間充質(zhì)干細(xì)胞中血紅素加氧酶-1的過表達(dá)抑制NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3炎癥小體活化改善大鼠急性肺損傷

許欣婷 張瑤 陳麗展 張芳

急性肺損傷(ALI)是一種由多種病因引起的以急性進(jìn)行性呼吸困難和頑固性低氧血癥為特征的疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，發(fā)病率及死亡率均較高[1]。ALI的特征是肺組織水腫和損傷、氣體交換受損、嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致彌漫性肺泡損傷、嚴(yán)重低氧血癥、肺順應(yīng)性降低[2]。幾十年來，人們?cè)谔剿鰽LI治療策略和措施方面取得了一些進(jìn)步，但仍未開發(fā)出ALI最優(yōu)的治療策略[3]。因此，有必要繼續(xù)探究新穎有效的ALI治療策略。NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)是一種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，NLRP3炎癥小體是由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)和半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)組成的復(fù)合物。NLRP3炎癥小體的激活與ALI疾病進(jìn)展及炎癥反應(yīng)有關(guān)[4]。最近的研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可以移植到受損的肺部，通過歸巢，轉(zhuǎn)移至炎癥部位，分化為肺泡上皮細(xì)胞，并發(fā)揮修復(fù)氣血屏障的多潛能來減輕炎癥的發(fā)生[5]。已有研究證明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植可減輕香煙煙霧和副流感嗜血桿菌所致的慢性阻塞性肺疾病小鼠肺損傷，該作用是通過抑制炎癥信號(hào)通路，減少炎癥發(fā)生實(shí)現(xiàn)的[6]。血紅素加氧酶-1(HO-1)是一種抗氧化和抗凋亡的酶。在缺血/再灌注誘導(dǎo)的急性腎損傷的研究中，HO-1通過促進(jìn)BMSCs的增殖和分化，進(jìn)一步增強(qiáng)BMSCs對(duì)急性腎損傷大鼠的治療作用，改善大鼠腎功能[7]。綜上所述，本研究旨在探究過表達(dá)HO-1的BMSCs對(duì)ALI大鼠的作用及其作用機(jī)制是否與調(diào)控NLRP3炎癥小體的激活相關(guān)，以期為開發(fā)新的ALI治療策略提供依據(jù)。

材料與方法

1.材料：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：50只雄性SD大鼠(4周齡，體重80～100 g)購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(陜)2019-001]，飼養(yǎng)在環(huán)境溫度24～26 ℃、環(huán)境濕度55%～60%的動(dòng)物房中，光/暗周期為12 h/12 h，大鼠自由飲水和進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)材料：茜素紅染色液(G1452)、油紅O染色液(G1262)和脂多糖(LPS，L8880)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；過表達(dá)HO-1重組慢病毒液和陰性對(duì)照(NC)重組慢病毒液購(gòu)自上海吉滿生物科技有限公司；FITC-CD44(ab189524)、FITC-CD90(181469)、FITC-CD105(ab252345)、FITC-CD45(ab40763)、FITC-CD34(ab81289)、FITC-HLA-DR(ab92511)、NLRP3(ab263899)抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit(6110A)購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix(HY-K0522)購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司；BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒(PA115-01)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；HO-1(P249)和cleaved-Caspase-1(4199T)抗體均購(gòu)自美國(guó)cell signaling technology公司；表面活性蛋白C(SP-C)(HK4743)和ASC抗體(HK3961)均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；GAPDH抗體(A01020)購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α(H052-1)、白細(xì)胞介素(IL)-6(H007-1-1)和IL-1β(H002)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

2.方法

(1)BMSCs的分離與培養(yǎng):隨機(jī)取10只SD大鼠，10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后處死。取大鼠雙側(cè)股骨和脛骨，剪開兩骨骺端，使用注射器吸取DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，一共沖洗3次。將細(xì)胞懸液加入到預(yù)先裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管內(nèi)，2 000 r/min離心20 min，吸取中層BMSCs。用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以1×106個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞每2天更換一次新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，以0.25%胰酶液消化細(xì)胞，以1∶3比例傳代培養(yǎng)。

