基于UPLC-MS/MS白虎湯成分大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究

付婷婷， 呂邵娃 ，景夢曉 ，劉紫衡 ，臧玲玲，李永吉*

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院， 哈爾濱150040； 2.海南衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院， ?？?570100)

白虎湯為湯劑經(jīng)典名方，由石膏、知母、甘草以及粳米組成，在《傷寒雜病論》中被張仲景譽為“寒劑之祖方”，用于治療陽明熱癥和氣分熱證，解熱效果顯著，并能夠抑制炎癥反應(yīng)[1].有文獻報道[2-4]采用高效液相法測定白虎湯中的成分的含量.也有學(xué)者采用超高效液相色譜法研究不同配伍對白虎湯中某一種成分的影響[5-6].基于HPLC法的檢測靈敏度低[7]，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)具有靈敏度高、檢出限低、樣品用量少的優(yōu)點[8],廣泛用于化學(xué)成分[9]、藥物代謝[10]、雜質(zhì)鑒定[11]等藥物分析中.所以本研究建立測定大鼠血漿中芒果苷、甘草酸銨質(zhì)量濃度的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法,并研究血藥質(zhì)量濃度及藥動學(xué)規(guī)律,為白虎湯臨床藥學(xué)基礎(chǔ)研究提供科學(xué)實驗依據(jù).

1 實驗材料與儀器

炙甘草(批號:170201,安徽廣印堂中藥股份有限公司)；石膏(批號:SAO251安徽廣印堂中藥股份有限公司)；知母(批號:20160512北京本草方源藥業(yè)有限公司)；粳米；芒果苷對照品(批號:DST180513-010成都德思特生物技術(shù)有限公司)；新芒果苷對照品(批號: DST180630 -017成都德思特生物技術(shù)有限公司)；甘草酸銨(批號:DST180422-012成都德思特生物技術(shù)有限公司)；甘草苷(批號:DST180321-014成都德思特生物技術(shù)有限公司)；磺胺甲噁唑(批號:723-46-6阿拉丁生化科技股份有限公司)； ACQUITY UPLC BEH C18(美國Waters公司)；甲酸(美國Fisher公司)；乙腈(德國Merck公司)；甲醇(德國Merck公司).

梅特勒天平(瑞士METTLER公司)；SB-5200D-超聲波清洗機(寧波新芝生物科技有限公司SB-5200D)；UPLC(美國Waters公司)； 高速離心機TGL-16C(上海安亭科學(xué)儀器廠)；HZS-HA 水浴振蕩儀(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)；HgC-12A 型氮氣吹掃儀(上海楚定分析儀器有限公司)；A110280 渦旋震蕩器(南京稼竣生物科技有限公司)；T12型體溫計(健奧可有有限公司)；Waters Xevo TQD型液相質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司).

清潔級SD大鼠(200±20)g，雄性. 購于青島市動物實驗中心(許可證編號：SCXK(魯) 2014-0001).

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液

精密稱定芒果苷、甘草酸銨對照品適量，用甲醇溶解配置成對應(yīng)質(zhì)量濃度混合對照品作為儲備液，芒果苷質(zhì)量濃度分別為6 250、3 125、1 562.5、781.25、390.62、195.31、97.66、48.83、24.41、12.21、6.10、3.05 ng·mL-1，甘草酸銨也分別配制成6 250、3 125、1 562.5、781.25、390.62、195.31、97.66、48.83、24.41、12.21、6.10、3.05 ng·mL-1相同系列質(zhì)量濃度溶液.

2.1.2 內(nèi)標物溶液

另取磺胺甲噁唑適量，用甲醇稀釋50 ng·L-1的內(nèi)標溶液，存放在-20 ℃的冰箱，備用.

