薰衣草芳樟醇合酶基因的克隆、表達(dá)及酶活性檢測

龔林濤 蘇秀娟 廖 燕 克熱木汗·吾斯曼 周 迪 尹松松

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，830052，新疆烏魯木齊）

薰衣草屬唇形科薰衣草屬（Lavandula），多年生半灌木或小灌木[1]，是我國新疆特色的芳香植物，其植株耐旱、耐寒、喜光、怕澇，適宜質(zhì)地疏松的土壤[2]。芳樟醇含量是評價(jià)薰衣草精油品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[3]。芳樟醇合酶（linalool synthase，LIS）是由芳樟醇合酶基因編碼而來，可以將異戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯基二磷酸（DMAPP）的產(chǎn)物牻牛兒基焦磷酸（GPP）一步催化成芳樟醇，芳樟醇被乙醇?；D(zhuǎn)移酶催化后可結(jié)合?；o酶 A中的?；纬梢宜岱颊刘4]。天然的芳樟醇?xì)馕肚逄?、圓潤，廣泛存在于植物的揮發(fā)油中，在香精、香料和醫(yī)療保健產(chǎn)業(yè)上應(yīng)用廣泛[5]。Kessler等[6]證實(shí)芳樟醇活性揮發(fā)物具有殺蟲的功效；劉靜等[7]發(fā)現(xiàn)薰衣草精油具有明顯的鎮(zhèn)靜催眠作用；Linck等[8]證實(shí)芳樟醇對小鼠也存在鎮(zhèn)靜作用。芳樟醇是薰衣草精油的重要功效組分，因此對芳樟醇在薰衣草體內(nèi)合成機(jī)制的研究具有重要意義。

LIS基因最早從仙女扇中克隆，是第1個(gè)分離得到的單萜類合成酶基因[9]。國內(nèi)外已經(jīng)從煙草、仙女扇和莽山野柑等植物中克隆了LIS基因，研究[10]表明，其編碼的蛋白質(zhì)可催化 GPP轉(zhuǎn)化成芳樟醇。Mendoza-Poudereux等[11]將仙女扇LIS基因轉(zhuǎn)入寬葉薰衣草后，轉(zhuǎn)基因植株葉片中的芳樟醇含量顯著增加，其含量是對照植株的 10倍，且表型未發(fā)生變異。Lewinsohn等[12]將仙女扇LIS基因轉(zhuǎn)入番茄中，轉(zhuǎn)基因番茄中芳樟醇及其衍生物的含量也都有所上升。沉默煙草NaLIS基因，植株中芳樟醇含量顯著下降[13]。將百合LiTPS2基因轉(zhuǎn)入煙草植株中，轉(zhuǎn)基因植株花中芳樟醇含量比野生型植株高2～3倍[14]。桂花OfTPS1和OfTPS2基因在煙葉中瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)均可產(chǎn)生芳樟醇[15]。張雪榮[16]將從羽葉薰衣草中克隆的LIS基因轉(zhuǎn)入矮牽牛中，檢測到芳樟醇合酶。趙忠鑫等[17]對闊葉薰衣草中克隆的LIS基因進(jìn)行了基因結(jié)構(gòu)分析。

提高薰衣草精油中的芳樟醇含量是提升薰衣草精油品質(zhì)的有效途徑，研究薰衣草芳樟醇合酶的作用機(jī)理，可為分子水平上調(diào)控芳樟醇產(chǎn)量提供參考。本研究以高油雜薰衣草品種“雜花”（Lavandula xintermedia“Zahua”）為材料，克隆芳樟醇合酶基因LIS1和LIS2；以低油狹葉薰衣草品種“法國藍(lán)”（Lavandulaangustifolia“French blue”）為對照。比較了LIS1和LIS2基因在2個(gè)薰衣草品種不同發(fā)育時(shí)期的花冠和盛開期花器官不同組織的表達(dá)量，分析了2個(gè)基因原核表達(dá)和酶活性情況，初步揭示了它們在薰衣草萜類代謝通路上的調(diào)控作用，為利用基因工程手段培育精油高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的薰衣草新品種提供了候選基因。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試薰衣草品種為“雜花”和“法國藍(lán)”，于2018年6月在新疆伊犁地區(qū)70團(tuán)采樣。

