發(fā)率均低于1.8%，“巧克力”花粉隨著蔗糖濃度的升高萌發(fā)率呈下降趨勢(shì)，分別為57.31%、35.84%、9.30%.

圖3 “清邁紅”新鮮花粉在固體培養(yǎng)基上的萌發(fā)情況Fig.3 Germination of"Chiang Mai Red"fresh pollen on solid medium

“玉如意”“櫻桃安娜公主”“紫精靈”“白衣天使”“荷蘭紅”在這三種蔗糖濃度培養(yǎng)基下，萌發(fā)率均為0%.經(jīng)過(guò)貯藏后的“紅唇”“清邁粉”“玉如意”花粉在0.001%硼酸+5%蔗糖+1%瓊脂培養(yǎng)基均未檢測(cè)到萌發(fā)的現(xiàn)象.

3 討論

花粉活力的研究為雜交育種過(guò)程中選配優(yōu)良品種提供重要依據(jù).花粉活力的檢測(cè)方法有很多種，本實(shí)驗(yàn)采用醋酸洋紅法與培養(yǎng)基培養(yǎng)法對(duì)姜荷花花粉進(jìn)行檢測(cè)，這兩種方法雖然精度存在差異，但其測(cè)定的結(jié)果趨勢(shì)是一致的.染色法較為快捷，但其結(jié)果比較間接[14]，相比之下花粉培養(yǎng)基萌發(fā)法測(cè)定的結(jié)果更接近自然狀態(tài)下的花粉真實(shí)活力，數(shù)據(jù)更為可靠[15].不同植物所需要花粉離體培養(yǎng)基中的主要成分（蔗糖、硼酸、鈣等）的濃度、比例不同，因此篩選姜荷花花粉適宜萌發(fā)培養(yǎng)基有利于檢測(cè)其花粉活力.

姜荷花品種“巨人”“綠色巧克力”“粉佳人”“蝴蝶”的初始活力均在6%以下，多為2%左右，其花粉活力過(guò)低，不利于花粉貯藏，在雜交育種中不適合作為雜交父本；品種“清邁粉”“紅唇”“玉如意”“巧克力”“白雪公主”“荷蘭紅”初始活力均在80%以上，具有較大貯藏價(jià)值；品種“櫻桃安娜公主”“白衣天使”“紫精靈”的初始活力均在40%左右，具有貯藏價(jià)值.這一定程度上解釋了前期姜荷花雜交授粉成功率較低的原因[5].

本研究中烘干散粉貯藏的活力比自然散粉的活力更好，與前人的研究結(jié)果類似，即含水量過(guò)多會(huì)使花藥呼吸旺盛，消耗過(guò)多養(yǎng)份，使貯藏壽命降低，而適宜的含水量能使花粉呼吸速率降低，減少養(yǎng)份消耗，使花粉貯藏壽命延長(zhǎng)[16].貯藏后的姜荷花在培養(yǎng)基上較難萌發(fā)，之后可以嘗試將硼酸更換為或者添加低濃度的氯化鈣，也可以加入適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)調(diào)節(jié)劑.

隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，姜荷花花粉活力總體呈下降趨勢(shì).高溫會(huì)加強(qiáng)花粉呼吸強(qiáng)度，而低溫會(huì)降低有機(jī)物質(zhì)的消耗從而延長(zhǎng)花粉壽命，因此一般花粉活力隨貯藏周期延長(zhǎng)而逐漸降低，且在低溫條件下花粉活力更好[17-18].姜荷花花粉在-20 ℃條件下避光保存的貯藏效果較好，“荷蘭紅”“紅唇”“白雪公主”分別貯藏100、230、90 d 后活力均保持在90%以上；“清邁紅”貯藏90 d 后活力為79.70%，“巧克力”貯藏230 d 后活力在40%以上；“櫻桃安娜公主”“白衣天使”“紫精靈”的花粉長(zhǎng)時(shí)間貯藏后活力過(guò)低，貯藏30 d 內(nèi)活力保持較好.