苗藥透骨香的抗氧化活性研究及總黃酮、總酚酸的含量測定*

高秀印，李金金，肖 婷，郭正紅，謝樹才，劉紅云

(1 貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025；2 貴州醫(yī)科大學,貴州 貴陽 550025)

苗藥透骨香，又名滇白珠，是我國西南苗族、白族、彝族、瑤族等九個少數(shù)民族的常用藥物，為杜鵑花科(Ericaceae)白珠樹屬(GaultheriaKalm ex Linn.)植物透骨香(G.yunnanensis)的根或全草。具有清熱解毒、活血化瘀、祛風除濕、順氣平喘的功效，臨床主要用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)[1-2]，《貴陽民間藥草》主述其治風濕關(guān)節(jié)疼痛，跌打損傷，在《貴州草藥》中記載其可祛風除濕，舒筋活血，配伍車前草、川烏、草烏等藥，用于風濕性關(guān)節(jié)炎、筋骨拘攣等癥的治療。

研究表明氧化應(yīng)激在 RA的發(fā)病及病理過程中影響頗大[3]，當機體組織的自由基過度產(chǎn)生或者抗氧化防御體系功能受損時，體外抗氧化劑的補充可以提高機體提升抗氧化和抗炎能力，減少細胞凋亡和氧化損傷。本實驗基于酶標儀-微孔板，采用 1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)自由基清除法、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基清除法、鐵離子還原法(FRAP)測定透骨香各萃取層的自由基清除能力和總抗氧化能力，采用福林酚法和Al(NO3)3-NaNO2-NaOH 顯色法分別測定其中多酚和總黃酮含量，為透骨香在臨床上治療 RA提供科學依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥材與試劑

藥材于2019年9月在貴陽太湖升中藥材市場購得，由貴州中醫(yī)藥大學藥學院魏升華教授鑒定為透骨香(G.yunnanensis(Franch.)Rehd)的干燥根。將透骨香的根(5.00 kg)切碎用 8 倍量的 75%乙醇水浴回流提取3次，每次2小時，經(jīng)濃縮得到干浸膏(513.02 g)，浸膏用水分散，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，減壓濃縮，分別得到石油醚層浸膏(3.68 g)、二氯甲烷層浸膏(33.51 g)、乙酸乙酯層浸膏(20.46 g)、正丁醇層浸膏(192.52 g)和水層浸膏(209.38 g)。

供試液的配置：取適量樣品75%乙醇溶解，充分震蕩使其完全溶解，配制成10 mg/mL供試品溶液，然后稀釋成5 mg/mL、2.5 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL 和0.1 mg/mL的濃度梯度的供試品溶液。

陽性對照藥VC取適量樣品 75%乙醇充分溶解，配制成 5 mg/mL、2.5 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL和0.1 mg/mL的梯度濃度。

沒食子酸標準品(95%，110631-201605)，中國食品藥品檢定研究所；VC(20200649)，華中藥業(yè)股份有限公司；蘆丁標準品(92.5%，100080-200707)，中國食品藥品檢定所；TPTZ(BCCD2024)，ABTS(SlBZ8095)，DPPH(MKCN0676)西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；K2S2O8(20200120)，優(yōu)耐德引發(fā)劑合肥有限公司；FeCl3·6H2O(20180301)，國藥集團化學試劑有限公司；NaCO3(20200416)，天津市科密歐化學試劑有限公司；NaNO2(20201012)，國藥集團化學試劑有限公司；FeSO4·7H2O(20200313)，國藥集團化學試劑有限公司；CH3COONa(20200220)，國藥集團化學試劑有限公司；福林酚(S15D11J134401)，源葉生物；Al(NO3)3，天津市瑞金特化學品有限公司。

1.2 儀 器

酶標儀(1530)，Life Technologies Holding Pte Ltd；UV-5900紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；BS110S 電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 DPPH·清除能力的測定

2.1.1 實驗方法[4]

準確稱取3.94 mg DPPH用甲醇溶解，并定溶于10 mL棕色容量瓶中，避光，0～4℃條件下保存?zhèn)溆?。樣品組配制：取10 μL不同濃度的各萃取層溶液，然后加入80 μL DPPH溶液，混合后在室溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測其吸光度Ai；對照組：與樣品組相比，80 μL DPPH溶液更換為80 μL的甲醇溶液，其余相同，其吸光度為Aj；空白組：與樣品組相比，10 μL不同濃度的各萃取層溶液更換為10 μL的75%乙醇溶液，其余相同，其吸光度為A0。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)孔。用DPPH 自由基清除效率評價公式計算EC50值：

