診斷用D-乳酸脫氫酶研究進(jìn)展

羅維曉 徐振上 劉新利

摘要 D-乳酸脫氫酶是乳酸脫氫酶根據(jù)結(jié)構(gòu)進(jìn)行區(qū)分的重要的一類工具酶。從不同微生物中提取的D-乳酸脫氫酶的來源、基因工程以及固定化等方面綜述了D-乳酸脫氫酶的研究進(jìn)展，以期為獲取優(yōu)質(zhì)的診斷用D-乳酸脫氫酶提供理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 D-乳酸脫氫酶;來源;基因工程;酶固定化

中圖分類號 Q 936? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）23-0011-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.003

Research Progress of D-lactate Dehydrogenase for Diagnosis

LUO Wei-xiao，XU Zhen-shang，LIU Xin-li

（School of Bioengineering，Qilu University of Technology / State Key Laboratory of Bio-based Materials and Green Paper Making，Jinan，Shandong 250353）

Abstract D-lactate dehydrogenases （D-LDHs） are an important class of enzymes that differentiate lactate dehydrogenases according to their structure. In this paper， the source， genetic engineering and immobilization of D-lactate dehydrogenase extracted from different microorganisms were summarized in the research progress of D-lactate dehydrogenase， in order to provide theoretical guidance for obtaining high-quality diagnostic D-lactate dehydrogenase.

Key words D-lactate dehydrogenase;Source;Genetic engineering;Enzyme immobilization

作者簡介 羅維曉（1990—），男，山東濟(jì)南人，工程師，碩士，從事診斷酶研究。通信作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事微生物活性代謝產(chǎn)物研究。

收稿日期 2021-03-18

D-乳酸脫氫酶以氧化型輔酶Ⅰ（NAD+）/還原型輔酶Ⅰ（NADH）作為輔酶，可以可逆催化氧化乳酸生成丙酮酸，根據(jù)這一反應(yīng)原理D-乳酸脫氫酶在分析其他酶和生物制品中廣泛應(yīng)用，在臨床診斷中D-乳酸脫氫酶作為天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶[1]、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶[2]、同型半胱氨酸[3]、鉀離子酶法[4]等診斷項目中的關(guān)鍵工具酶，用于人體各項疾病的輔助診斷。

決定試劑性能的關(guān)鍵是工具酶的質(zhì)量，而工具酶的生產(chǎn)工藝又是決定其質(zhì)量和產(chǎn)率的關(guān)鍵因素，由于診斷酶試劑自身的復(fù)雜性，作為診斷工具酶應(yīng)該具備對底物專一性高、酶自身熱穩(wěn)定性好、酸堿耐受范圍寬、比活性高、有害雜酶含量低等要求[5]，為了能夠提高工具酶的質(zhì)量，首先需要選育高產(chǎn)菌株，探索最優(yōu)化的發(fā)酵工藝和后提取純化技術(shù)，以提高酶的產(chǎn)率，保證原酶質(zhì)量。目前隨著基因工程菌技術(shù)的不斷成熟，通過基因改造，能夠大大提高目的酶的產(chǎn)量以及改善酶的性質(zhì)。另外為了進(jìn)一步提高酶的性能以及拓展工具酶在一些特定領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用，通過酶固定化技術(shù)來達(dá)到特定的效果，也是工具酶后期研究的不可或缺的一部分[6]。對于乳酸脫氫酶的研究，國內(nèi)外多數(shù)以如何提高其下游產(chǎn)物乳酸或苯乳酸的報道較多，黃艷娜等[7-8]針對該問題進(jìn)行了詳細(xì)的報道，對于單純診斷用乳酸脫氫酶的國內(nèi)研究相對較少[9]，尤其是針對D-乳酸脫氫酶的研究則更少[10]，筆者將從D-乳酸脫氫酶的來源、基因工程以及固定化修飾方面綜述了D-乳酸脫氫酶的研究進(jìn)展。