(2)茜素紅染色檢測(cè)BMSCs成骨分化潛能：取處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的BMSCs，以3×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，細(xì)胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，連續(xù)誘導(dǎo)21天后，棄去舊培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞后，4%多聚甲醛室溫條件下固定細(xì)胞15 min。PBS清洗細(xì)胞后，加入茜素紅染液，染色5 min，PBS清洗細(xì)胞后，顯微鏡下觀察并拍照，鈣沉積陽性細(xì)胞呈現(xiàn)橘紅色。

(3)油紅O染色檢測(cè)BMSCs成脂分化潛能：取處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的BMSCs，以3×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，細(xì)胞于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，添加成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)誘導(dǎo)21天。棄去細(xì)胞舊培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞，4%多聚甲醛室溫條件下固定細(xì)胞15 min。PBS清洗細(xì)胞后，加入油紅O染色液染色10 min。用75%酒精漂洗細(xì)胞以去除多余的染料。顯微鏡下觀察并拍照，脂類物質(zhì)呈紅色著染，細(xì)胞核呈藍(lán)色著染。

(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs典型表面標(biāo)志物的表達(dá)：取處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的BMSCs，加入PBS重懸細(xì)胞，再加入FITC-CD44(1∶200)、FITC-CD90(1∶200)、FITC-CD105(1∶200)、FITC-CD45(1∶200)、FITC-CD34(1∶200)、和FITC-HLA-DR(1∶200)抗體，避光孵育30 min，離心收集細(xì)胞。PBS洗滌細(xì)胞并重懸。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD44、CD90、CD105、CD45、CD34和HLA-DR陽性細(xì)胞比例。

(5)慢病毒感染：取處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的BMSCs，以1×105個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)量接種于6孔板中，細(xì)胞于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞隨機(jī)分為BMSCs組(添加PBS)、BMSCs-NC組(添加50 MOI NC重組慢病毒液)和BMSCs-HO-1組(添加50 MOI過表達(dá)HO-1重組慢病毒液)。棄去新鮮培養(yǎng)基，添加含2% FBS、6 μg/ml polybrene的DMEM培養(yǎng)基，根據(jù)分組添加重組慢病毒液。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(6)大鼠ALI模型的建立及給藥處理:造模前，40只SD大鼠禁食12 h。將SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、BMSCs-NC組和BMSCs-HO-1組，每組各10只，模型組、BMSCs-NC組和BMSCs-HO-1組大鼠應(yīng)用腹腔注射LPS(5 mg/kg)建立ALI大鼠模型[8]，對(duì)照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。隨后BMSCs-NC組大鼠尾靜脈注射BMSCs-NC細(xì)胞(1×106個(gè))，BMSCs-HO-1組大鼠尾靜脈注射BMSCs-HO-1細(xì)胞(1×106個(gè))，對(duì)照組和模型組大鼠尾靜脈注射生理鹽水。48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

(7)肺泡灌洗液(BALF)炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)和炎癥因子水平檢測(cè)：10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠，分離大鼠氣管，結(jié)扎大鼠右主支氣管和肺門后，插入灌洗管，用預(yù)冷的PBS灌洗左肺，并回收BALF?；厥盏腂ALF在4 ℃條件下1 500 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)水平。PBS重懸細(xì)胞沉淀，涂片，進(jìn)行Giemsa染色，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)和巨噬細(xì)胞數(shù)。

(8)蘇木素-伊紅(HE)染色檢測(cè)肺組織病理學(xué)變化：10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后處死大鼠。取大鼠肺組織，10%福爾馬林固定組織24 h。梯度酒精脫水，二甲苯透明。將組織塊置于融化的石蠟中，直至石蠟完全浸入。組織包埋、切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水化。蘇木素染液染色3 min，自來水沖洗；1%鹽酸酒精分化3 s，自來水沖洗；0.6%氨水返藍(lán)，自來水沖洗。伊紅染液染色1 min；梯度酒精脫水，二甲苯透明。滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片封固，顯微鏡下觀察拍照。根據(jù)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡壁透明膜形成、肺泡壁水腫增厚、肺泡腔內(nèi)出血及水腫情況進(jìn)行肺損傷程度評(píng)分：0分：無病理變化；1分：輕度病理變化；2分：中度病理變化；3分：重度病理變化；4分：非常嚴(yán)重的病理變化[9]。

