LncRNA MAGI2-AS3靶向調控miR-1277-5p對帕金森病細胞模型損傷的影響

徐 鑫，姚玉芳，張福波，苗 娜，王 男，楊潮萍

(滄州市中心醫(yī)院 1.中醫(yī)一科；2.神經內七科；3.神經內四科，河北 滄州 061000)

帕金森病是一種發(fā)病率較高的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，其發(fā)病機制與遺傳、黑質多巴胺神經元退行性病變及氧化應激密切相關，神經細胞氧化應激損傷是引起帕金森病的重要因素之一，1-甲基-4-苯基自由基離子(1-methyl- 4-phenylpy ridinium，MPP+)可引起神經細胞氧化應激損傷及促使細胞凋亡，并可用于建立帕金森病細胞模型的誘導劑[1-2]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長度超過220 nt的RNA分子，其可通過充當miRNA競爭性內源RNA分子而降解靶基因或抑制靶基因表達，進而參與帕金森病的形成過程[3-4]。LncRNA MAGI2-AS3在阿爾茨海默病和β-淀粉樣蛋白誘導的神經細胞中表達上調，下調其表達可抑制細胞炎癥反應及減輕細胞損傷[5]。但MAGI2-AS3在帕金森病發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚未見報道。生物信息學分析顯示MAGI2-AS3與miR-1277-5p存在結合位點，研究表明miR-1277-5p在MPP+誘導的SK-N-SH細胞中表達下調，抑制LncRNA NEAT1表達可通過miR-1277-5p/ARHGAP26軸抑制細胞炎癥反應、氧化應激及凋亡[6]。但MAGI2-AS3/miR-1277-5p軸在帕金森病形成過程中的作用機制尚未闡明。因此，本研究從2019年12月至2020年10月期間采用MPP+誘導SK-N-SH細胞建立帕金森病細胞模型，探討MAGI2-AS3是否可靶向調控miR-1277-5p的表達而參與帕金森病細胞模型損傷過程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人神經母細胞瘤細胞SK-N-SH購自美國ATCC；MPP+購自美國Sigma；DMEM購自美國Gibco；Lipofectamine2000、Trizol購自美國Invitrogen；反轉錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購自美國Thermo Fisher；si-NC、si-MAGI2-AS3、miR-NC、miR-1277-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-1277-5p購自廣州銳博生物；LDH、MDA、GSH檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；CCK-8、凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶；兔抗人Bcl-2、Bax與二抗購自美國Abcam。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 SK-N-SH細胞按照每孔1×104個細胞的密度接種于12孔板，于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)12 h后加入0.3 mmol/L的MPP+處理SK-N-SH細胞24 h[7]，記為MPP+組。將正常培養(yǎng)的SK-N-SH細胞記為Con組。用Lipofectamine2000試劑將si-NC、si-MAGI2-AS3、miR-NC、miR-1277-5p mimics分別轉染至SK-N-SH細胞12 h后加入0.3 mmol/L的MPP+處理細胞24 h，分別記為MPP++si-NC組、MPP++si-MAGI2-AS3組、MPP++miR-NC組、MPP++miR-1277-5p組。用Lipofectamine2000試劑將si-MAGI2-AS3與anti-miR-NC、si-MAGI2-AS3與anti-miR-1277-5p分別共轉染至SK-N-SH細胞12 h后加入0.3 mmol/L的MPP+處理細胞24 h，分別記為MPP++si-MAGI2-AS3+anti-miR-NC組、MPP++si-MAGI2-AS3+anti-miR-1277-5p組。

1.2.2 qRT-PCR檢測細胞中MAGI2-AS3、miR-1277-5p的表達水平 收集各組SK-N-SH細胞，用Trizol試劑分別提取細胞總RNA，利用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄合成cDNA，按照SYBR Green試劑盒說明書，分別以GAPDH和U6為內參進行qRT-PCR反應，得到Ct值，用2-ΔΔCt法計算MAGI2-AS3、miR-1277-5p相對表達量。MAGI2-AS3正向引物5’-TGGGTCTGTGCAGAGTTGAG-3’，反向引物5’-AGGGAGTCTAGGCCCCTTCT-3’；miR-1277-5p正向引物5’-TACGTAGATATATATGTATTTT-3’，反向引物5’-TTTTTTCTTTTTTTTCTTCGTT-3’；U6正向引物5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，反向引物5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’；GAPDH正向引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，反向引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。