1 D-乳酸脫氫酶的來源

乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenases，LDHs）按照催化生成乳酸構(gòu)型不同，可將乳酸脫氫酶分為 D-乳酸脫氫酶（D-LDH）和 L-乳酸脫氫酶（L-LDH），分別催化丙酮酸生成有光學(xué)純度的D-乳酸和 L-乳酸[11-12]。乳酸脫氫酶廣泛存在于微生物和動物各種組織之中，不同來源的乳酸脫氫酶性質(zhì)差異較大[13-16]，從動物的心肌、肝、腎、骨骼肌或肺等組織器官中獲取的乳酸脫氫酶主要是L-乳酸脫氫酶，只有少許無脊椎動物具有D-乳酸脫氫酶[17];從微生物體內(nèi)獲取的乳酸脫氫酶既包含L型的乳酸脫氫酶又包含D型的乳酸脫氫酶，能夠獲取乳酸脫氫酶的微生物主要有芽孢桿菌、嗜熱菌和乳酸菌等[18-21]。

國外不同菌種中提取D-乳酸脫氫酶的研究相對較早，1972年P(guān)urohit等[17]從異水霉菌雄性雜交菌株中分離得到了D（-）-乳酸脫氫酶，系統(tǒng)介紹D-LDH 進(jìn)行分離純化的方法步驟，并對其性質(zhì)和變構(gòu)特性進(jìn)行了深入研究，并經(jīng)過6個步驟提純后得到的酶活性比456.99 U/mg。Busto等[22]對大腸桿菌中D（-）-乳酸脫氫酶的動力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)原位研究的D（-）-乳酸脫氫酶與體外研究的D（-）-乳酸脫氫酶的動力學(xué)特性有顯著差異，為大腸桿菌產(chǎn)D（-）-乳酸脫氫酶在不同條件的應(yīng)用提供了依據(jù)。Ma等[23]從土壤中分離出stutzeri假單胞菌，并對其產(chǎn)生的L-乳酸脫氫酶和D-乳酸脫氫酶活性進(jìn)行了研究，檢測到2種立體特異性NAD-independent乳酸脫氫酶（iLDH）的活性，表明stutzeri SDM中存在2種獨(dú)立的酶，為從假單胞菌中獲取D-乳酸脫氫酶提供了可能性。Satomura等[24]從7株tokodaii磺隆菌中發(fā)現(xiàn)了嗜熱嗜酸酶S.tokodaii染料連接的D -乳酸脫氫酶，這是一種新型的FAD型D-乳酸脫氫酶，經(jīng)過測量酶的分子質(zhì)量約為93 kD，是由相同亞基組成的同源二聚體，分子質(zhì)量約為48 kD，并確定了其基因序列。同年Mourier等[25] 研究了羧酸對酵母線粒體D -乳酸脫氫酶的動力學(xué)激活，證明了以D-乳酸為底物的磷酸化或非磷酸化條件下，羧酸可以刺激線粒體呼吸速率，并對這種調(diào)節(jié)的生理學(xué)意義進(jìn)行了討論。前期對于D-乳酸脫氫酶的研究則主要以提高酶的產(chǎn)量以及提純工藝的研究[26]，隨著市場對于診斷用D-乳酸脫氫酶的需求的增加，Kim等[26]對簡氏乳桿菌D-乳酸脫氫酶的晶體結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，獲取了一種耐高溫的D-乳酸脫氫酶，熱穩(wěn)定性高達(dá)54.5 ℃，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于當(dāng)時市售的D-乳酸脫氫酶（42.7 ℃），也正是由于穩(wěn)定性的提高，更有利于D-LDH在體外診斷試劑中的應(yīng)用。