(9)大鼠肺組織濕/干重比(W/D)測(cè)定：取大鼠肺組織，先用濾紙吸干組織表面的水分和殘留的血液，稱量此時(shí)肺組織的濕重(W)。隨后將肺組織置于65 ℃烘箱中干燥24 h，稱量此時(shí)肺組織的干重(W)，計(jì)算大鼠肺組織濕/干重比(W/D)。

(10)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞和肺組織中HO-1和SP-C mRNA表達(dá)水平：收集BMSCs及各組大鼠肺組織，加入Trizol試劑，提取細(xì)胞和組織中的總RNA。隨后按照PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit說明書所示，合成cDNA，此為qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中所需的模板。按照2×SYBR Green qPCR Master Mix說明書所示，配制qRT-PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算HO-1和SP-C mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)中所需引物序列見表1。

表1 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中所需引物序列

(11)蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)BMSCs和大鼠肺組織中HO-1、SP-C、NLRP3、ASC和cleaved-Caspase-1蛋白表達(dá)水平：收集BMSCs及各組大鼠肺組織，采用蛋白裂解液裂解細(xì)胞和組織，冰上反應(yīng)30 min。離心收集上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)上清液蛋白水平。取30 μg蛋白加入凝膠上樣孔中，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上。封閉液室溫封閉3 h。加入HO-1(1∶1 000)、SP-C(1∶1 000)、NLRP3(1∶1 000)、ASC(1∶1 000)、cleaved-Caspase-1(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)抗體，于4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜。加入二抗(1∶5 000)，室溫條件下孵育1 h。滴加ECL超敏化學(xué)發(fā)光液至膜上，暗室曝光，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行蛋白條帶半定量分析。

結(jié) 果

1.大鼠BMSCs的分離與鑒定：原代BMSCs培養(yǎng)7 d后，可見細(xì)胞已貼壁，細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)整，形態(tài)多呈紡錘形。誘導(dǎo)成骨分化后，在BMSCs中也觀察到大量致密的鈣結(jié)節(jié)。同時(shí)，誘導(dǎo)成脂分化后，在BMSCs中觀察到彌漫分布的紅色脂滴。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs典型表面標(biāo)志物的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，BMSCs表達(dá)CD44、CD90和CD105，但不表達(dá)CD45、CD34和HLA-DR。以上數(shù)據(jù)表明成功分離得到了BMSCs，可應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3組BMSCs中HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較：與BMSCs組相比，BMSCs-NC組BMSCs中HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與BMSCs-NC組相比，BMSCs-HO-1組BMSCs中HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 3組BMSCs中HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

3.4組大鼠BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)比較：與對(duì)照組相比，模型組大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)和巨噬細(xì)胞數(shù)均明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，BMSCs-NC組大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)和巨噬細(xì)胞數(shù)均明顯降低(P<0.05)；與BMSCs-NC組相比，BMSCs-HO-1組大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)和巨噬細(xì)胞數(shù)均明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

4.4組大鼠BALF中炎癥因子水平比較：與對(duì)照組相比，模型組大鼠BALF中TNF-α、IL-6和IL-1β水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，BMSCs-NC組大鼠BALF中TNF-α、IL-6和IL-1β水平明顯降低(P<0.05)；與BMSCs-NC組相比，BMSCs-HO-1組大鼠BALF中TNF-α、IL-6和IL-1β水平明顯降低(P<0.05)。見表4。

表4 4組大鼠BALF中炎癥因子水平比較

5.4組大鼠肺組織中HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較：與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織中HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，BMSCs-NC組大鼠肺組織中HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與BMSCs-NC組相比，BMSCs-HO-1組大鼠肺組織中HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見表5。