1.2 載體和試劑

pET-28a(+)載體保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；大腸桿菌感受態(tài)、熒光定量SuperMix、高保真酶、pEASY-T5載體和蛋白質(zhì)Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；核酸染料和 DNA Marker購自北京酷來搏科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購自賽默飛世爾科技有限公司；Ni-NTA蛋白純化試劑盒、Elution Buffer、Binding/Wash Buffer和透析裝置購自上海生工生物工程有限公司；GPP購自 Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司。由昆泰銳生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行引物合成和測序。LB培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基含胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，固體LB培養(yǎng)基另加瓊脂15g。HEPES緩沖液：稱取 0.598g HEPES、0.203g MgCl2、0.0016g MnCl2、0.00659g Na2WO4、0.00042g NaF和 0.0077g DTT，加入10mL甘油，定容至100mL。

1.3 基因的克隆

根據(jù) NCBI提供的狹葉薰衣草（Lavandula angustifolia）芳樟醇合酶核苷酸序列（登錄號：DQ263741.1）和闊葉薰衣草（Lavandulalatifolia）芳樟醇合酶核苷酸序列（登錄號：DQ421801.1）設(shè)計(jì)特異性引物F1、R1和F2、R2，引物序列見表1。提取“雜花”葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)體系：cDNA 1μL、上下游引物各 1μL、2.5mmol/L dNTP 5μL、10×EasyPfuBuffer 5μL、EasyPfuDNA Polymerase 1μL 和 H2O 36μL。引物F1和R1反應(yīng)條件為94℃ 5min；94℃30s，60℃ 40s，72℃ 2min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min；引物F2和R2反應(yīng)條件為94℃ 5min；94℃ 30s，63℃ 40s，72℃ 2min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳回收后，用pEASY-T5載體連接，菌液PCR鑒定陽性克隆，由昆泰銳生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。

表1 試驗(yàn)所用引物序列及用途Table 1 Primers sequence and application

1.4 生物信息學(xué)分析

使用表2中生物信息學(xué)網(wǎng)站對蛋白進(jìn)行預(yù)測。

表2 生物信息學(xué)分析工具Table 2 Bioinformatics analysis tools

1.5 表達(dá)模式分析

“雜花”和“法國藍(lán)”花器官不同發(fā)育時(shí)期的花冠各取3株，包括花蕾期、初開期、半開期、盛開期、衰敗期以及花器官盛開期的不同組織（花萼、花冠、苞葉、雄蕊、雌蕊）（圖1），提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，生物學(xué)重復(fù)3次。設(shè)計(jì)用于熒光定量表達(dá)分析的特異性引物F3、R3和F4、R4，引物序列見表1；以β-Actin（KY596032.1）基因?yàn)閮?nèi)參，利用熒光定量PCR技術(shù)分析LIS1和LIS2基因在薰衣草花器官不同發(fā)育時(shí)期花冠和盛開期不同組織中的表達(dá)模式，并比較基因在不同品種中的表達(dá)量。不同組織基因的表達(dá)量以葉片作為對照，不同發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)量以花蕾期作為對照，使用DPS軟件處理數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 5軟件繪圖。

圖1 薰衣草花器官不同組織和不同發(fā)育時(shí)期示意圖Fig.1 Schematic diagram of different tissues of lavender flower organs and different development stages