2.1.3 供試品溶液

取知母6兩(93.75 g)，甘草2兩(31.25 g)，粳米6合(120 mL)于水一斗(1 981 mL)中浸泡30 min，加入生石膏1斤碎(250 g)共同轉(zhuǎn)入砂鍋中，武火煮沸后轉(zhuǎn)至文火煎煮40 min，四層紗布趁熱過濾得到白虎湯湯液約850 mL.取1 mL白虎湯液，用50%甲醇水溶液溶解并定容于10 mL容量瓶中，超聲30 min，4 000 r·min-1離心15 min，取上清液約2 mL，0.22 μm過濾，濾液作為供試品溶液.

2.2 色譜條件及質(zhì)譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動相 A：乙腈，流動相B：0.1%甲酸，流速0.3 mL·min-1，進樣量4 μL.梯度洗脫條件：0～1 min，5%～10%B；1～3 min，10%～14%B；3～5 min，14%～18%B；5～6 min，18%B；6～9 min，18%～19%B；9～12 min，19%～55%B；12～15 min，55%～62%B.

離子源：ESI源，正離子監(jiān)測模式，離子源溫度350 °C，錐孔電壓范圍2～100 V，碰撞能范圍2～80 V，掃描范圍m/z：20～1 200，氮氣流速：500 L·h-1，掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM模式)，碰撞氣體：氦氣.內(nèi)標物錐孔電壓28 V，碰撞能8 V；芒果苷錐孔電壓34 V，碰撞能22 V；甘草酸銨錐孔電壓22 V，碰撞能36 V.

2.3 血漿樣品預(yù)處理

凍存的大鼠血漿樣品自然解凍到室溫，取血漿100 μL，加入50 μL內(nèi)標溶液(50 ng·mL-1磺胺甲噁唑溶液)，加入300 μL甲醇溶液除蛋白，渦旋30 s，超聲2 min，13 000 r·min-1離心10 min，40 ℃N2吹干，100 μL甲醇復(fù)溶，超聲2 min，13 000 r·min-1離心10 min，取上清液進樣待測.

2.4 專屬性考察

在上述色譜和質(zhì)譜條件下對空白血漿加入芒果苷、甘草酸銨混標的樣品及大鼠給藥后血漿樣品注入UPLC-MS/MS系統(tǒng)中分析，根據(jù)結(jié)果可見在正離子模式下的芒果苷、甘草酸銨和內(nèi)標物磺胺甲噁唑的保留時間分別為6.80 、13.31、9.87 min.表明芒果苷、甘草酸銨和內(nèi)標物在進行離子對提取時，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對毒效成分的無影響.結(jié)果見圖1、2.

2.5 線性、標準曲線以及定量限

精密吸取芒果苷、甘草酸銨標準溶液100 μL，磺胺甲噁唑50 μL，加入大鼠空白血漿100 μL，按2.3項下操作制備成相應(yīng)的血藥質(zhì)量濃度的樣品，以芒果苷、甘草酸銨與內(nèi)標物峰面積之比為縱坐標，芒果苷、甘草酸銨質(zhì)量濃度為橫坐標，以最小二乘法進行線性回歸獲得線性回歸方程，及相關(guān)系數(shù)r，繪制標準曲線.甘草苷標準曲線方程y=0.000 9x-0.010 2，r=0.998 7，線性范圍3.05～6 250 ng·mL-1，定量限3.05 ng·mL-1；甘草酸銨標準曲線方程y=0.000 05x-0.013 7，r=0.9955，線性范圍18.304～18 750 ng·mL-1，定量限18.304 ng·mL-1.根據(jù)《臨床前藥代動力學(xué)指導(dǎo)原則》要求分析物以上制備的QC樣品重復(fù)測定6次，其準確度(RE)應(yīng)該在20%之間且相對標準偏差(RSD)小于20%，當信噪比應(yīng)大于10；芒果苷、甘草酸銨相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99，各分析物在其相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系.