表5 4組大鼠肺組織中HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

6.4組大鼠肺組織病理學(xué)變化情況及W/D比較：對(duì)照組大鼠肺組織無明顯異常；與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織出現(xiàn)明顯病變，肺泡水腫、炎癥細(xì)胞堆積和肺泡上皮細(xì)胞變性壞死，肺損傷評(píng)分和W/D明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，BMSCs-NC組大鼠肺組織病理學(xué)變化得到明顯改善，肺損傷評(píng)分和W/D明顯降低(P<0.05)；與BMSCs-NC組相比，BMSCs-HO-1組大鼠肺組織病理學(xué)變化得到明顯改善，肺損傷評(píng)分和W/D明顯降低(P<0.05)。見表6。

表6 4組大鼠肺損傷評(píng)分和W/D比較

7.4組大鼠肺組織中SP-C mRNA和蛋白表達(dá)水平比較：與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織中ATⅡ細(xì)胞特異性標(biāo)志物SP-C mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，BMSCs-NC組大鼠肺組織中SP-C mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與BMSCs-NC組相比，BMSCs-HO-1組大鼠肺組織中SP-C mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見表7。

表7 4組大鼠肺組織中SP-C mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

8.4組大鼠肺組織中NLPR3、ASC和cleaved-Caspase-1蛋白表達(dá)水平比較：與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織中NLPR3、ASC和cleaved-Caspase-1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，BMSCs-NC組大鼠肺組織中NLPR3、ASC和cleaved-Caspase-1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與BMSCs-NC組相比，BMSCs-HO-1組大鼠肺組織中NLPR3、ASC和cleaved-Caspase-1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表8。

表8 4組大鼠肺組織中NLPR3、ASC和cleaved-Caspase-1蛋白表達(dá)水平比較

討 論

ALI的發(fā)病機(jī)制主要是過度的肺部炎癥和中性粒細(xì)胞過度浸潤(rùn)肺組織，釋放促炎細(xì)胞因子，損傷肺內(nèi)皮和上皮細(xì)胞，導(dǎo)致肺水腫和氣體交換功能受損[10]。目前，盡管ALI的治療干預(yù)措施(如肺保護(hù)性機(jī)械通氣和液體管理)取得了較大進(jìn)展，但ALI總死亡率仍保持在40%左右[11]。因此，繼續(xù)探索ALI新的治療策略對(duì)ALI的臨床防治具有重要意義。

LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，可引起機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)的紊亂，可用于制備ALI動(dòng)物模型，誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[12]。越來越多的證據(jù)表明，BMSCs治療能夠抑制ALI小鼠肺部炎癥，減少氧化損傷和中性粒細(xì)胞胞外陷阱的釋放，最終提高治療動(dòng)物的生存率。該研究表明，BMSCs是基于細(xì)胞治療ALI的一種有效方式[13]。此外，BMSCs表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)特性，可以保護(hù)肺泡毛細(xì)血管膜免受免疫損傷，并通過分泌有益的可溶性因子恢復(fù)肺泡液的清除[14]。然而，在持續(xù)缺氧缺血和過度炎癥的環(huán)境下，移植的MSCs存活率較低，這成為MSCs用于治療炎癥性疾病的主要限制性因素[15]。因此，提高移植MSCs的存活率對(duì)修復(fù)受損組織具有重要意義。此外，MSCs具有自我更新、低免疫原性和易擴(kuò)張性的特點(diǎn)，這使得MSCs可以作為一種理想的載體以加載保護(hù)性基因，最大限度地發(fā)揮MSCs的益處[16]。HO-1是抑制氧化應(yīng)激、促炎細(xì)胞因子和促凋亡因子作用的關(guān)鍵成分[17]。上調(diào)HO-1的表達(dá)可改善ALI動(dòng)物模型肺組織病理?yè)p傷、肺水腫、脂質(zhì)過氧化，阻止細(xì)胞死亡[18]。有證據(jù)顯示，MSCs與肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PVECs)共培養(yǎng)可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的PVECs損傷，抑制炎癥和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生；而與MSCs相比，過表達(dá)HO-1的MSCs可進(jìn)一步改善LPS誘導(dǎo)的PVECs損傷，抑制炎癥和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，表明過表達(dá)HO-1可增強(qiáng)MSCs對(duì)LPS誘導(dǎo)的PVECs損傷的抑制作用[19]。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)建立的ALI大鼠肺組織出現(xiàn)明顯病變，肺泡水腫、炎癥細(xì)胞堆積和肺泡上皮細(xì)胞變性壞死，ATⅡ細(xì)胞特異性標(biāo)志物SP-C表達(dá)水平降低，炎癥細(xì)胞數(shù)和炎癥因子水平明顯升高。BMSCs治療可明顯改善ALI大鼠肺組織病理學(xué)變化，促進(jìn)SP-C表達(dá)，抑制炎癥細(xì)胞數(shù)和炎癥因子水平的升高，而與BMSCs相比，過表達(dá)HO-1的BMSCs對(duì)ALI的改善作用進(jìn)一步增強(qiáng)，表明過表達(dá)HO-1可增強(qiáng)BMSCs對(duì)ALI的保護(hù)作用。

