一種新的適用于活體斑馬魚成像觀察的固定方法

陳二方 常會(huì)敏 安曉剛 邱建華 查定軍

摘要 [目的] 建立一種更適用于活體斑馬魚成像的固定方法，為活體斑馬魚成像研究提供技術(shù)支持。[方法]通過比較4種不同的斑馬魚體位固定方法及成像觀察效果，觀察不同固定方法的可操作性和成像觀察效果。[結(jié)果]使用6%甲基纖維素固定時(shí)，對(duì)斑馬魚進(jìn)行拍照時(shí)容易產(chǎn)生擺動(dòng);使用0.05%MS-222固定時(shí)，斑馬魚很難保持合適的體位;使用1%的低熔點(diǎn)瓊脂糖，相對(duì)費(fèi)時(shí); 使用6%甲基纖維素/0.05%MS-222固定時(shí)，既可以使斑馬魚保持濕潤的環(huán)境，又可以保持理想的靜止?fàn)顟B(tài)。[結(jié)論]通過比較4種固定方法發(fā)現(xiàn)，使用6%甲基纖維素/0.05%MS-222固定斑馬魚仔魚可操作性最好，該方法可為斑馬魚活體研究提供良好的活體成像觀察保障，有助于獲取高質(zhì)量的活體成像圖片。

關(guān)鍵詞 斑馬魚;活體成像;甲基纖維素;固定方法

中圖分類號(hào) S 917.4? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）23-0124-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.033

A New Fixation Method for in vivo Imaging and Observation of Zebrafish

CHEN Er-fang1， CHANG Hui-min2， AN Xiao-gang1 et al

（1.Otolaryngology，Head and Neck Surgery， Xijing Hospital， PLA Air Force Military Medical University，Xi’an， Shaanxi 710032; 2. Department of Otolaryngology，Head and Neck Surgery，The First Affiliated Hospital of Xi’an Medical University，Xi’an，Shaanxi 710077）

Abstract [Objective] To introduce a new fixation method for in vivo imaging of zebrafish， and provide technical supports for in vivo imaging research of zebrafish.[Method] Though comparing the position fixation methods and imaging observation effects of four different methods， the feasibility and imaging observation effects of different fixation methods were observed.[Result]6% methyl cellulose fixation method was used， it was easy to produce wobble in the process of taking pictures. When zebrafish was fixed with 0.05%MS-222， it was difficult to maintain the proper position.When 1% agarose with a low melting point was used， it was relatively time-consuming. When 6% methyl-cellulose /0.05%MS-222 were used for the fixation， it could not only keep zebrafish in a moist environment， but it could maintain an ideal static state. [Conclusion] By comparing four fixation methods， it was found that fixing zebrafish with 6% methylcellulose /0.05%MS-222 were the most maneuverable.This method could provide a good in vivo imaging observation guarantee for in vivo research of zebrafish， and it was helpful to obtain? in vivo imaging pictures with high-quality.

Key words Zebrafish;In vivo imaging;Methyl cellulose;Fixation method

基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81870732）;學(xué)科助推計(jì)劃-先進(jìn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（XJZT18X23）。

作者簡介 陳二方（1984—），女，安徽宿州人，技師，碩士，從事耳聾的基礎(chǔ)研究。通信作者，教授，博士，從事耳科基礎(chǔ)與臨床研究。

收稿日期 2021-07-28

斑馬魚作為一種熱帶魚，胚胎發(fā)育速度快、養(yǎng)殖成本低、能大規(guī)模繁育[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚基因與人類基因的相似度在70%以上[4]，因此它受到生物學(xué)家的重視，已經(jīng)成為最受重視的脊椎動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)研究的動(dòng)物模型之一[5]。目前全球范圍內(nèi)有超過1 500個(gè)斑馬魚實(shí)驗(yàn)室，我國有300個(gè)以上的實(shí)驗(yàn)室利用斑馬魚開展相關(guān)試驗(yàn)[6]。

斑馬魚體表含有神經(jīng)丘毛細(xì)胞，同時(shí)內(nèi)耳也存在毛細(xì)胞，常被用于內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷與保護(hù)的試驗(yàn)研究中。但是，在斑馬魚動(dòng)物模型造模過程中，對(duì)斑馬魚毛細(xì)胞進(jìn)行特異性染料標(biāo)記后發(fā)現(xiàn)，如何固定斑馬魚使其在激光共聚焦顯微鏡、體式顯微鏡下成像觀察及拍照、獲取高質(zhì)量的圖片尤為重要。筆者通過比較4種活體斑馬魚成像觀察的固定方法，嘗試找出一種最佳適用于活體斑馬魚成像觀察的固定方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