1.6 原核表達(dá)分析

1.6.1 重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化 設(shè)計(jì)含有EcoRⅠ、Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)的克隆引物F5和R5，以及含有NdeⅠ、EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)的克隆引物F6和R6，引物序列見表1，酶切擴(kuò)增產(chǎn)物及pET-28a(+)載體，瓊脂糖凝膠電泳后回收純化目的基因及線性載體，用 T4連接酶連接目的基因及線性載體后轉(zhuǎn)化DH5α，挑選并鑒定陽性克隆，由昆泰銳生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Transetta(DE3)感受態(tài)。培養(yǎng)條件為37℃，220轉(zhuǎn)/min，活化50μL pET-28a(+)-LIS1、pET-28a(+)-LIS2Transetta(DE3)菌株至5mL LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12h，將活化后的500μL菌液加入15mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600在0.4～0.6之間，分裝到不同離心管中，每管分裝1mL。每毫升菌液使用不同濃度IPTG（0.0、0.1、0.5、0.8、1.0、1.5和2.0mmol/L）的LB培養(yǎng)基，篩選不同誘導(dǎo)溫度（28℃、37℃和40℃）和不同誘導(dǎo)時(shí)間（0、2、4、6和8h）進(jìn)行條件優(yōu)化。用60μL去離子水重懸菌液沉淀后加入 15μL 5×蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸10min，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。

1.6.2 蛋白可溶性鑒定 采用已優(yōu)化的誘導(dǎo)條件，活化菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)后取 1mL作為誘導(dǎo)前全菌蛋白樣品，其余菌液分為2組，一組加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，另一組不加誘導(dǎo)劑作為對照。將菌液 8000轉(zhuǎn)/min，4℃，離心10min，沉淀加入10mL PBS緩沖液，使用移液器吹打重懸后進(jìn)行細(xì)胞破碎。破碎條件為200W，超聲3s，間隔10s，柱頭溫度10℃。分別取 60μL破碎后菌液作為未誘導(dǎo)全菌蛋白樣品、誘導(dǎo)后全菌蛋白樣品；取 1mL誘導(dǎo)后破碎菌液，8000轉(zhuǎn)/min，4℃，離心10min，取上清液60μL作為誘導(dǎo)后可溶樣品，使用60μL去離子水重懸沉淀作為誘導(dǎo)后不可溶樣品。分別取誘導(dǎo)前蛋白樣品、未誘導(dǎo)蛋白樣品、誘導(dǎo)后蛋白樣品、誘導(dǎo)后可溶樣品和誘導(dǎo)后不可溶樣品于100℃煮沸10min，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。

1.6.3 溶解回收包涵體蛋白 大量制備包涵體蛋白后，參照上海生工生物工程有限公司Ni-NTA瓊脂糖純化樹脂說明書，使用超聲溶解包涵體后，取60μL 包涵體溶解液，加入 15μL 5×蛋白上樣緩沖液，煮沸10min后備用。樣品上柱后，收集流穿液，取流穿液60μL，加入15μL 5×蛋白上樣緩沖液，煮沸10min后備用。用2mL洗脫緩沖液洗脫柱上的組氨酸標(biāo)簽蛋白2次，每次的洗脫液分別保存，取洗脫液 60μL，加入 15μL 5×蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸10min，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。隨后采用透析法去除純化蛋白中的咪唑。

1.7 酶活性檢測

LIS1和LIS2重組蛋白酶活性鑒定反應(yīng)體系為HEPES 500μL、GPP 20μL 和重組蛋白 200μL。向反應(yīng)管中加入純化后的蛋白，輕柔混勻，加入1mL正己烷封住液面，旋緊蓋子，用封口膜密封后于30℃水浴30min，取出反應(yīng)管。方法參照文獻(xiàn)[18]，略有改動。

將樣品送至中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所進(jìn)行檢測，采用氣相色譜―質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析樣品成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 LIS1和LIS2基因的克隆與序列分析

