利用高密度遺傳圖譜發(fā)掘水稻抽穗期新位點(diǎn)

蘇代群 陳 亮 李 鋒 武 琦 白君杰鄒德堂 王敬國 劉化龍 鄭洪亮

（1黑龍江省種業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，150008，黑龍江哈爾濱；2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)寒地糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與生理生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，150030，黑龍江哈爾濱）

水稻是世界上大部分人口賴以生存的糧食作物之一，世界水稻種植面積占糧食作物種植總面積的30%[1]。近年來，由于世界人口逐漸增長導(dǎo)致的口糧需求增多與耕地面積不斷降低之間的矛盾使培育高產(chǎn)和農(nóng)藝性狀優(yōu)質(zhì)的水稻品種迫在眉睫[2]。抽穗期是水稻至關(guān)重要的生育期之一，其不但影響水稻生育期，而且與產(chǎn)量、品質(zhì)及抗逆性等息息相關(guān)，是決定水稻種植地區(qū)及季節(jié)適應(yīng)性的關(guān)鍵性狀[3-4]。因此，水稻抽穗期的研究對(duì)培育高產(chǎn)品種及品種推廣具有實(shí)際意義。

水稻抽穗期的遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，屬于數(shù)量性狀。目前發(fā)掘的水稻抽穗期相關(guān)的QTL已超過700個(gè)，位于第3號(hào)染色體的QTL數(shù)目最多，但目前僅有29個(gè)QTL被克隆[5]。Kojima等[6]將水稻抽穗期相關(guān)QTL精細(xì)定位到20kb的范圍內(nèi)，并在該區(qū)間克隆到 1個(gè)與水稻抽穗期相關(guān)的基因Hd3a。Zong等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在長日照或短日照下，敲除Ghd7及DTH8會(huì)促使水稻抽穗，在長日照條件下，Hd1會(huì)促使Ghd7表達(dá)，最終導(dǎo)致水稻抽穗期推遲甚至不抽穗。Li等[8]發(fā)現(xiàn)，HGW突變體植株的抽穗期延遲，這一基因編碼泛素相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白。盡管目前定位到的QTL數(shù)量很多，但大多數(shù)QTL的區(qū)間很大，且水稻抽穗期屬于復(fù)雜的數(shù)量性狀，因此，需要進(jìn)一步挖掘新的QTL。

傳統(tǒng)的圖譜構(gòu)建通常使用AFLP、RFLP和SSR等標(biāo)記，這種圖譜有標(biāo)記少和覆蓋密度低等缺點(diǎn)。增加標(biāo)記密度是提高QTL定位精度的有效方法[9]。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，利用SNP標(biāo)記能夠快速獲得高通量的基因分型，為遺傳圖譜提供高密度的分子標(biāo)記[10]。因此，穩(wěn)定性高、覆蓋密度高且數(shù)量多的SNP標(biāo)記被廣泛開發(fā)并用于構(gòu)建高密度遺傳圖譜。

本研究利用空育131和小白粳子衍生的重組自交系群體（RIL），通過靶向測序基因型檢測技術(shù)（genotyping by target sequencing，GBTS）進(jìn)行基因型分析，構(gòu)建了包含527個(gè)bin標(biāo)記的高密度遺傳圖譜，發(fā)掘新的抽穗期相關(guān)主效QTL，為水稻基因克隆及分子標(biāo)記輔助選擇育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以粳稻品種空育131為母本、陸稻品種小白粳子為父本配制雜交組合，以通過“單粒傳”法得到的包含195個(gè)株系的F9群體為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

所有材料種植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)阿城水稻試驗(yàn)基地，每份材料種植8行，每行20株，行距30cm、株距13.3cm，均為單株插秧。按株系單獨(dú)編號(hào)，調(diào)查并記錄抽穗日期。當(dāng)該株系的第1個(gè)稻穗尖露出劍葉葉鞘至少1cm時(shí)，記為該株系的抽穗日期，每隔1d調(diào)查1次，將株系從播種到抽穗的天數(shù)作為該株系的抽穗期表型值，方法參照文獻(xiàn)[11]，略有改動(dòng)。田間管理依照常規(guī)大田生產(chǎn)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2016和SPSS Statistics 19.0進(jìn)行相關(guān)性狀表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及QTL分析

利用10K SNP芯片（石家莊博瑞迪生物技術(shù)有限公司）的靶向測序基因型檢測技術(shù)進(jìn)行RIL群體的基因型分析，經(jīng)由雙親多態(tài)性分析及IciMapping-Bin模塊的去冗余分析，將RIL群體最小重組區(qū)間內(nèi)的多個(gè) SNP標(biāo)記合并為 1個(gè)“bin”，最終獲得527個(gè)高質(zhì)量多態(tài)性bin標(biāo)記。通過JoinMap 4.0進(jìn)行遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，該圖譜共覆蓋水稻基因組1874.85cM，標(biāo)記間的平均遺傳距離為3.56cM。采用 QTL IciMapping 4.2軟件的完備區(qū)間作圖法（ICIM）進(jìn)行QTL定位（http://www.isbreeding.net），LOD值設(shè)定為3.0[12]，QTL命名遵循McCouch[13]提出的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻抽穗期的表型分析