AB品系野生型斑馬魚在中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科全軍航空航天醫(yī)學(xué)內(nèi)耳研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)育，并進(jìn)行繁育傳代;斑馬魚在28.5 ℃恒溫環(huán)境中生長，光照∶黑暗時(shí)間為14∶10，胚胎用胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)，養(yǎng)殖方法參照《Zebrafish Book》（http：//www.zfin.org）常規(guī)方法進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料與設(shè)備

試驗(yàn)材料：甲基纖維素（M6385，Sigma）;苯基硫脲（P7629，Sigma）;低熔點(diǎn)瓊脂糖（A9414，Sigma）;乙基3-氨基苯甲酸酯甲烷磺酸鹽（MS-222，A5040）;氫氧化鈉購自天津市天力化學(xué)試劑有限公司;突觸素TMC4（FM1-43，Sigma，S6814）。主要設(shè)備：激光共聚焦顯微鏡（FV-1000，奧林巴斯，日本）;體式顯微鏡（M205 FA，萊卡，德國）;精密電子天平（Sartorius，德國）;GZX型光照培養(yǎng)箱（北京中興偉業(yè)）;愛生斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)。

1.3 胚胎養(yǎng)殖

在交配前一晚，在交配盒中按照雌雄比1∶1或1∶2配魚（圖1）。交配當(dāng)日，抽掉交配盒中間的隔離擋板，讓雌、雄魚互相追逐，產(chǎn)下胚胎，并收集胚胎。收集過程中去除死卵及糞便等，將胚胎置于胚胎培養(yǎng)液中，放置在28.5 ℃的光照培養(yǎng)箱中，待發(fā)育至24 hpf（hours post fertilization）時(shí)，換成0.003%的苯基硫脲（PTU）溶液，其作用是抑制黑色素形成，排除其對(duì)活體成像的干擾。

1.4 6%甲基纖維素/0.05% MS-222的配制

將MS-222配制成5%的儲(chǔ)存液，使用時(shí)濃度稀釋至0.05%。將140 mL 0.05% MS-222置于磁力攪拌器上加熱至沸騰，將12 g甲基纖維素緩慢加入，一邊加入一邊用玻璃棒攪拌，以促使其溶解，繼續(xù)攪拌3 min左右，直至甲基纖維素充分溶解分散，加入3～5滴5 moL/L的NaOH溶液，促使其溶解，在此期間繼續(xù)攪拌，此時(shí)溶液逐漸呈乳白色;將溶液和預(yù)先放置在冰箱冷藏室中的60 mL 0.05% MS-222充分混合、預(yù)冷，溶液顏色從乳白色變成半透明色，繼續(xù)將溶液放置在制冰機(jī)或者冷凍中，處理2 h左右，溶液變成透明的淡黃色。

1.5 FM1-43染色

首先將FM1-43配制成10 mg/mL的儲(chǔ)存液，避光冷凍儲(chǔ)存，使用時(shí)稀釋成濃度3 μmoL/L。將發(fā)育至5 dpf（days post fertilization）的斑馬魚仔魚，置于6孔板上，吸除斑馬魚養(yǎng)殖用水，加入5 mL 3 μmoL/L的FM1-43，避光染色10 min;最后，吸除染液，用斑馬魚養(yǎng)殖用水洗滌3次，每次10 min，采用不同的固定方法將仔魚固定在共聚焦培養(yǎng)皿或者凹玻片上，顯微鏡下成像觀察及拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種固定活體斑馬魚方法的比較