DPPH自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

2.1.2 實驗結(jié)果

透骨香各萃取層對 DPPH·清除能力如圖1a所示。各萃取層的清除能力不同，其中乙酸乙酯層的清除能力最強，水層的清除能力最弱，其清除能力由高到低為：乙酸乙酯層>正丁醇層>二氯甲烷層>石油醚層>水層。各萃取層層的 EC50(mg/mL)分別為：乙酸乙酯層 7.17、正丁醇層18.90、二氯甲烷層 113.32、水層 249.02和石油醚層 494.63。陽性藥VC的EC50為 1.69。結(jié)果表明透骨香乙酸乙酯層對 DPPH·具有較好的清除能力。

2.2 ABTS·清除能力的測定

2.2.1 實驗方法[5]

ABTS工作液的配制：精密稱取 ABTS 38.41 mg，加蒸餾水稀釋至 10 mL；稱取 K2S2O866.10 mg，加蒸餾水稀釋至 100 mL；然后將 ABTS 溶液與K2S2O8溶液等體積混合，避光貯存 12～16 h，最后將生成的ABTS·+儲備液用蒸餾水稀釋，得到 ABTS 工作液。

樣品組：于 96 孔酶標板中分別加入各萃取層不同濃度的樣品溶液 10 μL，加入 ABTS 工作液 100 μL，振搖混勻10 s后在 37 ℃下反應(yīng) 6 min，于 734 nm 處測定吸光度，記為 A1； 空白組：以 75%乙醇代替樣品溶液，其余同樣品組一樣，測得空白吸光度，記為 A0；以 VC 為陽性藥。每個樣品設(shè)置 3 個重復(fù)孔。計算各樣品對 ABTS 自由基的清除率，并計算EC50的值。

ABTS 自由基清除率=(A0-A1)/A0×100%

2.2.2 實驗結(jié)果

透骨香各萃取層對 ABTS·清除能力如圖1b所示。與對 DPPH·清除能力類似，透骨香根的各萃取層的清除能力由高到低為：乙酸乙酯層>正丁醇層>二氯甲烷層>石油醚層>水層。各萃取層層的 EC50(mg/mL)分別為：乙酸乙酯層 0.98、正丁醇層 4.22、二氯甲烷層 14.75、石油醚層 27.39和水層 69.95，陽性藥VC的EC50為 0.28。從結(jié)果可以看出，透骨香乙酸乙酯層對 ABTS·具有較好的清除能力。

2.3 FRAP法對透骨香各萃取層總還原能力的測定

2.3.1 實驗方法[6]

FRAP工作液的配制：將2.5 mL 300 mmoL/L醋酸一醋酸鈉緩沖液(pH 3.6)，250 μL 10 mmoL/L TPTZ溶液與250 μL 20 mmoL/L FeC13溶液混勻，備用。

FeSO4·7H2O標準曲線的繪制：精密稱取 4.17 mg 定容在 10 mL 的容量瓶中，吸取 5 mL 向 10 mL 的容量瓶中定容后則配制成11.72 μmol/L、23.44 μmol/L、46.875 μmol/L、93.75 μmol/L、187.5 μmol/L的FeSO4溶液，依次吸取 160 μL FeSO4溶液于 96 孔酶標板中，吸取FRAP工作液200 μL加入96孔酶標板中，放入酶標儀內(nèi)，升溫至37 ℃，于593 nm下讀取吸光值A(chǔ)，以 FeSO4溶液濃度為橫坐標，A為橫坐標縱制標曲，得回歸方程Y=0.0116X+0.0909(R2=0.9997)。

吸取FRAP工作液150 μL加入96孔酶標板中之后在孔中加入10 μL 75%乙醇做空白對照，放入酶標儀內(nèi)，升溫至37 ℃，10 min后于593 nm下讀取吸光值 A反應(yīng)前。吸取FRAP工作液150 μL加入96孔酶標板中之后在孔中加入 10 μL 5 mg/mL的待測樣品，升溫至37 ℃，10 min后于593 nm處讀取吸光值A(chǔ)反應(yīng)后。以 0.5 mg/mL的 VC為陽性對照藥。由A反應(yīng)后-A反應(yīng)前的差值在標準曲線上獲得抗氧化物質(zhì)相應(yīng)的FeSO4的濃度(μmoL/L)，定義為FRAP值。