2 酶的工程菌改造

在正常的生物細(xì)胞中，由于其內(nèi)在活動機(jī)制原因，生物體內(nèi)酶活性以及酶產(chǎn)量十分有限?；蚬こ痰膽?yīng)用可以對已知酶的性質(zhì)進(jìn)行分析，改變酶的性能，擴(kuò)大酶的適用范圍以及增強(qiáng)酶的活性，以達(dá)到提高酶產(chǎn)量的目的。自從Bernard等[27]首次報道了克隆L.bulgaricus基因組中D-乳酸脫氫酶基因（ldhD）的完整序列以來，D-乳酸脫氫酶的基因改造研究眾多，而針對D-乳酸脫氫酶基因工程的菌株研究目前主要集中在乳酸桿菌、大腸桿菌等工程菌，李劍等[28]通過構(gòu)建基因文庫從Lactobacillus sp.MD21菌株中篩選到一個新的編碼D-LDH的基因ldhD，并對其編碼的蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析，通過乳酸桿菌L-乳酸脫氫酶基因（ldhL）缺失方法，獲取高純度的D-LDH。但大多數(shù)將其他菌種的D-乳酸脫氫酶的基因在大腸桿菌中表達(dá)，在20世紀(jì)90年代初有學(xué)者將編碼Lactobacillysplanta-rum[29]、Lactobacillusbulgaricus[27]和Lactobacillushelveticus[30]的D-LDH的基因ldhD導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行了克隆表達(dá); Arai等[31]對戊糖乳桿菌JCM1558（ATCC 8041）乳酸脫氫酶進(jìn)行定點突變，用天冬氨酸替換第 101 位的脯氨酸（P101N），P101N 表現(xiàn)出廣泛的底物特異性，對苯丙酮酸催化活性相對較高，經(jīng)過提取得到的酶活比達(dá)到480 U/mg;Yang等[32]構(gòu)建了D-LDH 重組大腸桿菌菌株，使 D-LDH 酶活提高了10倍以上，并分析了相關(guān)途徑中碳原子的代謝流向。黃艷燕等[33]利用PCR的方法從鼠李糖乳桿菌基因組DNA中擴(kuò)增到D-（+）-乳酸脫氫酶基因ldhD，并連接到載體pSE380上，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pSE-ldhD，將重組質(zhì)粒pSE-ldhD轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析表明ldhD在大腸桿菌中實現(xiàn)了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物的分子量約為37 kD，測得重組菌株的D-乳酸脫氫酶活力為5.4 U/mL。Mu等[34]克隆了嗜酸小球菌DSM 20284的D-乳酸脫氫酶基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，重組酶經(jīng)鎳親和層析純化，在30 ℃和pH 5.5的條件下，苯丙酮酸（PPA）轉(zhuǎn)化為3-苯乳酸的效率最高，PPA和丙酮酸的活性比分別為140和422 U/mg。宋嘉寧等[35]以肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）基因組DNA為模板，克隆出 D-乳酸脫氫酶基因ldhD，將其連接到表達(dá)載體 pET-22b（+）質(zhì)粒上，構(gòu)建 pET-22b（+）-ldhD 重組質(zhì)粒，檢測結(jié)果100%正確;將重組質(zhì)粒 pET-22b（+）-ldhD 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株 BL21（DE3）中，通過氨芐霉素抗性平板篩選，構(gòu)建大腸桿菌 BL21（DE3）-pET-22b（+）-ldhD基因工程菌。Jun等[20]篩選了3株不同的延森氏乳桿菌D-LDH，通過基因組挖掘，在大腸桿菌中表達(dá)，其中D-LDHs（D-LDH3）顯示最佳反應(yīng)溫度（50 ℃），擁有非常強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。蔡昱萌等[36]通過克隆詹氏乳桿菌的 D-乳酸脫氫酶，將其進(jìn)行體外表達(dá)，最適溫度為45 ℃，具有更好的耐熱性和更高的催化活力。Huang等[37]通過基因工程將D-LDHs基因（ldb0101、ldb0813、ldb1010、ldb1147和ldb2021）被克隆并過表達(dá)來自pUC18誘導(dǎo)載體的大腸桿菌JM109，并對得到的菌株進(jìn)行數(shù)值比較，提高了乳酸脫氫酶的含量和產(chǎn)乳酸的能力。Nakano等[38]為了提高S.laevolacticus D-LDH的活性，采用定點誘變的方法取代靠近底物結(jié)合位點或活性中心的部分氨基酸殘基，研究發(fā)現(xiàn)S.laevolacticus D-LDH的Ala234是一個重要的氨基酸殘基，對催化活性有積極的影響，雙突變體D-LDH T75L/A234S比野生型D-LDH提高了6.8倍。基因工程改造后的D-乳酸脫氫酶基因多數(shù)在大腸桿菌中進(jìn)行克隆表達(dá)，大腸桿菌作為基因工程受體菌具有易于培養(yǎng)、遺傳背景清楚、目標(biāo)基因表達(dá)水平高、表達(dá)系統(tǒng)成熟完善等優(yōu)勢，但是ldhD序列過量表達(dá) D-LDH 會抑制重組大腸桿菌生長[39] 。