2.6 精密度試驗

取含有高、中、低三個標準品質(zhì)量濃度的血液樣品溶液，按照“2.3 血漿樣品處理方法”進行處理，每個質(zhì)量濃度進行平行 6 次進樣檢測，計算對照品峰面積與內(nèi)標物峰面積比值的RSD分別為：芒果苷高、中、低質(zhì)量濃度(781.25 ng·mL-1、97.656 ng·mL-1、12.207 ng·mL-1)RSD值分別為8.214%、7.558%、7.355%.甘草酸銨高中低質(zhì)量濃度(4 687 ng·mL-1、585.75 ng·mL-1、73.218 ng·mL-1)RSD值分別為8.252%、7.975%、7.814%.

圖1 空白血漿中混標物質(zhì)各成分定量離子對質(zhì)譜圖Figure 1 Quantitative ion pair mass spectrometry of mixed standard substances in blank plasma

圖2 大鼠灌胃給藥后血漿樣品中物質(zhì)質(zhì)譜離子圖Figure 2 Mass spectrometry ion map in plasma samples of rats after intragastric administration

2.7 提取回收率

取空白血漿100 μL，加入100 μL高、中、低對照品溶液和50 μL內(nèi)標溶液，再加入300 μL甲醇溶液除蛋白后，按照2.3項進行處理，進樣分析，得色譜峰面積記為A.取空白血漿100 μL，按照2.3項處理方法進行處理，再加入300 μL甲醇溶液除蛋白后，加入高、中、低標準品溶液和50 μL內(nèi)標溶液，N2吹干，再加100 μL甲醇復(fù)溶，超聲2 min，13 000 r·min-1離心10 min，進樣分析，得色譜峰面積記為B，A/B*100%即為提取回收率.經(jīng)測定，芒果苷在低、中、高三個質(zhì)量濃度(12.21、97.66、781.25 ng·mL-1)的提取回收率分別為(87.15±1.93)%，(91.13±3.05)%，(94.05±3.02)%；芒果苷在低、中、高三個質(zhì)量濃度(73.22、585.75、4687.00 ng·mL-1)的提取回收率分別為(84.97±2.97)%，(94.15±3.11)%，(100.33±3.75)%.

2.8 穩(wěn)定性試驗

取上述含有高、中、低三個標準品質(zhì)量濃度的血液樣品溶液，按照“2.3 血漿樣品處理方法”進行處理，于-20 ℃下在 0、6、24 h 放置后分別進樣，每個質(zhì)量濃度平行 6 次進樣檢測.以質(zhì)量濃度進行計算，每個質(zhì)量濃度樣品與真實質(zhì)量濃度的偏差均不超過±13(RE/%)，并且同質(zhì)量濃度測定值的RSD不超過(±12)%.

2.9 藥代動力學(xué)研究

2.9.1 藥動學(xué)試驗方案

SD 雄性發(fā)熱模型大鼠12只，隨機分2組，每組6只，分別灌胃給藥，正常組：生理鹽水，3 mL/200 g；白虎湯組：3 mL/200 g.分別于給藥后 15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、10 h，于各時間點眼眶取血 1.5 mL，置于EDTA-2Na處理后的抗凝管中，3 000 r·min-1離心 10 min，分離上層血漿，于-80 ℃保存?zhèn)溆?

2.9.2 藥時曲線

按2.3項下處理方法將大鼠血漿樣品進行預(yù)處理，在上述的色譜和質(zhì)譜條件下，將處理好的血漿樣品進入UPLC-MS/MS中分析并記錄各待測物的色譜峰面積，以當日的標準曲線計算大鼠血漿中芒果苷、甘草酸銨質(zhì)量濃度.對每組大鼠的血藥質(zhì)量濃度與時間進行數(shù)據(jù)處理并繪制血藥質(zhì)量濃度-時間曲線.見圖3.