1.2.3 檢測氧化應激指標LDH、MDA、GSH的含量 取各組SK-N-SH細胞培養(yǎng)上清液，利用試劑盒檢測LDH的含量，用反復凍融法裂解細胞后利用試劑盒檢測MDA、GSH的含量，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 CCK-8實驗檢測細胞增殖 各組SK-N-SH細胞消化后(3×103個/mL)接種于96孔板，于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育2 h，用美國Biotek公司生產的酶標儀檢測每孔在450 nm處的吸光度值并計算細胞存活率[實驗組OD值/對照組OD值×100%]。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取各組SK-N-SH細胞加入500 μL結合緩沖液重懸細胞，根據凋亡檢測試劑盒說明書分別加入5 μL Annexin V-FITC與5 μL PI，室溫孵育10 min后用FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率[(早期凋亡細胞+晚期凋亡細胞)/細胞總數×100%]。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測MAGI2-AS3與miR-1277-5p的靶向關系 根據MAGI2-AS3與miR-1277-5p相互作用片段的序列設計野生型載體WT-MAGI2-AS3及缺失MAGI2-AS3結合區(qū)域的突變型載體MUT-MAGI2-AS3，WT-MAGI2-AS3、MUT-MAGI2-AS3分別與miR-NC、miR-1277-5p mimics共轉染至SK-N-SH細胞，48 h后檢測其熒光素酶活性。

1.2.7 Western blot檢測Bcl-2、Bax蛋白表達 用RIPA裂解液提取SK-N-SH細胞總蛋白后用超微量分光光度計檢測蛋白濃度，將Loading buffer加入蛋白中沸水煮5 min蛋白變性，取40 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，用電轉方式將蛋白凝膠轉移至PVDF膜，將PVDF膜放入含有5%脫脂奶粉的封閉液中封閉2 h，以1∶1 000比例稀釋一抗后孵育PVDF膜，4 ℃孵育一抗過夜，二抗以1∶3 000的比例稀釋后室溫孵育PVDF膜1 h，ECL顯影，用Image J軟件分析各條帶灰度值。

2 結果

2.1 MPP+誘導的SK-N-SH細胞中MAGI2-AS3、miR-1277-5p表達量比較 與Con組比較，MPP+組MAGI2-AS3表達量升高(P<0.05)，miR-1277-5p表達量降低(P<0.05，見表1)。

表1 MPP+誘導的SK-N-SH細胞中MAGI2-AS3、miR-1277-5p表達量比較

2.2 干擾MAGI2-AS3表達對MPP+誘導的SK-N-SH細胞氧化應激的影響 與Con組比較，MPP+組LDH、MDA水平升高(P<0.05)，GSH水平降低(P<0.05)；與MPP++si-NC組比較，MPP++si-MAGI2-AS3組LDH、MDA水平降低(P<0.05)，GSH水平升高(P<0.05，見表2)。

表2 干擾MAGI2-AS3表達對MPP+誘導的SK-N-SH細胞氧化應激的影響

2.3 干擾MAGI2-AS3表達對MPP+誘導的SK-N-SH細胞增殖及凋亡的影響 與Con組比較，MPP+組細胞存活率降低(P<0.05)，凋亡率和Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；與MPP++si-NC組比較，MPP++si-MAGI2-AS3組細胞存活率升高(P<0.05)，凋亡率和Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，見圖1、表3。

圖1 干擾MAGI2-AS3表達對MPP+誘導的SK-N-SH細胞凋亡的影響

表3 干擾MAGI2-AS3表達對MPP+誘導的SK-N-SH細胞增殖及凋亡的影響

2.4 MAGI2-AS3靶向調控miR-1277-5p MAGI2-AS3與miR-1277-5p存在結合位點，見圖2A。轉染miR-1277-5p mimics可降低野生型載體WT-MAGI2-AS3的熒光素酶活性(P<0.05)，而未能影響MUT-MAGI2-AS3的熒光素酶活性，見圖2B。與pcDNA組比較，pcDNA-MAGI2-AS3組miR-1277-5p表達量降低(P<0.05)；與si-NC組比較，si-MAGI2-AS3組miR-1277-5p表達量升高(P<0.05)，見圖2C。

A：LncBase Predicted v.2預測顯示MAGI2-AS3與miR-1277-5p存在結合位點；B：雙熒光素酶報告基因實驗；C：MAGI2-AS3負向調控miR-1277-5p；*：與miR-NC組比較，P<0.05；#：與pcDNA組比較，P<0.05；&：與si-NC組比較，P<0.05。圖2 MAGI2-AS3靶向調控miR-1277-5p

2.5 miR-1277-5p過表達對MPP+誘導的SK-N-SH細胞氧化應激、增殖及凋亡的影響 與MPP++miR-NC組比較，MPP++miR-1277-5p組LDH、MDA的水平降低(P<0.05)，GSH的水平升高(P<0.05)，細胞存活率和Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，凋亡率和Bax蛋白水平降低(P<0.05)，見圖3、表4。