3 乳酸脫氫酶的固定化

酶固定化方法是指將游離酶固定在載體上，使其不能自由移動的方法。游離的乳酸脫氫酶在實際應(yīng)用中存在著耐酸堿性弱、耐熱性不強(qiáng)、性質(zhì)較不穩(wěn)定等局限性，固定化酶能有效提高酶催化過程的性能，有效克服這些局限性。固定化酶的特性由固定化載體和固定化方法決定[40]，常見的固定方法包括吸附法[6]、包埋法[41]、共價結(jié)合法[42]、交聯(lián)法[43]等。余沖等[44]對酶不同的固定化載體的選擇和不同固定化方法進(jìn)行了報道，并就各種方法的優(yōu)缺點進(jìn)行了詳細(xì)比較，還重點介紹了酶定向固定化、多酶共固技術(shù)等新型酶固定化方法[45-47]。陳海欣等[48]則對傳統(tǒng)的固定方法和固定載體選擇進(jìn)行對比分析的同時，提出了金屬-有機(jī)框架材料（MOFs）和共價有機(jī)框架材料（COFs）作為新型載體應(yīng)用到酶的固定化中。

目前對于乳酸脫氫酶的固定方法有傳統(tǒng)方法也有創(chuàng)新方法。傳統(tǒng)方法中包埋法具有方法簡便操作、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，早在1988年李慧賢等[49]用 CNBr 活化的 Sepharose 4B 進(jìn)行了包埋固定化，通過該方法使得用于診斷的乳酸脫氫酶自身穩(wěn)定性和保存液穩(wěn)定性方面有很大的提高，但酶活力回收相對較低。吸附法具有反應(yīng)條件溫和、載體廉價易得等優(yōu)勢，丁良等[50]利用 X射線微區(qū)分法，對采用吸附法合成出的以大孔吸附樹脂為載體的固定化乳酸脫氫酶進(jìn)行分析，確定該方法的可行性，該方法從定量的角度來研究載體的表面及內(nèi)部結(jié)構(gòu)與酶活性的關(guān)系，并確定酶活性最高的結(jié)構(gòu);姚莉麗[51]以啤酒酵母菌為乳酸脫氫酶（LDH）制備的菌種來源，建立了以納米級磁性殼聚糖微球（magnetic chitosan microspheres，M-CS）為載體固定化乳酸脫氫酶的方法同樣取得了較好的效果，證明了物理法用于乳酸脫氫酶固定的可行性。

交聯(lián)法得到的固定化酶具有不易脫落的優(yōu)勢，覃建軍等[52]以磁性殼聚糖作為載體，戊二醛作為交聯(lián)劑，對乳酸脫氫酶（LDH）進(jìn)行固定化，得出最適條件為戊二醛濃度6%、 pH 7.5、酶的偶聯(lián)時間2 h;并對固定化酶進(jìn)行性能驗證，在室溫下與底物重復(fù)反應(yīng)6次后，活力仍保留60%以上，說明固定化酶具有較好的熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性和復(fù)用性。