圖3 藥時曲線Figure 3 Time-concentration curve

2.9.3 藥動學(xué)參數(shù)

上述藥-時曲線數(shù)據(jù)通過DAS 2.0軟件處理后，得出白虎湯中的芒果苷和甘草酸銨在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)過程屬于非房室模型，最終采用統(tǒng)計矩分析方法求算各藥動學(xué)參數(shù)，芒果苷藥動學(xué)參數(shù)分別是AUC(0-t)為(2 292.855±60.13)μg·L-1·h、AUC(0-∞)為(2 363.501±62.561)μg·L-1·h、MRT(0-t)為(4.313±0.036) h、MRT(0-∞)為(4.593±0.06)h、Tmax為5 h、Cmax為(668.749±14.645)μg·L-1；甘草酸銨藥動學(xué)參數(shù)分別是AUC(0-t)為(6 249.021±94.464)μg·L-1·h、AUC(0-∞)為(7 656.155±260.932)μg·L-1·h、MRT(0-t)為(5.079±0.031) h、MRT(0-∞)為(6.751±0.272) h、Tmax為5 h、Cmax為(1 210.931±71.225)μg·L-1.

3 討 論

3.1 色譜及質(zhì)譜條件的選擇

采用UPLC-MS/MS對指標性成分進行藥代動力學(xué)研究，色譜條件對各成分的保留時間、峰型、響應(yīng)值均有較大的影響，分別考察了磷酸緩沖鹽-水、乙腈-水、(0.1%)甲酸-水、甲醇-水溶液作為流動相，當選擇(0.1%)甲酸-水作為流動相時，色譜峰峰較好，對洗脫梯度進行多次洗脫和優(yōu)化，確定最終的洗脫條件.為了獲得最佳的質(zhì)譜條件，通過正、負離子模式進行監(jiān)測，芒果苷、甘草酸銨在正離子模式下響應(yīng)度較高，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件具有較好的靈敏度和信號強度，因此確定正離子模式進行檢測；優(yōu)化各種參數(shù)后質(zhì)譜參數(shù)能夠滿足生物樣品中有效物質(zhì)的準確定量的要求.

3.2 內(nèi)標物的選擇

在生物樣品的分析中，理想的內(nèi)標物具有良好的溶解性，與被測樣品不起化學(xué)反應(yīng)，且其出峰位置應(yīng)與分析物的峰相近[12].本課題先后選擇對乙酰氨基酚和磺胺甲噁唑為內(nèi)標物，只有磺胺甲噁唑滿足作為內(nèi)標物的必要條件，對芒果苷、甘草酸銨的測定也有良好的響應(yīng)，該模式下芒果苷、甘草酸銨出峰時間分別6.80 min、13.31 min，而內(nèi)標在9.87 min出峰，回收率穩(wěn)定，因此選擇磺胺甲噁唑作為研究選用的內(nèi)標物.

3.3 血漿樣品處理方法的選擇

常用的生物樣品預(yù)處理方法主要有：液-液萃取法(LLE)、固相萃取法(SPE)、蛋白沉積物法(PPT).固相萃取法操作步驟繁瑣且萃取小柱價格高昂，加大了成本負擔(dān)[13].液-液萃取操作人員需要一定的專業(yè)技能，不適于臨床大批量測定[14].而蛋白沉積物法具有操作簡單，提取回收率較好的優(yōu)勢[15].本實驗采用甲醇為溶劑進行蛋白沉積物，結(jié)果顯示甲醇沉積物蛋白的方法簡單，去除蛋白效果良好.

3.4 結(jié)果分析

本文采用UPLC-MS/MS法測定白虎湯在SD 大鼠體內(nèi)血漿中藥物含量，結(jié)果表明，芒果苷藥動學(xué)存在雙峰現(xiàn)象，有可能存在肝腸循環(huán).該方法準確度高、靈敏度強、專屬性好，可作為測定白虎湯中芒果苷、甘草酸銨質(zhì)量濃度的方法，為探討白虎湯的藥動學(xué)行為提供方法依據(jù).此前，只有測定白虎湯中一種或幾種成分含量的相關(guān)研究，未見對白虎湯藥動學(xué)方面的研究，該實驗對白虎湯藥動學(xué)做出討論，為白虎湯以后的全面研究打好基礎(chǔ)，為經(jīng)典名方白虎湯的繼承和發(fā)揚提供幫助.