NLRP3是一種細(xì)胞質(zhì)模式識(shí)別受體，可被某些病原體相關(guān)分子模式或損傷相關(guān)分子模式激活，如細(xì)菌、病毒和ATP[20]。NLRP3的激活導(dǎo)致適配器ASC的組裝，導(dǎo)致pro-Caspase-1的自激活并裂解為酶成熟的Caspase-1，進(jìn)一步將pro-IL-1β和pro-IL-18分別裂解為成熟的IL-1β和IL-18[21]。盡管NLRP3炎癥小體的激活是一種宿主防御機(jī)制，以消除感染性疾病中入侵的病原體，但NLRP3炎癥小體的過度激活也是異常炎癥、組織損傷和器官功能障礙的核心因素[22]。最近的研究表明，在ALI小鼠模型中，NLRP3炎癥小體被激活，而抑制NLRP3炎癥小體激活可抑制TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生，改善ALI小鼠肺組織病理學(xué)變化[23]。在一項(xiàng)關(guān)于2型糖尿病的研究中發(fā)現(xiàn)，MSCs可通過抑制NLRP3炎癥小體的激活，抑制IL-1β、IL-18和TNF-α的產(chǎn)生，從而減輕胰島素抵抗[24]。另外，MSCs在柯薩奇病毒B3誘導(dǎo)的心肌炎中具有心臟保護(hù)作用，該作用主要是通過抑制NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18的表達(dá)實(shí)現(xiàn)[25]。本研究中，BMSCs治療可明顯抑制NLRP3、ASC和Caspase-1的表達(dá)，降低IL-1β和TNF-α水平。有研究發(fā)現(xiàn)，一氧化碳作為HO-1氧化代謝的產(chǎn)物，可以通過抑制NLRP3炎癥小體的激活來保護(hù)肺免于炎癥損傷[26]。因此我們通過給予過表達(dá)HO-1的BMSCs.進(jìn)一步促進(jìn)體內(nèi)BMSCs的增殖和分化，并且由于HO-1具有抑制炎癥小體激活的作用，ALI大鼠肺組織中NLRP3、ASC和Caspase-1表達(dá)水平明顯升高，IL-1β和TNF-α水平明顯升高，與BMSCs相比，過表達(dá)HO-1的BMSCs對(duì)ALI的抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)，從而發(fā)揮對(duì)ALI的治療作用。本研究結(jié)果表明，過表達(dá)HO-1可增強(qiáng)BMSCs對(duì)ALI大鼠NLRP3炎癥小體激活的抑制作用。

綜上所述，過表達(dá)HO-1的BMSCs可能通過抑制NLRP3炎癥小體激活，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)ATⅡ細(xì)胞的形成，改善大鼠ALI。