以“雜花”cDNA為模板，擴(kuò)增LIS1和LIS2基因（圖2）。使用DNAMAN軟件進(jìn)行分析，“雜花”LIS1基因的開放閱讀框（ORF）長1809bp，編碼一條由602個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)序列；“雜花”LIS2基因的ORF長1695bp，編碼一條由564個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)序列。使用ProtParam在線程序計(jì)算“雜花”LIS1和LIS2基因編碼蛋白的理化參數(shù)，結(jié)果表明，“雜花”LIS1蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為5.45，分子量約為70.32kDa；“雜花”LIS2蛋白等電點(diǎn)為5.08，分子量約為65.65kDa?！半s花”LIS1和LIS2芳樟醇合酶基因序列相似度為58.54%。

圖2 LIS基因擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of LIS gene amplification products

2.2 LIS1和LIS2蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析

2.2.1 LIS1和 LIS2蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測 使用EMBL的Pfam在線軟件推導(dǎo)出LIS1和LIS2蛋白功能結(jié)構(gòu)域（圖3），可看出2種蛋白質(zhì)序列含有Terpene_synth結(jié)構(gòu)域和Terpene_synth_C結(jié)構(gòu)域，預(yù)測LIS1和LIS2蛋白屬于Terpene_synth超家族和Isoprenoid_Biosyn_C1超家族。

圖3 LIS1和LIS2蛋白的功能結(jié)構(gòu)域Fig.3 Conserved domains in LIS1 and LIS2 proteins

2.2.2 LIS1和LIS2蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測 使用PSIPRED在線工具預(yù)測LIS1和LIS2蛋白二級結(jié)構(gòu)。LIS1蛋白二級結(jié)構(gòu)包含3個(gè)β-折疊和28個(gè)α-螺旋；LIS2蛋白二級結(jié)構(gòu)包含29個(gè)α-螺旋（圖4）。

圖4 LIS1和LIS2蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Predicted secondary structure of LIS1 and LIS2 proteins

使用 SWISS-Model在線程序的自動模式對LIS1和LIS2蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)“雜花”LIS1和 LIS2蛋白三級結(jié)構(gòu)中分別含有GCC元件結(jié)合結(jié)構(gòu)域SMTL ID 2o1x.1 B和SMTL ID 1n1b.1 B，相似性分別達(dá)到 52.50%和 64.56%（圖5）。

圖5 LIS1和LIS2蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Predicted tertiary structures of LIS1 and LIS2 proteins

2.2.3 LIS1和 LIS2蛋白進(jìn)化分析 使用DNAMAN軟件對水薄荷（Menthaaquatica）、甜舌草（Phyladulcis）、陸地棉（Gossypiumhirsutum）、紫蘇（Perillasetoyensis）、一串紅（Salviasplendens）、桂花（Osmanthusfragransvar.thunbergii）、闊葉薰衣草、狹葉薰衣草和雜薰衣草中的芳樟醇合酶蛋白進(jìn)行相關(guān)蛋白多序列比對，發(fā)現(xiàn)LIS1和LIS2蛋白序列具有單萜類合成酶的所有保守氨基酸和功能高度保守域序列，即 DDXXD、RRX8W 和DDXXTXXXE功能基團(tuán)（圖6）。使用MEGA 5.0軟件鄰近連接法對上述物種的芳樟醇合酶蛋白進(jìn)行相關(guān)蛋白的同源樹構(gòu)建，結(jié)果（圖7）顯示，LIS1蛋白和闊葉薰衣草、一串紅中的芳樟醇合酶親緣關(guān)系相近；LIS2蛋白和狹葉薰衣草、雜薰衣草中的芳樟醇合酶親緣關(guān)系相近。

圖6 LIS1和LIS2蛋白與其他物種芳樟醇合酶蛋白的多序列比對Fig.6 Multiple alignment of amino acid sequences of LIS1 and LIS2 proteins with linalool synthase proteins from other species

圖7 LIS1和LIS2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.7 Phylogenetic tree analysis of LIS1 and LIS2 proteins