隨著D-乳酸脫氫酶新的固定方法和載體新技術(shù)的不斷出現(xiàn)，在乳酸脫氫酶固定化方面同樣進(jìn)行了新的探索，徐俊等[53]使用異硫氰酸醋作為載體同時將醇脫氫酶、乳酸脫氫酶和輔酶 I進(jìn)行固定，實現(xiàn)了多重酶的共固定化，得到的固定化三元全酶系統(tǒng)的輔酶再生能力為相應(yīng)游離酶系統(tǒng)的4倍。庹潯等[54]以十六烷基三甲基溴化銨（CATB）-辛烷-己醇反膠束體系對乳酸脫氫酶（LDH）進(jìn)行固定化，采用反膠束法對乳酸脫氫酶進(jìn)行固定，使得固定化LDH具有較好的熱穩(wěn)定;柳暢先等[55]對反膠束體系中的催化動力學(xué)研究，進(jìn)一步確認(rèn)了該方法可以有效地提高LDH的熱穩(wěn)定性。Zaboli等[56]提出在原始碳納米管和羧基功能化碳納米管上固定D-乳酸脫氫酶診斷酶的試驗，并對分子動力學(xué)進(jìn)行了模擬研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過該方法固定的D-乳酸脫氫酶熱穩(wěn)定性有較大提升，該方法可以用于工業(yè)化。關(guān)于新型載體，Ma等[57]又提出了使用雙壁碳納米管摻雜海藻酸凝膠生物復(fù)合材料的方法固定化乳酸脫氫酶，該方法旨在降低泄漏量、提高酶的活性，使用該方法固定化形成的復(fù)合材料的LDH泄漏量顯著降低了61.7%。

4 展望

隨著體外診斷行業(yè)的高速發(fā)展，診斷用酶的需求量越來越大，目前國內(nèi)大多數(shù)的診斷用酶均依賴進(jìn)口，乳酸脫氫酶作為一種非常重要的診斷工具酶，在體外診斷領(lǐng)域中應(yīng)用非常廣泛，該領(lǐng)域內(nèi)L-乳酸脫氫酶和D-乳酸脫氫酶均有應(yīng)用，其中以D-乳酸脫氫酶應(yīng)用居多，由于通過微生物發(fā)酵的方法獲取的D-LDH的酶類純度更高，更加易于操作，因此商業(yè)化產(chǎn)品中多數(shù)采用該方法進(jìn)行提取;而L-乳酸脫氫酶多從哺乳動物組織器官中提取，提取要求和工藝更加復(fù)雜。此外通過微生物獲取的D-LDH僅需要2～8 ℃甚至常溫即可實現(xiàn)長期穩(wěn)定儲存，而從動、植物體內(nèi)提取的L-乳酸脫氫酶則需要在-20 ℃或者更低的溫度進(jìn)行儲存，這實際對酶類的應(yīng)用范圍起到了很大限制。

診斷用酶在使用過程中往往與其他物料混合在一起進(jìn)行使用或儲存，多數(shù)情況下，其他物料的添加會顯著降低酶類的穩(wěn)定性，因此這要求診斷酶需要有更高的穩(wěn)定性[58]。

因此為獲取優(yōu)質(zhì)的診斷用酶，國外的商品化診斷酶基本上都通過工程菌株來獲取。進(jìn)口的D-乳酸脫氫酶中無論從酶的純度還是酶的穩(wěn)定性方面均有明顯的優(yōu)勢，還有部分日美企業(yè)為了提高酶的性能采用固定修飾的方法對獲取的酶進(jìn)行固定化，尤其是一些新的酶修飾和固定化技術(shù)的應(yīng)用，對于酶后期性能的提升起到不可忽視的作用，目前國內(nèi)診斷用酶依然對進(jìn)口依賴較大，關(guān)鍵原材料卡脖子情況時有發(fā)生，因此國內(nèi)對于診斷用酶的研究和進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化依然有巨大的發(fā)展空間。

參考文獻(xiàn)

[1] 宋耀虹，李學(xué)仁.天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶連續(xù)監(jiān)測法最適條件的探討[J].化學(xué)試劑，1991，13（2）：111-114.

[2] SCHUMANN G，BONORA R，CERIOTTI F，et al.IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 ℃.Part 4：Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of alanine aminotransferase[J].Clinical chemistry and laboratory medicine，2002，40（7）：718-724.

[3] 王篤強(qiáng)，沈云龍，廖遠(yuǎn)平，等.循環(huán)酶法同型半胱氨酸檢測關(guān)鍵酶CBS和CBL的開發(fā)及試劑盒研制初探[J].中國生物工程雜志，2017，37（2）：81-87.

