柱切換-高效液相色譜法與均相酶免法檢測(cè)艾司西酞普蘭血藥濃度的比較研究

馬睿婷 于利國 鄭蘭兵

(內(nèi)蒙古自治區(qū)精神衛(wèi)生中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

艾司西酞普蘭于2002年獲FDA批準(zhǔn)在美國上市，2006年進(jìn)入我國精神科市場，對(duì)重度的抑郁癥和焦慮癥有顯著療效，受到精神科臨床醫(yī)生的關(guān)注，迅速成為抗抑郁的首選藥物之一[1]。艾司西酞普蘭雖療效好，但由于治療窗窄，患者的個(gè)體差異也較大，抗抑郁作用與患者血藥濃度顯著相關(guān)[2-4]。低于有效血藥濃度值的患者可能無法起到治療作用，而超過有效血藥濃度會(huì)產(chǎn)生口干、惡心、嗜睡、出汗增多、頭痛、癲癇或激素紊亂等副作用[5-8]。目前測(cè)定艾司西酞普蘭濃度的方法較多，柱切換高效液相色譜法[9]采用在線聚焦樣品，克服樣品轉(zhuǎn)移過程中的非正態(tài)損失，樣品同向轉(zhuǎn)移傳輸，進(jìn)入液相色譜以進(jìn)行血藥濃度的檢測(cè)。均相酶免法(HEI)是一種具有酶特異性的方法，用高特異性和強(qiáng)催化活力的酶來測(cè)定人體液中微量的藥物及內(nèi)源性物質(zhì)。本文通過對(duì)柱切換高效液相色譜法和均相酶免法[10，11]測(cè)定人血清中艾司西酞普蘭方法的研究，對(duì)比分析兩種方法的差異及影響，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

日本島津高效液相色譜(LC-20AT含consence數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，日本島津公司)；臺(tái)式離心機(jī)(TGL-16 CENCE，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；電子天平(AUW120D,日本島津)；漩渦混合器(VORTEX-5 KYLINBELL，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)；全自動(dòng)生化分析儀。艾司西酞普蘭對(duì)照品(批號(hào)：20191001)；艾司西酞普蘭質(zhì)控品(批號(hào)：20191011)；艾司西酞普蘭定標(biāo)液(批號(hào)：20191021)；艾司西酞普蘭試劑(批號(hào)：20191031)；甲醇、乙腈為色譜純。

1.2 標(biāo)本資料

來自2018年1—12月本院住院和門診患者的艾司西酞普蘭檢測(cè)標(biāo)本，共60份。將分離血清分為2份。

1.3 方法

1.3.1 柱切換-高效液相色譜法(Column-switching, CS)

在線柱切換HPLC檢測(cè)血清中藥物的濃度，Column-switching的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)見圖1。圖1a中，六通閥(6-port valve)位置A時(shí)，全血離心后，血清樣品直接進(jìn)樣Auto-sampler，混合流動(dòng)相C攜帶樣品進(jìn)入系統(tǒng)，稀釋后的樣品由D相稀釋后帶入MAYI Column，吸附血清中的藥物分子，大分子蛋白質(zhì)由廢液流出，切換六通閥，切換后如圖1中的b圖，混合流動(dòng)相AB，反相洗脫MAYI柱，將保留在MAYI柱上的藥物洗脫下來，Column-C18分離，檢測(cè)器檢測(cè)。

(a)

1.3.1.1 專屬性實(shí)驗(yàn)

在優(yōu)選后的色譜條件下，分別對(duì)艾司西酞普蘭對(duì)照品、艾司西酞普蘭樣品血清、空白血清進(jìn)行測(cè)定，得到專屬特征峰，確定艾司西酞普蘭保留時(shí)間為8.0 min，空白血清無此峰。

1.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：精密稱取ES對(duì)照品1 mg，用5 mL 70%甲醇溶解，稀釋至刻度，定容于10 mL量瓶，得0.1 mg·mL-1的艾司西酞普蘭對(duì)照品溶液。

