Ⅱ、Ⅲ期直腸癌Ki-67 及微衛(wèi)星不穩(wěn)定的表達對預(yù)后的影響

周 濤

（泰州市第二人民醫(yī)院普外科，江蘇 泰州 225500）

直腸癌（rectal cancer）是消化道系統(tǒng)發(fā)生率較高的惡性腫瘤類型，且近年來呈現(xiàn)出逐年上升趨勢，致殘率、致死率較高[1]。目前直腸癌的發(fā)病機制尚未形成統(tǒng)一觀點，認為可能影響疾病發(fā)生與發(fā)展的高危因素包括年齡、吸煙、肥胖、飲酒、運動不足、高蛋白飲食等[2，3]。治療結(jié)腸癌的方式有手術(shù)、放療、化療、中藥治療等[4]。Ki-67 蛋白是與細胞分裂增殖密切相關(guān)的蛋白，在靜止期細胞中不表達，在增殖細胞中則有著廣泛的表達，對結(jié)腸癌患者的預(yù)后有一定的預(yù)測意義[5]。有研究顯示[6]，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與結(jié)腸癌患者的預(yù)后密切相關(guān)?；诖?，本研究以2019年3 月-2021 年3 月我院收治的Ⅱ、Ⅲ期結(jié)腸癌患者共65 例為研究對象，分析Ki-67 及微衛(wèi)星不穩(wěn)定的表達對預(yù)后的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019 年3 月-2021 年3 月在泰州市第二人民醫(yī)院治療的65 例結(jié)腸癌患者作為研究對象，其中男性53 例，女性32 例；年齡30～82歲，平均年齡（60.32±6.13）歲；Ⅱ期27 例，Ⅲ期38例；腫瘤直徑≤4 cm 12 例，腫瘤直徑＞4 cm 53 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35 例；腫瘤位置：左18 例，右47 例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者自愿參與研究，并簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標準 納入標準：①經(jīng)影像學(xué)、腸鏡、病理學(xué)等確診為Ⅱ、Ⅲ期直腸癌；②無肝、腎或其他可能影響治療及隨訪結(jié)果的疾病。排除標準：①術(shù)前接受過新輔助放療或化療；②結(jié)腸癌；③其他惡性腫瘤史；④影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)其他部位遠處轉(zhuǎn)移；⑤精神病史或認知障礙。

1.3 方法 免疫組化法檢測錯配修復(fù)蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 表達以及Ki-67 蛋白，鼠抗人MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，鼠抗人Ki-67 單克隆抗體購自德泰生物科技有限公司，EnVision 免疫組化檢測試劑盒、DAB 顯色液、抗原修復(fù)液、PBS 緩沖液均由華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院病理科提供。將組織石蠟切片置于65 ℃烤箱中，持續(xù)2 h，隨后常規(guī)脫蠟至水，通過蒸餾水清洗2 次，在室溫下孵育。30%H2O2室溫下孵育15 min，充分消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，經(jīng)蒸餾水沖洗后，利用PBS 浸泡5 min。之后將切片浸泡于枸櫞酸鹽緩沖液中，使用不銹鋼壓力鍋進行抗原修復(fù)，當壓力鍋出現(xiàn)噴氣時，等待2～3 min，利用PBS 沖洗3 次，5 min/次。添加兔抗人Ki-67 單克隆抗體，使用PBS 液按照1∶150 進行稀釋，在4 ℃環(huán)境下孵育過夜，PBS 沖洗3 次，5 min/次。加入HRP 標記二抗工作液50 μl，室溫下孵育60 min，PBS 沖洗3 次，5 min/次。DAB 顯色試劑盒進行顯色，在顯微鏡下觀察結(jié)果，蒸餾水洗滌終止顯色反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，1%酒精鹽酸分化，自來水返藍，蒸餾水洗滌，脫水、透明、封片。Ki-67 陽性標準：以腫瘤細胞核染色為陽性，在高倍鏡（400）下選擇10 個視野進行計算，增值指數(shù)（PI）=（陽性腫瘤細胞數(shù)/總瘤細胞數(shù)）×100%，PI＜10%為陰性，PI≥10%為陽性。微衛(wèi)星不穩(wěn)定評價標準：任意一項錯配修復(fù)蛋白表達缺失即為微衛(wèi)星不穩(wěn)定，否則為微衛(wèi)星穩(wěn)定。