[4] BERRY M N，MAZZACHI R D，PEJAKOVIC M，et al.Enzymatic determination of sodium in serum[J].Clinical chemistry，1988，34（11）：2295-2298.

[5] 羅侃，崔有宏.診斷用酶的研究進(jìn)展[J].西北國防醫(yī)學(xué)雜志，2000，21（1）：57-59.

[6] 賈峰，鄭連炳，王志強(qiáng).生物酶固定化技術(shù)研究現(xiàn)狀[J].資源節(jié)約與環(huán)保，2020（4）：116.

[7] 黃艷娜，許光濤，游春蘋.乳酸菌中乳酸脫氫酶的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2016，37（8）：369-373.

[8] 富敏霞，祝鈴鈺，贠軍賢.乳酸脫氫酶的分離純化及其催化合成苯乳酸的研究進(jìn)展[J].化工進(jìn)展，2018，37（12）：4814-4820.

[9] RICHTER N，ZIENERT A，HUMMEL W.A single-point mutation enables lactate dehydrogenase from Bacillus subtilis to utilize NAD+ and NADP+ as cofactor[J].Engineering in life sciences，2011，11（1）：26-36.

[10] 石軒峰，楊海麟，王武.高純度診斷用乳酸脫氫酶的制備和酶促反應(yīng)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2005，24（6）：38-42.

[11] SIMON E S，PLANTE R，WHITESIDES G M.D-lactate dehydrogenase.Substrate specificity and use as a catalyst in the synthesis of homochiral 2-hydroxy acids[J].Applied biochemistry and biotechnology，1989，22（2）：169-179.

[12] CRISTESCU M E，EGBOSIMBA E E.Evolutionary history of d-lactate dehydrogenases：A phylogenomic perspective on functional diversity in the FAD binding oxidoreductase/transferase type 4 family[J].Journal of molecular evolution，2009，69（3）：276-287.

[13] AL-JASSABI S.Purification and kinetic properties of skeletal muscle lactate dehydrogenase from the lizard Agama stellio stellio[J].Biochemistry，2002，67（7）：786-789.

[14] YANG G，JING C X，ZHU P X，et al.Molecular cloning and characterization of a novel lactate dehydrogenase gene from Clonorchis sinensis[J].Parasitology research，2006，99（1）：55-64.

[15] LI L，SHIN S Y，LEE K W，et al.Production of natural antimicrobial compound D-phenyllactic acid using Leuconostoc mesenteroides ATCC 8293 whole cells involving highly active D-lactate dehydrogenase[J].Letters in applied microbiology，2014，59（4）：404-411.

[16] LI S N，LI S L，LIU C Y，et al.Extraction and isolation of potential anti-stroke compounds from flowers of Pueraria lobata guided by in vitro PC12 cell model[J].Journal of chromatography B，2017，1048：111-120.

[17] PUROHIT K，TURIAN G.D（-）-lactate dehydrogenase from Allomyces. Partial purification and allosteric properties[J].Archiv für mikrobiologie，1972，84（4）：287-300.

[18] ZHENG Z J，MA C Q，GAO C，et al.Efficient conversion of phenylpyruvic acid to phenyllactic acid by using whole cells of Bacillus coagulans SDM[J].PLoS One，2011，6（4）：1-7.

[19]? ZHU Y B，HU F G，ZHU Y Y，et al.Enhancement of phenyllactic acid biosynthesis by recognition site replacement of D-lactate dehydrogenase from Lactobacillus pentosus[J].Biotechnology letters，2015，37（6）：1233-1241.

[20] JUN C H，SA Y S，GU S A，et al.Discovery and characterization of a thermostable D-lactate dehydrogenase from Lactobacillus jensenii through genome mining[J].Process biochemistry，2013，48（1）：109-117.

[21] FURUKAWA N，MIYANAGA A，TOGAWA M，et al.Diverse allosteric and catalytic functions of tetrameric D-lactate dehydrogenases from three Gram-negative bacteria[J].AMB Express，2014，4（1）：1-12.