空白血清采自健康體檢人員，混合血清各450 uL，精密加入配好的ES標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液0.1，0.2,0.4,0.8,1.6 μg·mL-1艾司西酞普蘭標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，配制濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 μg·mL-1的梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液。取空白血清樣品500 ul，置10 mL具塞試管中，5 000 r·min-1離心5 min，取上清液備用。取20 uL進(jìn)樣，取柱切換色譜條件下測(cè)定峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線表明：艾司西酞普蘭濃度為0.01～0.16 μg·mL-1時(shí)，峰面積與ES血清濃度呈有良好的線性，方程式:y=2 147.607x-9.142 46，r=0.999 4，最低檢測(cè)限(S/N=3)為3.2 ng·mL-1。

1.3.1.3 精密度

配制0.1、0.4、1.6 μg·mL-1三個(gè)梯度濃度的艾司西酞普蘭標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制5份并進(jìn)行處理，按照“1.3.1”項(xiàng)下色譜法進(jìn)樣，在1日平行測(cè)5次，精密度日內(nèi)RSD為2.3%，表明精密度良好。

1.3.1.4 重復(fù)性

精密配置0.4 μg·mL-1艾司西酞普5份空白血清樣品，按照“1.3.1”項(xiàng)下色譜法進(jìn)樣，采用Column-switching分析，RSD為1.7%，表明該法重復(fù)性良好。

1.3.1.5 穩(wěn)定性

配制含有1.6 μg·mL-1濃度的艾司西酞普蘭標(biāo)準(zhǔn)血清樣品，按照“1.3.1”項(xiàng)下色譜法進(jìn)樣，于固定時(shí)間點(diǎn)測(cè)定(0、2、4、8、12、24h)。

1.3.1.6 方法回收率

配制2、8、12 μg·mL-1三個(gè)濃度水平的艾司西酞普蘭自配標(biāo)準(zhǔn)血清樣品，各濃度加入已配舒樂安定標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按照“1.3.1”項(xiàng)下色譜法進(jìn)樣，測(cè)定，得回收率即實(shí)際含量/理論加入含量，艾司西酞普蘭血清加樣回收率，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，加樣回收率在80.2%～83.7%之間，回收率符合《中國藥典》關(guān)于生物樣品的測(cè)定要求，表明該法準(zhǔn)確可靠。

1.3.2 均相酶免法

均相酶免法整個(gè)反應(yīng)發(fā)生在一個(gè)液相均相體系中，酶免反應(yīng)萄糖六磷酸脫氫酶-艾司西酞普蘭偶聯(lián)物和血漿蛋白中抗艾司西酞普蘭特異性抗體位點(diǎn)上。樣本中游離的艾司西酞普蘭越多，競爭性位點(diǎn)越多，抗體釋放出的酶標(biāo)偶聯(lián)物就越多。游離出來的艾司西酞普蘭酶標(biāo)偶聯(lián)物催化β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(NAD+)轉(zhuǎn)化為還原型NADH，樣本中的艾司西酞普蘭濃度與NADH的生成量成正比，通過生化儀器紫外檢測(cè)器測(cè)得其340 nm處的吸光值的變化即可計(jì)算出艾司西酞普蘭的含量。

1.3.3 分析與統(tǒng)計(jì)

分析柱切換-HPLC法和HEI發(fā)測(cè)定結(jié)果的差異。

2 結(jié)果

2.1 血藥濃度測(cè)定結(jié)果

對(duì)門診60例服用艾司西酞普蘭的患者進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)，單藥服用，其中男19例，女41例，年齡15～75歲。對(duì)同一樣本在同一天分別采用柱切換-HPLC法和HEI法進(jìn)行對(duì)比測(cè)定。HEI法采用貝克曼AU-5800進(jìn)行測(cè)定，柱切換-HPLC按照“1.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 60例患者艾司西酞普蘭血藥濃度測(cè)定結(jié)果對(duì)比

從表1中可以看出，監(jiān)測(cè)結(jié)果在有效血藥濃度范圍內(nèi)占43.33%，3例患者出現(xiàn)輕微的副反應(yīng)，但是仍然有一部分患者的檢測(cè)結(jié)果不在有效范圍內(nèi)。根據(jù)我們對(duì)精神科藥物的長期監(jiān)測(cè)經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)患者血藥濃度控制在有效血藥濃度范圍，癥狀控制較好，而低于或高于有效血藥濃度的患者，抑郁癥時(shí)好時(shí)壞，容易反復(fù)發(fā)作。