2.3 LIS1和LIS2基因的表達(dá)模式分析

經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，在2個(gè)薰衣草品種不同發(fā)育時(shí)期、花器官不同組織中均檢測到了LIS1和LIS2基因的表達(dá)（圖8-9）。在花器官不同發(fā)育時(shí)期，LIS1基因在“雜花”花冠的衰敗期表達(dá)量最高，在花蕾期和初開期的表達(dá)量相對較低；該基因在“法國藍(lán)”花冠中的初開期、半開期、盛開期和衰敗期表達(dá)量緩慢上升。比較LIS1基因在2個(gè)薰衣草品種中不同時(shí)期表達(dá)量情況，該基因在花蕾期和初開期相對表達(dá)量差異不大，在半開期、盛開期和衰敗期“雜花”的表達(dá)量均高于“法國藍(lán)”；LIS2基因在“雜花”花冠的不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量逐漸上升，衰敗期達(dá)到最高，但“法國藍(lán)”在半開期表達(dá)量達(dá)到最高，之后盛開期、衰敗期逐漸下降。

圖8 LIS1基因表達(dá)量及顯著性分析Fig.8 LIS1 gene expression level and significance analysis

圖9 LIS2基因表達(dá)量及顯著性分析Fig.9 LIS2 gene expression level and significance analysis

在花器官不同組織中，LIS1基因在“雜花”花萼中表達(dá)量最高，其次為花冠，在花蕊中的相對表達(dá)量較低，而該基因在“法國藍(lán)”花器官各組織中幾乎不表達(dá)；LIS1基因在“雜花”花器官不同組織中的相對表達(dá)量明顯高于其在“法國藍(lán)”花器官不同組織中的（雌蕊、雄蕊和葉片除外）相對表達(dá)量；LIS2基因在“雜花”花萼中表達(dá)量最高，其次為花冠，在其他組織中表達(dá)量較低；LIS2基因在“法國藍(lán)”雄蕊中表達(dá)量最高，其次為花萼。LIS2基因在“法國藍(lán)”雄蕊中的表達(dá)量明顯高于其在“雜花”中的表達(dá)量，在花冠、花萼和苞葉中的表達(dá)量低于在“雜花”中的表達(dá)量。LIS1和LIS2基因在2個(gè)品種花器官中的表達(dá)量均存在差異，LIS2基因在2個(gè)品種花器官不同發(fā)育時(shí)期、不同組織中的相對表達(dá)量均高于LIS1基因在2個(gè)品種中的表達(dá)量。

2.4 LIS1和LIS2基因原核表達(dá)分析

構(gòu)建pET-28a(+)-LIS1和pET-28a(+)-LIS2重組質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，結(jié)果（圖10）表明，酶切后獲得的條帶與目的條帶大小一致。測序結(jié)果與目的序列一致，證明載體構(gòu)建成功。

圖10 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-LIS1和pET-28a(+)-LIS2的雙酶切鑒定Fig.10 Identification of recombinant plasmid pET-28a(+)-LIS1 and pET-28a(+)-LIS2 by double enzyme digestion

活化Transetta/pET-28a(+)-LIS1和Transetta/pET-28a(+)-LIS2表達(dá)菌后，對誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度進(jìn)行優(yōu)化，Transetta/pET-28a(+)-LIS1在37℃、IPTG終濃度1mmol/L時(shí)，誘導(dǎo)4h后，LIS1蛋白表達(dá)量最大，Transetta/pET-28a(+)-LIS2在37℃、IPTG終濃度1mmol/L時(shí)，誘導(dǎo)6h后，LIS2蛋白表達(dá)量最大。取細(xì)菌沉淀進(jìn)行全菌蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，結(jié)果（圖11）表明，誘導(dǎo)蛋白條帶大小與預(yù)測蛋白一致。

圖11 LIS1和LIS2重組蛋白原核表達(dá)分析Fig.11 Prokaryotic expression analysis of LIS1 and LIS2 recombinant proteins

對重組蛋白 LIS1和 LIS2分別進(jìn)行可溶性鑒定，發(fā)現(xiàn)二者均為不可溶的包涵體蛋白（圖12）。

圖12 LIS1和LIS2重組蛋白可溶性鑒定Fig.12 Soluble identification of LIS1 and LIS2 recombinant proteins