圖3 miR-1277-5p過表達對MPP+誘導的SK-N-SH細胞凋亡的影響

表4 miR-1277-5p過表達對MPP+誘導的SK-N-SH細胞氧化應激、增殖及凋亡的影響

2.6 抑制miR-1277-5p可逆轉干擾MAGI2-AS3表達對MPP+誘導的SK-N-SH細胞氧化應激、增殖及凋亡的作用 與MPP++si-MAGI2-AS3+anti-miR-NC組比較，MPP++si-MAGI2-AS3+anti-miR-1277-5p組LDH、MDA的水平升高(P<0.05)，GSH的水平降低(P<0.05)，細胞存活率和Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)，凋亡率和Bax蛋白水平升高(P<0.05)，見圖4、表5。

圖4 抑制miR-1277-5p可逆轉干擾MAGI2-AS3表達對MPP+誘導的SK-N-SH細胞凋亡的作用

表5 抑制miR-1277-5p可逆轉干擾MAGI2-AS3表達對MPP+誘導的SK-N-SH細胞氧化應激、增殖及凋亡的作用

3 討論

目前MAGI2-AS3與帕金森病相關報道尚少。本研究結果顯示，MPP+誘導的SK-N-SH細胞中MAGI2-AS3的表達量升高。研究表明MAGI2-AS3在胃癌中表達上調，并可促進胃癌細胞增殖及轉移[8]。但有研究發(fā)現MAGI2-AS3在肝癌細胞中表達下調，上調其表達可抑制細胞增殖及遷移[9]。提示MAGI2-AS3高表達量可能促進帕金森病的發(fā)生。氧化應激可誘導細胞凋亡從而造成細胞損傷，本研究結果顯示，MPP+誘導的SK-N-SH細胞中LDH、MDA水平升高，GSH水平降低，與既往研究結果相似[10]，提示成功建立帕金森病細胞模型。本研究發(fā)現干擾MAGI2-AS3表達后MPP+誘導的SK-N-SH細胞中LDH、MDA水平降低，GSH水平升高，提示干擾MAGI2-AS3表達可抑制MPP+誘導的SK-N-SH細胞氧化應激反應。氧化應激可促使神經細胞凋亡，抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax的比值降低，可促進細胞凋亡，其比值升高時抑制細胞凋亡[11]。本研究結果顯示，MPP+誘導的SK-N-SH細胞存活率降低，凋亡率和Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，而干擾MAGI2-AS3表達后MPP+誘導的SK-N-SH細胞存活率升高，凋亡率和Bax蛋白水平降低，Bcl-2蛋白水平升高，提示干擾MAGI2-AS3表達可促進MPP+誘導的SK-N-SH細胞存活而抑制細胞凋亡。但MAGI2-AS3在帕金森病細胞模型損傷中的作用機制仍需進一步探究。

本研究證實SK-N-SH細胞中MAGI2-AS3可靶向結合miR-1277-5p，并可負向調控miR-1277-5p的表達。研究表明LncRNA XIST通過充當miR-1277-5p的海綿分子而促進骨關節(jié)炎軟骨細胞外基質降解進而參與骨關節(jié)炎的發(fā)生過程[12]。miR-1277-5p在帕金森病細胞模型中表達下調，上調其表達可抑制細胞凋亡[13]。本研究結果顯示，MPP+誘導的SK-N-SH細胞中miR-1277-5p表達量降低，miR-1277-5p過表達可降低MPP+誘導的SK-N-SH細胞中LDH、MDA水平，而促使GSH水平升高，同時miR-1277-5p過表達后MPP+誘導的SK-N-SH細胞存活率升高，而凋亡率降低，進一步研究發(fā)現，抑制miR-1277-5p表達能夠拮抗干擾MAGI2-AS3表達對MPP+誘導的SK-N-SH細胞增殖、凋亡及氧化應激的作用。

綜上所述，MPP+誘導的SK-N-SH細胞中MAGI2-AS3的表達量升高，而miR-1277-5p的表達量降低，干擾MAGI2-AS3表達可通過上調miR-1277-5p而抑制MPP+誘導的SK-N-SH細胞氧化應激反應、凋亡及促進細胞增殖，MAGI2-AS3/miR-1277-5p軸可參與帕金森病細胞模型損傷過程，并可能作為帕金森病治療的潛在靶點，還可為進一步揭示帕金森病的發(fā)病機制奠定實驗基礎。但下一步將進行體內動物實驗驗證MAGI2-AS3在帕金森病形成過程中的可能作用機制。