[22] BUSTO F，SOLER J，DE ARRIAGA D，et al.In situ behaviour of D（-）-lactate dehydrogenase from Escherichia coli[J].Archives of microbiology，1984，139（2/3）：255-259.

[23] MA C Q，GAO C，QIU J H，et al.Membrane-bound L-and D-lactate dehydrogenase activities of a newly isolated Pseudomonas stutzeri strain[J].Applied microbiology and biotechnology，2007，77（1）：91-98.

[24] SATOMURA T，KAWAKAMI R，SAKURABA H，et al.A novel flavin adenine dinucleotide（FAD）containing D-lactate dehydrogenase from the thermoacidophilic crenarchaeota Sulfolobus tokodaii strain 7：Purification，characterization and expression in Escherichia coli[J].Journal of bioscience and bioengineering，2008，106（1）：16-21.

[25] MOURIER A，VALLORTIGARA J，YOBOUE E D，et al.Kinetic activation of yeast mitochondrial D-lactate dehydrogenase by carboxylic acids[J].Biochimica et biophysica acta，2008，1777（10）：1283-1288.

[26] KIM S，GU S A，KIM Y H，et al.Crystal structure and thermodynamic properties of d-lactate dehydrogenase from Lactobacillus jensenii[J].International journal of biological macromolecules，2014，68：151-157.

[27] BERNARD N，F(xiàn)ERAIN T，GARMYN D，et al.Cloning of the D-lactate dehydrogenase gene from Lactobacillus delbrueckii subsp.buglaricus by complementation in Escherichia coli[J].FEBS Letters，1991，290（1/2）：61-64.

[28] 李劍，唐赟，梁鳳來，等.D-乳酸脫氫酶基因克隆及其表達(dá)[J].微生物學(xué)報，2004，44（4）：491-495.

[29] TAGUCHI H，OHTA T.D-lactate dehydrogenase is a member of the D-isomer-specific 2-hydroxyacid dehydrogenase family.Cloning，sequencing，and expression in Escherichia coli of the D-lactate dehydrogenase gene of Lactobacillus plantarum[J].Journal of biological chemistry，1991，266（19）：12588-12594.

[30] KOCHHAR S，HOTTINGER H，CHUARD N，et al.Cloning and overexpression of Lactobacillus helveticus D-lactate dehydrogenase gene in Escherichia coli[J].European journal of biochemistry，1992，208（3）：799-805.

[31] ARAI K，KAMATA T，UCHIKOBA H，et al.Some Lactobacillus L-lactate dehydrogenases exhibit comparable catalytic activities for pyruvate and oxaloacetate[J].Journal of bacteriology，2001，183（1）：397-400.

[32] YANG Y T，SAN K Y，BENNETT G N.Redistribution of metabolic fluxes in Escherichia coli with fermentative lactate dehydrogenase overexpression and deletion[J].Metabolic engineering，1999，1（2）：141-152.

[33] 黃艷燕，黃靖華，盧福芝，等.鼠李糖乳桿菌D-（+）-乳酸脫氫酶基因的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)[J].生物技術(shù)通報，2010（12）：196-200.

[34] MU W M，YU S H，JIANG B，et al.Characterization of D-lactate dehydrogenase from Pediococcus acidilactici that converts phenylpyruvic acid into phenyllactic acid[J].Biotechnology letters，2012，34（5）：907-911.

[35] 宋嘉寧，黃志兵，劉珞，等.肺炎克雷伯氏菌D-乳酸脫氫酶基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)[J].北京化工大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，39（2）：79-83.

[36] 蔡昱萌，朱凌峰，王麗敏，等.來自詹氏乳桿菌的耐熱 D-乳酸脫氫酶的酶學(xué)性質(zhì)研究[J].微生物學(xué)通報，2015，42（3）：460-466.

[37] HUANG? Y N，YOU C P，LIU Z M，et al.Cloning of D-lactate dehydrogenase genes of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus and their roles in D-lactic acid production[J].3 Biotech，2017，7（3）：1-7.

[38]? NAKANO K，SAWADA S，YAMADA R，et al.Enhancement of the catalytic activity of d-lactate dehydrogenase from Sporolactobacillus laevolacticus by site-directed mutagenesis[J].Biochemical engineering journal，2018，133：214-218.