2.2 兩種方法檢測(cè)的相關(guān)性評(píng)價(jià)

以均相酶免法測(cè)定的結(jié)果為Y，以柱切換-高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果為X，進(jìn)行線性回歸，方程為：Y=0.921 9X+0.050 1(n=60,r=0.899 9)；將均相酶免法測(cè)定結(jié)果和柱切換-高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行T檢驗(yàn)，其結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無差異(P>0.05)。經(jīng)過比對(duì)差異不顯著，但是均相酶免法測(cè)定的結(jié)果相對(duì)于柱切換-高效液相色譜法相對(duì)較低，究其原因?yàn)椋嗝该夥ㄔ谠噭┑臏?zhǔn)備中需要溫度的控制，酶的活性溫度為37 ℃，所以在試劑進(jìn)入機(jī)器檢測(cè)前，試劑的準(zhǔn)備尤為重要，而且均相酶免法需要生化儀器設(shè)備來完成，定標(biāo)和質(zhì)控的價(jià)格昂貴，有效期限短。相反，柱切換-高效液相色譜法測(cè)定艾司西酞普蘭的血藥濃度操作簡單，也無需對(duì)血清進(jìn)行預(yù)處理，試劑成本低，方法穩(wěn)定，檢測(cè)器本身能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)樣本中藥物小分子的檢測(cè)，故能滿足檢驗(yàn)科日常監(jiān)測(cè)工作。

3 討論

本研究采用柱切換HPLC法測(cè)定人血漿中艾司西酞普蘭的血藥濃度，該法具有很高的靈敏度和專屬性。均相酶免法測(cè)定的艾司西酞普蘭的血藥濃度是葡萄糖六磷酸脫氫酶-艾司西酞普蘭偶聯(lián)物抗體位點(diǎn)競爭性結(jié)合的產(chǎn)物，酶的活性、底物的活性都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，具有很高的特異性。柱切換-HPLC系統(tǒng)檢測(cè)血藥濃度在線聚集樣品，減少樣品前處理的損失，樣品進(jìn)入液相采用柱切換技術(shù)同向處理除去蛋白，可以防止分析柱的堵塞，從而具備良好的耐受性及可定量性，樣品處理簡單、結(jié)果準(zhǔn)確度高和自動(dòng)化程度高等，該技術(shù)適用于精神科藥物的血藥濃度監(jiān)測(cè)[5-7]。

均相酶免分析方法借助生化分析儀，其測(cè)定速度快、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、測(cè)定過程和柱切換高效液相法一樣不需前處理血清樣品，經(jīng)過定標(biāo)、質(zhì)控后，2 min內(nèi)即可出結(jié)果，試劑具有一定的穩(wěn)定性，操作過程簡便，數(shù)據(jù)處理過程已經(jīng)量化，無需計(jì)算[8,9]。但是HEI方法靈敏度對(duì)于有些藥物不能夠準(zhǔn)確檢測(cè)，測(cè)定時(shí)定標(biāo)、質(zhì)控都對(duì)樣品溫度和檢測(cè)溫度有一定的要求，反應(yīng)終點(diǎn)難于嚴(yán)格要求，同時(shí)均項(xiàng)酶免法對(duì)于精神科藥物的血藥濃度檢測(cè)試劑價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本過高，不利于臨床檢驗(yàn)，有待進(jìn)一步改進(jìn)[12-15]。

兩種方法檢測(cè)艾司西酞普蘭血藥濃度的檢測(cè)結(jié)果均可為臨床提供可靠的檢測(cè)結(jié)果，艾司西酞普蘭差異直接影響臨床醫(yī)師的用藥和個(gè)體治療，兩者檢測(cè)結(jié)果相近，對(duì)檢測(cè)結(jié)果有驗(yàn)證的作用，在臨床應(yīng)用中柱切換高效液相色譜法特異性和專一性強(qiáng)，較HEI法實(shí)用性強(qiáng)一點(diǎn)，能夠滿足艾司西酞普蘭的臨床檢測(cè)?；颊咴谝粋€(gè)用藥周期內(nèi)監(jiān)測(cè)艾司西酞普蘭血藥濃度應(yīng)采用同一種方法，以便為臨床提供精準(zhǔn)的個(gè)體檢測(cè)結(jié)果。