對重組蛋白LIS1和LIS2分別進(jìn)行溶解回收鑒定，結(jié)果（圖13）表明，回收后的蛋白條帶均可見，符合進(jìn)行體外酶活性檢測的條件。

圖13 LIS1、LIS2重組蛋白回收鑒定Fig.13 Recovery identification of LIS1 and LIS2 recombinant proteins

將制備好的LIS1和LIS2重組蛋白分別進(jìn)行體外酶活性檢測。添加了 LIS1蛋白和底物 GPP的HEPES緩沖體系在9.655和9.610min處分別檢測到芳樟醇特異性峰（圖 14a）和 5-[1-羥甲基乙烯基]2-甲基環(huán)己醇特異性峰（圖14b）；添加了LIS2蛋白和底物GPP的HEPES緩沖體系在9.629min處檢測到芳樟醇特異性峰（圖15）。結(jié)果表明，LIS1重組蛋白可催化底物GPP合成芳樟醇和5-[1-羥甲基乙烯基]2-甲基環(huán)己醇，LIS2重組蛋白可催化底物GPP合成芳樟醇。

圖14 LIS1重組蛋白添加底物輸出產(chǎn)物GC-MS檢測Fig.14 GC-MS detection of output products of LIS1 recombinant protein supplemented with substrate

圖15 LIS2重組蛋白添加底物輸出產(chǎn)物GC-MS檢測Fig.15 GC-MS detection of output products of LIS2 recombinant protein supplemented with substrate

3 討論

3.1 芳樟醇合酶基因的結(jié)構(gòu)

芳樟醇合酶是植物中合成芳樟醇的主要催化酶，萜烯合成酶氨基酸序列的相似性并不意味著功能的相似性，芳樟醇合酶可以獨(dú)立于其他萜類合成酶基因自由地進(jìn)化和分離[19]。本研究克隆了“雜花”薰衣草的芳樟醇合酶基因LIS1和LIS2，在氨基酸序列中均發(fā)現(xiàn)了單萜類合成酶的所有保守氨基酸序列和功能高度保守域序列，包括結(jié)合二價(jià)金屬離子的DDXXD基團(tuán)、具有環(huán)化異構(gòu)功能的RRX8W基團(tuán)和結(jié)合固定底物的DDXXTXXXE基團(tuán)。本研究中2條芳樟醇合酶序列相似度為58.54%，推測結(jié)構(gòu)差異是造成LIS1和LIS2蛋白質(zhì)催化底物GPP合成產(chǎn)物數(shù)量不一致的原因，該結(jié)果與Cseke等[20]認(rèn)為LIS是一種復(fù)合基因，可能由2種不同類型的萜烯合成酶基因重組演變而來相一致。Raguso等[21]也驗(yàn)證了芳樟醇合酶與檸檬烯合成酶（LMS）和古巴酯焦磷酸合成酶（CPS）基因具有相同序列。