[39]? BUNCH P K，MAT-JAN F，LEE N，et al.The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli[J].Microbiology，1997，143（1）：187-195.

[40] 柯彩霞，范艷利，蘇楓，等.酶的固定化技術(shù)最新研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報，2018，34（2）：188-203.

[41] YUAN C S，LIU S M，WNUK S F，et al.Design and synthesis of S-adenosylhomocysteine hydrolase inhibitors as broad-spectrum antiviral agents[J].Advances in antiviral drug design，1996，2（2）：41-88.

[42] NELSON J M，GRIFFIN E G.Adsorption of invertase[J].Journal of the American chemical society，1916，38（5）：1109-1115.

[43] WANG X，MAKAL T A，ZHOU H C.Protein immobilization in metal-organic frameworks by covalent binding[J].Australian journal of chemistry，2014，67（11）：1629-1631.

[44] 余沖，孫秀麗，王東旭，等.酶固定化載體及固定方法最新研究進(jìn)展[J].廣東化工，2021，48（2）：60-62，78.

[45]? SCHOEVAART R，WOLBERS M W，GOLUBOVIC M，et al.Preparation，optimization，and structures of cross-linked enzyme aggregates（CLEAs）[J].Biotechnology bioengineering，2004，87（6）：754-762.

[46] CZYRKO J，SLIWIAK J，IMIOLCZYK B，et al.Metal-cation regulation of enzyme dynamics is a key factor influencing the activity of S-adenosyl-L -homocysteine hydrolase from Pseudomonas aeruginosa[J].Scientific reports，2018，8（1）：4476-4480.

[47] YUAN C S，SASO Y，LAZARIDES E，et al.Recent advances in S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase inhibitors and their potential clinical applications[J].Expert opinion on therapeutic patents，1999，9（9）：1197-1206.

[48] 陳海欣，張賽男，趙力民，等.固定化酶：從策略到材料設(shè)計[J].生物加工過程，2020，18（1）：88-95.

[49] 李慧賢，汪靜英.固定化乳酸脫氫酶的研究[J].生物工程學(xué)報，1988，4（1）：70-72.

[50] 丁良，姚子華，李彤.固定化乳酸脫氫酶活性的 X 射線微區(qū)分析[J].分析測試學(xué)報，2003，22（2）：56-59.

[51] 姚莉麗.乳酸脫氫酶的制備及其固定化研究[D].長沙：中南大學(xué)，2008.

[52] 覃建軍，劉璇，柳暢先.殼聚糖固定化乳酸脫氫酶的制備及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].分析科學(xué)學(xué)報，2009，25（5）：571-574.

[53] 徐俊，樓一心，朱正華.異硫氰酸酯法固定化醇脫氫酶乳酸脫氫酶和輔酶I[J].華東化工學(xué)院學(xué)報，1989，15（4）：436-440.

[54] 庹潯，程潔，柳暢先.反膠束固定化乳酸脫氫酶的催化動力學(xué)性質(zhì)研究[J].分析科學(xué)學(xué)報，2008，24（3）：280-282.

[55] 柳暢先，胡亞楠，馬璐.乳酸脫氫酶在CTAB-戊醇反膠束體系中的催化動力學(xué)研究[J].中南民族大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，31（3）：10-13.

[56] ZABOLI M，RAISSI H，ZABOLI M，et al.Stabilization of D-lactate dehydrogenase diagnostic enzyme via immobilization on pristine and carboxyl-functionalized carbon nanotubes，a combined experimental and molecular dynamics simulation study[J].Archives of biochemistry and biophysics，2019，661：178-186.

[57]? MA L J，WEN J P，LU W Y，et al.Efficient immobilization of lactate dehydrogenase in biocomposites of double-walled carbon nanotube-doped alginate gel[J].Enzyme and microbial technology，2008，42（3）：235-241.

[58] 劉雪凌，林貝.載體固定化酶的應(yīng)用及前景展望[J].廣州化工，2020，48（9）：22-24.