1.4 觀察指標 分析微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、Ki-67 與直腸癌臨床特征的關(guān)系及其對直腸癌生存期的影響。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進行分析，計量資料使用（）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料使用[n（%）]表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 錯配修復(fù)蛋白以及Ki-67 表達情況 MLH1 表達缺失11 例，MSH2 表達缺失14 例，MSH6 表達缺失8 例，PMS2 表達缺失7 例。Ki-67 表達陽性48 例，陰性17 例。

2.2 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與直腸癌臨床特征的關(guān)系 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM 分期有關(guān)（P＜0.05），見表1。

表1 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與直腸癌臨床特征的關(guān)系[n（%）]

2.3 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性對直腸癌生存期的影響 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性患者總生存期為（32.05±8.55）個月，高于微衛(wèi)星穩(wěn)定性患者的（22.43±9.53）個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.684，P=0.000）。

2.4 Ki-67 與直腸癌臨床特征的關(guān)系 Ki-67 與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM 分期有關(guān)（P＜0.05），見表2。

表2 Ki-67 與直腸癌臨床特征的關(guān)系[n（%）]

2.5 Ki-67 對直腸癌生存期的影響 Ki-67 陽性患者總生存期為（31.47±7.16）個月，高于Ki-67 陰性患者的（23.21±9.54）個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.712，P=0.000）。

3 討論

直腸癌是臨床中常見的消化道惡性腫瘤。直腸癌的位置深入盆腔，解剖關(guān)系較為復(fù)雜，手術(shù)治療雖然能取得一定的療效，但難以達到徹底消除的效果，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高[7]。中下段直腸癌與肛管括約肌較為接近，手術(shù)操作可能會對肛門功能造成一定的影響。近年來，隨著生活結(jié)構(gòu)、飲食結(jié)構(gòu)以及老齡化趨勢等多方面因素的影響，直腸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升趨勢[8]。直腸癌預(yù)后是臨床中備受關(guān)注的問題，其影響因素較多，例如臨床分期、病理組織學(xué)情況、手術(shù)是否根治等，早期直腸癌術(shù)后5 年生存率較高，可達到90%，復(fù)發(fā)率僅為1.2%～4.9%，但對于Ⅱ～Ⅲ期局部進展期直腸癌，經(jīng)手術(shù)、放化療等治療后，5 年生存率會下降至50%～78%[9，10]。目前普遍認為直腸癌的發(fā)病與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、Ki-67 等因素有關(guān)[11，12]。

本研究結(jié)果顯示，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM 分期有關(guān)（P＜0.05）。微衛(wèi)星是基因組中具有高度特異性的短串聯(lián)重復(fù)序列，當錯配修復(fù)及因出現(xiàn)突變或發(fā)生子區(qū)甲基化時，會導(dǎo)致其功能下降或喪失，當重復(fù)序列插入或缺失時無法修復(fù)，從而影響微衛(wèi)星的長度，導(dǎo)致遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定性，造成細胞增殖失控，從而引發(fā)腫瘤[13，14]。有研究顯示[15]，微衛(wèi)星穩(wěn)定、低表達穩(wěn)定相比高表達穩(wěn)定患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高、浸潤深度更深，本次研究結(jié)果與上述研究相符。本研究還發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性患者總生存期長于微衛(wèi)星穩(wěn)定性患者（P＜0.05），可見微衛(wèi)星不穩(wěn)定性有利于延長患者生存期。也有研究提出微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是獨立于其他病理指標之外，與患者預(yù)后生存密切相關(guān)的因素[16]，本次研究結(jié)果與之相似。Ki-67 是一種核蛋白，是臨床判斷細胞增殖的主要標志物，在細胞增殖的各個階段均有明顯表達，但在細胞靜止期不表達[17，18]。研究顯示[19]，Ki-67 的表達與腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，對判斷腫瘤預(yù)后也具有一定的價值。本研究中Ki-67 陽性患者總生存期長于Ki-67 陰性患者（P＜0.05）。Ki-67 與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM 分期有關(guān)（P＜0.05），表明Ki-67 的表達對直腸癌患者預(yù)后具有一定的評估價值，當Ki-67 處于高表達時，腫瘤的增殖速度較快，惡性程度也越高。

綜上所述，Ki-67 陰性及微衛(wèi)星不穩(wěn)定表達有利于延長Ⅱ、Ⅲ期直腸癌患者的總生存期，主要與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期有關(guān)。