用一次性的巴氏吸

管將發(fā)育至5 dpf的斑馬魚仔魚從養(yǎng)殖盒中緩緩吸出，置于凹

玻片或共聚皿上，用濾紙條將多余的水分吸除。使用以下4種固定方法分別固定斑馬魚仔魚，見表1。①使用巴氏吸管將預(yù)先配制好的6%甲基纖維素滴在仔魚上，用牙探針或鑷子將斑馬魚調(diào)整至合適的成像體位。甲基纖維素具有一定的黏性，可使魚體擺放成特定的成像體位，但支撐力度欠缺，在拍照過程中會(huì)有輕微擺動(dòng)，影響拍照效果。②使用移液器將0.05%MS-222吸出，滴加在仔魚上，用上述同樣方法調(diào)整體位，仔魚在麻醉劑的作用下保持靜止，但是由于缺乏支撐，很難將仔魚擺放成適合拍照的體位，且在拍照過程中，由于載物臺(tái)的移動(dòng)，體位容易改變。③將配制的1%低熔點(diǎn)瓊脂糖冷卻至30 ℃以下后，用巴氏吸管吸出，滴在斑馬魚上，用工具調(diào)整好體位，等待瓊脂糖凝固。該方法的優(yōu)點(diǎn)是可以給仔魚提供適宜的濕度及支撐，缺點(diǎn)是此瓊脂糖在65 ℃左右會(huì)溶解，在26～30 ℃下會(huì)凝結(jié)，溫度不好控制。溫度過高時(shí)容易造成仔魚死亡，溫度過低時(shí)瓊脂糖凝結(jié)較快，不方便固定。④使用巴氏吸管將6%甲基纖維素/0.05%MS-222滴加在斑馬魚仔魚上，按照同樣方法調(diào)整體位。此方法不僅可快速固定斑馬魚仔魚，而且甲基纖維素提供的濕度可使仔魚存活相當(dāng)長的時(shí)間。另外，MS-222可使仔魚麻醉，并保持靜止?fàn)顟B(tài)，方便成像觀察及拍照記錄。通過比較上述4種固定方法發(fā)現(xiàn)，使用6%甲基纖維素/0.05%MS-22固定斑馬魚仔魚的方法更具優(yōu)勢(shì)，可操作性更強(qiáng)，更適用于活體斑馬魚成像觀察。

2.2 甲基纖維素/MS-222聯(lián)合固定仔魚結(jié)果

將斑馬魚仔魚包埋在含0.05%MS-222的6%甲基纖維素中，仔魚可在較長時(shí)間內(nèi)保持相同的姿勢(shì)，同時(shí)甲基纖維素也不會(huì)影響成像觀察及拍照視野。無論使用激光共聚焦拍照（圖2），還是使用體式顯微鏡拍照（圖3），均能取得較滿意的拍攝效果。

3 討論

近年來斑馬魚動(dòng)物模型常被用于發(fā)育、毒理等方面的研究中[7-10]。由于斑馬魚具有與哺乳動(dòng)物類似功能的內(nèi)耳結(jié)構(gòu)，且其體表側(cè)線上分布著感受聲音、震動(dòng)及水流等的神經(jīng)丘毛細(xì)胞，所以斑馬魚越來越受到耳科領(lǐng)域研究者的青睞。另外，斑馬魚毛細(xì)胞是可以再生的，且具有胚胎產(chǎn)量多、發(fā)育快等優(yōu)點(diǎn)，因此被越來越廣泛應(yīng)用于內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷及保護(hù)性藥物篩選中。Vlasits等[11]利用斑馬魚動(dòng)物模型，從FDA批準(zhǔn)的藥物庫中篩選出可以保護(hù)毛細(xì)胞免受順鉑和氨基糖苷類藥物損傷的化合物。Namdaran等[12]用新霉素?fù)p傷斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘，建立毛細(xì)胞損傷與再生模型，從1 680種化合物中篩選出地塞米松、強(qiáng)的松龍2種可以促進(jìn)再生的化合物和氟苯達(dá)唑、拓?fù)涮婵档?種抑制再生的化合物。

然而，在斑馬魚動(dòng)物模型造模成功后，如何對(duì)斑馬魚進(jìn)行良好的體位固定，以便觀察成像及獲取理想的圖片成為研究學(xué)者亟待解決的問題。傳統(tǒng)固定活體斑馬魚的方法主要包括：①先用麻藥將魚麻醉，再用甲基纖維素固定[13];②單純使用魚麻醉劑（MS-222）麻醉[14];③使用低熔點(diǎn)瓊脂糖固定[15]。有些試驗(yàn)研究并未提及使用的具體固定方法。該研究采用4種不同的固定方法，比較其在斑馬魚活

體成像研究中的固定效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用6%甲基纖維素/

0.05%MS-222固定方法較其他3種固定方法更為有效，使

用固定液無須現(xiàn)配現(xiàn)

用，固定仔魚所需時(shí)間短，操作過程中魚體位不易變化，且仔

魚不容易震動(dòng)。這種固定方法可操作性更強(qiáng)，更適用于活體斑馬魚成像觀察，為活體斑馬魚成像觀察研究建立了一種新方法。

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