3.2 芳樟醇合酶基因表達(dá)模式及差異

在同一物種內(nèi)，芳樟醇合酶基因在不同品種或生態(tài)型表達(dá)水平存在差異[22]。Lin等[23]發(fā)現(xiàn)，不同品種肉桂的芳樟醇合酶表達(dá)存在差異，芳樟醇型品種基因表達(dá)水平高于肉桂醛型品種和樟腦型品種。在“雜花”和“法國藍(lán)”2個(gè)品種花器官不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中，LIS2基因的表達(dá)量均高于LIS1，且LIS1基因在“雜花”中表達(dá)量偏高，LIS2基因在“法國藍(lán)”中的表達(dá)量相對偏高。芳樟醇合酶基因在同一植株不同發(fā)育時(shí)期和不同組織的表達(dá)水平也存在差異。如姜花中芳樟醇合酶基因在營養(yǎng)器官中幾乎不表達(dá)，但在花器官不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平與芳樟醇含量呈正相關(guān)[24]。小蒼蘭FhTPS1基因在花器官不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中均表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式[25]。鐵線蓮萼片中芳樟醇合酶基因的表達(dá)水平高于其在花瓣和子房中的表達(dá)水平[26]。在蓍草不同組織中LIS基因表達(dá)存在差異，該基因在葉和腺毛中的表達(dá)量較高，而在花器官中則不表達(dá)。本研究中，LIS1基因在“法國藍(lán)”不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量隨時(shí)間呈現(xiàn)遞增趨勢，但在2個(gè)品種不同組織中該基因的表達(dá)量極低；LIS2基因在“雜花”不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量隨著時(shí)間呈現(xiàn)遞增趨勢，在2個(gè)品種的不同組織中該基因表達(dá)量較高。薰衣草花穗中的精油大部分包含在花萼的腺體中[28]，LIS1基因在“雜花”花萼中表達(dá)量最高，但在“法國藍(lán)”花萼中幾乎不表達(dá)；LIS2基因在“雜花”和“法國藍(lán)”花萼中的表達(dá)量均處于較高水平，推測其是合成花萼中精油成分的主要萜類合成酶；LIS2基因在“法國藍(lán)”半開期、盛開期和衰敗期表達(dá)量沒有顯著差異。為進(jìn)一步揭示2個(gè)基因調(diào)控芳樟醇合成的作用，還需將基因表達(dá)模式與花器官不同發(fā)育時(shí)期和不同組織的芳樟醇含量相結(jié)合進(jìn)行一致性分析。

3.3 芳樟醇合酶的原核表達(dá)和活性鑒定

利用大腸桿菌表達(dá)鑒定芳樟醇合酶的實(shí)例多有報(bào)道，方柳[18]采用原核表達(dá)方式，驗(yàn)證了莽山野柑LIS基因編碼的蛋白可催化底物GPP生成芳樟醇。Chuang等[29]運(yùn)用此方法驗(yàn)證了楓香LfTPS05基因編碼的蛋白可催化底物 GPP生成芳樟醇，還可催化底物法尼基焦磷酸生成橙花叔醇。從月季[30]和山茶花[31]等植物中分離出的芳樟醇合酶基因的功能也已利用此方法被驗(yàn)證。此方法效率高，但受重組蛋白可溶性、稀有密碼子使用、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和可能的毒性效應(yīng)限制[32]。

本研究利用大腸桿菌表達(dá)重組蛋白，純化回收蛋白后進(jìn)行酶活性鑒定，結(jié)果表明，LIS1和LIS2蛋白都具有單萜合酶活性，LIS1蛋白參與合成芳樟醇和5-[1-羥甲基乙烯基]2-甲基環(huán)己醇，LIS2蛋白參與合成芳樟醇。研究[33]表明，部分植物單萜合酶在特異的代謝環(huán)境中會產(chǎn)生多種產(chǎn)物，LIS1蛋白在體外活性鑒定中催化合成了2種單萜類物質(zhì)，推測其在植物體內(nèi)可催化合成多種產(chǎn)物。重組蛋白的酶活鑒定結(jié)果初步揭示了2個(gè)基因具有催化底物合成芳樟醇的功能，但仍需通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物體內(nèi)進(jìn)行過表達(dá)和基因沉默，以期準(zhǔn)確驗(yàn)證其功能。

4 結(jié)論

對從“雜花”薰衣草中克隆的LIS1和LIS2基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，薰衣草LIS1和LIS2基因是萜類合成酶中的成員。LIS1和LIS2基因在不同薰衣草品種和花器官不同組織、不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量均存在差異。重組蛋白的體外酶活性鑒定表明，LIS1和LIS2基因編碼的蛋白可催化底物GPP生成芳樟醇，同時(shí)LIS1蛋白還可催化底物GPP生成5-[1-羥甲基乙烯基]2-甲基環(huán)己醇。初步揭示了薰衣草LIS1和LIS2基因具有調(diào)控芳樟醇生物合成的功能。