分別對(duì)親本及 RIL群體的抽穗期進(jìn)行基本統(tǒng)計(jì)分析（表 1）。親本的抽穗期處于 RIL群體范圍內(nèi)，抽穗期在雙親之間表現(xiàn)出極顯著差異，小白粳子的抽穗期明顯長于空育131。RIL群體的抽穗期具有超親分離現(xiàn)象，平均為 97.74d，變異范圍為76.00～111.00d，變異系數(shù)為7.68%。通過數(shù)據(jù)正態(tài)分布的適合性檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，抽穗期的偏度和峰度絕對(duì)值均小于1，說明性狀的表型符合正態(tài)分布，具有典型的數(shù)量性狀遺傳特征。

表1 水稻抽穗期的基本統(tǒng)計(jì)分析Table 1 Basic statistical analysis of heading stage of rice

2.2 水稻抽穗期QTL分析

采用IciMapping 4.2軟件的完備區(qū)間作圖法，對(duì)水稻抽穗期進(jìn)行QTL分析（圖1和表2），在水稻第1、3和7號(hào)染色體上共檢測到4個(gè)與水稻抽穗期相關(guān)的QTL。4個(gè)QTL的LOD值在3.0181～13.2288之間，表型貢獻(xiàn)率介于4.0619%～21.7016%。其中，qHD-3-1和qHD-7-1的表型貢獻(xiàn)率均大于10%，屬于主效QTL。除qHD-7-1的增效等位基因來自于小白粳子外，其余3個(gè)QTL的增效等位基因均來自于空育131。通過與已克隆水稻抽穗期相關(guān)基因比較發(fā)現(xiàn)，qHD-1-1、qHD-3-2和qHD-7-1區(qū)間內(nèi)分別含有已知基因OsGI、Hd6和Ghd7。而qHD-3-1區(qū)間內(nèi)未發(fā)現(xiàn)已克隆基因，是控制水稻抽穗期的新位點(diǎn)。qHD-3-1貢獻(xiàn)率為10.5098%，位于標(biāo)記C3_799346和C3_1493308之間，物理距離為0.69Mb。

表2 水稻抽穗期QTL及其遺傳效應(yīng)Table 2 Rice heading stage QTLs and its genetic effects

圖1 水稻抽穗期QTL在染色體上的分布Fig.1 Distribution of QTLs on chromosomes at heading stage in rice

3 討論

水稻抽穗期與其產(chǎn)量、品質(zhì)及適應(yīng)性密切相關(guān)[14]。但傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記（例如SSR、RFLP等）存在密度低、數(shù)量少及精度不足甚至雙交換位點(diǎn)漏測等問題，影響了抽穗期相關(guān)QTL的發(fā)掘[15]。相比之下，通過bin標(biāo)記構(gòu)建的高密度遺傳圖譜省時(shí)省力、標(biāo)記密度高且能夠直接發(fā)掘區(qū)間內(nèi)的候選基因，并且由于單個(gè)bin內(nèi)部包含多個(gè)不重組的SNP，避免了雙交換位點(diǎn)漏測的問題。本研究利用包含527個(gè)bin標(biāo)記的高密度遺傳圖譜，平均遺傳距離僅為 3.56cM，能夠快速高效地發(fā)掘抽穗期相關(guān)QTL，并進(jìn)一步預(yù)測候選基因。通過對(duì)由空育131和小白粳子衍生的RIL群體進(jìn)行抽穗期調(diào)查，發(fā)現(xiàn)水稻抽穗期在雙親中表現(xiàn)出極顯著差異，RIL群體變異范圍較廣，有明顯的超親分離現(xiàn)象，表型符合正態(tài)分布，具有典型的數(shù)量性狀遺傳特征，適于進(jìn)行QTL分析。

本研究所定位的4個(gè)與抽穗期相關(guān)QTL中，其中3個(gè)含有與抽穗期相關(guān)的基因。Izawa等[16]發(fā)現(xiàn)，Os-GI突變體在短日照下表現(xiàn)為晚花；Takahashi等[17]研究表明，來源于親本Kasalath的Hd6等位基因在長日照及自然生長條件下均延遲抽穗，反之，在短日照下則不能延遲抽穗。Xue等[18]發(fā)現(xiàn)，長日照條件提高Ghd7的表達(dá)，能推遲抽穗期。因此，Os-GI、Hd6和Ghd7能夠?qū)μ岣呷蛩井a(chǎn)量及水稻季節(jié)適應(yīng)性起到重要作用。此外，只有位于3號(hào)染色體上的qHD-3-1中未包含報(bào)道過的已知基因，且其貢獻(xiàn)率高達(dá)10.5098%，是新的抽穗期相關(guān)QTL，本結(jié)果能夠?yàn)樗境樗肫?QTL的精細(xì)定位及克隆提供參考，同時(shí)為分子標(biāo)記輔助育種提供了新的資源。

4 結(jié)論

基于GBTS技術(shù)對(duì)雙親空育131、小白粳子及其衍生的 RIL群體進(jìn)行基因型分析，構(gòu)建了包含527個(gè) bin標(biāo)記的高密度遺傳圖譜，通過QTL分析，鑒定到4個(gè)與水稻抽穗期相關(guān)的QTL。其中除qHD-3-1外，其余3個(gè)與抽穗期相關(guān)QTL區(qū)間內(nèi)均包含已知的抽穗期基因，說明qHD-3-1是控制水稻抽穗期的新位點(diǎn)。