2.3.2 實驗結(jié)果

透骨香各層的抗氧化活性見圖1c，VC的抗氧化活性最強為181.67，其次為透骨香的乙酸乙酯層105.55>正丁醇層91.07>二氯甲烷層58.08>石油醚層31.93>水層8.74。

圖1 各萃取層自由基清除和總抗氧化能力

2.4 總黃酮含量的測定

2.4.1 實驗方法[7]

蘆丁標準曲線的繪制：精確稱量蘆丁對照品 10.50 mg置于25 mL量瓶中，75%乙醇溶液溶解，定容搖勻，得 0.42 mg/mL標準溶液。精確吸取標準溶液配制成 0、0.0084、0.0168、0.0252、0.0336、0.0042 mg/mL 的對照品溶液，分別加入 0.3 mL 5% NaNO2，搖勻后靜置6 min，再加入 0.3 mL 10% Al(NO3)3，搖勻后靜置 6 min，加入 4 mL 4% NaOH溶液，蒸餾水定容，搖勻后靜置 15 min，在 510 nm處分別測量吸光值。以蘆丁濃度(X，mg/mL)和吸光值(Y)進行繪制標準曲線，得到標準曲線：Y=12.554X+0.0004(R2=0.9991)。

取各萃取層溶液1 mL，分別加入0.3 mL 5% NaNO2，搖勻后靜置5 min，再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3，搖勻后靜置 6 min，加入蒸餾水定容，搖勻后靜置15 min，在510 nm處分別測量吸光值，采用標準曲線法計算各各萃取層含有的總黃酮含量(以蘆丁計)。

2.4.2 實驗結(jié)果

結(jié)果表明苗藥透骨香中不同萃取部位中含有的總黃酮量存在顯著差異，如表1所示。其中乙酸乙酯層最高 875.04 mg/g，正丁醇層次之 413.57 mg/g、二氯甲烷層 118.75 mg/g、石油醚層 107.63 mg/g、水層最低 43.11 mg/g。

表1 各萃取層中總黃酮和總酚酸的含量(n=3)

2.5 總酚酸含量的測定

2.5.1 實驗方法[8]

南齊謝赫有云：“畫有六法，一曰氣韻生動，二曰骨法用筆，三曰應(yīng)物象形，四曰隨類賦彩，五曰經(jīng)營位置，六曰傳移模寫?！绷_春輝的現(xiàn)代工筆繪畫作品本著《周易·系辭》“觀物其象”“立象以盡意”之說，以重彩、沒骨入畫既能“筆墨積微”，又能高揚色彩，“工”能勾勒立象，細致精雅，“寫”能“惚兮恍兮，其中有象；恍兮惚兮，其中有物；竊兮冥兮，其中有精，其精甚真”。他是對“六法”說進行一個全新的詮釋。憑借對傳統(tǒng)的守正和超然，憑借作畫時的情之深、意之切和趣之足，憑借明麗典雅、磅礴杳渺的畫境和神遇跡化，超然象外的盎然意趣，羅春輝的現(xiàn)代工筆繪畫藝術(shù)必將如儼儼高松超拔于當代工筆畫壇，成為藝術(shù)創(chuàng)作的新典范和勇于創(chuàng)新的新表率。

沒食子酸標準曲線的繪制：精密稱取 10.0 mg沒食子酸對照品，加蒸餾水定容至 100 mL，得沒食子酸對照溶液。取適量對照品溶液，配制成濃度分別為 0、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006 mg/mL濃度對照品溶液，取 2 mL 的對照品溶液，精密加入0.5 mL福林酚試劑，搖勻，再精密加入 2 mL 10% NaCO3溶液，搖勻，蒸餾水定溶至 10 mL，75 ℃水浴 10 min，冷卻至室溫，測定750 nm處吸光度。以沒食子酸濃度C為橫坐標、沒食子酸對照溶液的吸光度A為縱坐標繪制標準曲線：Y=1.61.51X-0.0071(R2=0.9991)。

取2 mL的各萃取層溶液，精密加入 0.5 mL 福林酚試劑，搖勻，再精密加入 2 mL 10% NaCO3溶液，搖勻，蒸餾水定溶至 10 mL，75 ℃水浴 10 min，冷卻至室溫，測定 750 nm處吸光度，采用標準曲線法計算各各萃取層含有的總酚酸含量(以沒食子酸計)。

2.5.2 實驗結(jié)果

結(jié)果表明，苗藥透骨香各萃取層總多酚含量存在顯著差異，如表所示。其中乙酸乙酯層含量最多高，達 228.50 mg/g、正丁醇層 98.50 mg/g、二氯甲烷層 32.10 mg/g、石油醚層42.09 mg/g、水層21.85 mg/g。

3 討 論

目前體外抗氧化活性評價方法主要有自由基清除實驗，脂質(zhì)過氧化抑制實驗和總抗氧化能力的測定等評價方法，其中 DPPH 自由基清除實驗、ABTS 自由基清除實驗和 FRAP是最常用的三種方法[9]。其中 DPPH自由基N原子上有單電子， 517 nm為 DPPH 自由基的最大吸收波長，DPPH 在醇溶液中顏色為紫色，當存在自由基清除劑時，DPPH自由基單電子配對而使其顏色褪去，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系。ABTS可被氧化劑氧化，生成藍綠色的自由基陽離子 ABTS·+，在734 nm 處有最大吸收，ABTS·+在抗氧化劑存在下，與之反應(yīng)生成 ABTS，顏色消失。通過測量ABTS·+在反應(yīng)前后734 nm 處吸光度的變化測量可以計算樣品的自由基清除能力。FRAP 是在酸性條件下測定樣品的總抗氧化能力，該方法廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品領(lǐng)域。Fe3+與三吡啶三吖嗪(TPTZ)形成螯合物，在酸性條件下 Fe3+可被樣品中的還原物質(zhì)還原為Fe2+而呈現(xiàn)藍色，并在 593 nm處有有最大吸收，根據(jù)反應(yīng)前后吸光度的差值來計算樣品中抗氧化能力的強弱。

透骨香不同萃取層的自由基清除活性和抗氧化活性活性與其所含的化學成分密切相關(guān)，黃酮類化合物和酚酸類化合物具有較強的自由基清除活性和抗氧化活性，因此本實驗對不同萃取層中的總黃酮和總酚酸類成分進行了測定。

總酚酸測定的方法有鐵氰化鉀-三氯化鐵反應(yīng)、福林酚法、HPLC法、分光光度法、羧甲基纖維素沉淀法等。由于紫外分光光度法的易用性，是測定酚類化合物應(yīng)用最多的方法。分光光度法測定總酚酸主要的包括兩種方法：福林酚法(Folin-Ciocalteau)和總酚類指數(shù)(TPI)，其中 Folin-Ciocalteau 法是運用最多的方法[11-12]。其原理是酚酸類化合物的酚羥基在堿性溶液中可以被鎢鉬酸定量氧化，鎢鉬酸(W6+)則被還原成藍色的(W5+)，顏色的深淺與酚酸的含量成正比。

4 結(jié) 論

從實驗結(jié)果可以看出，三種方法測定透骨香不同萃取層的自由基清除活性和總抗氧化能力具有一致性，其中乙酸乙酯萃取層的自由基清除活性和總抗氧化能力最強，其次為二氯甲烷層和正丁醇層，石油醚層和水層的活性較弱。但在 DPPH 和 ABTS 實驗中，石油醚層和水層的活性順序略有差別。乙酸乙酯萃取層的總黃酮含量最高，為875.04 mg/g，其次為正丁醇萃取層，為413.57 mg/g，從文獻報道來看，透骨香中的黃酮多為糖苷類化合物，苷元較少，與實驗結(jié)果基本一致。乙酸乙酯萃取層總酚酸含量最高，為228.50 mg/g，其次是正丁醇層，為98.50 mg/g。文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，透骨香中酚酸類成分多為水楊酸甲酯及其衍生物和苯丙烯酸類化合物及其衍生物，該類成分主要存在乙酸乙酯和正丁醇層中，實驗結(jié)果也與文獻調(diào)研結(jié)果基本一致。

綜上所述本實驗采用DPPH、ABTS和FRAP 法對透骨香的抗氧化活性進行了整體評價，并對抗氧化活性較好的總黃酮和總酚酸的含量進行了分析，為苗藥透骨香的進一步深度開發(fā)、綜合利用與優(yōu)化提供了理論依據(jù)。