砷劑調(diào)控腫瘤細胞命運的機制及激活抗腫瘤免疫的潛力

陳錦鋒 馬瑜婷

砷劑治療疾病在中國已有逾2000年的歷史，近年來，其在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。砷劑與細胞中多種生物分子的巰基以及蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基有很高的親和力，而這些蛋白大多參與胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)。因此，砷劑暴露會導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成和累積，進而觸發(fā)多種應(yīng)激反應(yīng)和死亡方式，包括氧化應(yīng)激、自噬、凋亡、程序性壞死、焦亡、鐵死亡等[1-5]?？寡趸瘎㎞-乙酰-L-半胱氨酸能阻斷三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）誘導(dǎo)的細胞死亡，提示ROS 是關(guān)鍵觸發(fā)因素[6]。細胞死亡過程能引發(fā)腫瘤抗原的暴露，并伴隨著一系列“危險信號”分子（又稱cell death-associated molecular patterns，CDAMPs）的釋放，引發(fā)腫瘤細胞“抗原性”與“佐劑原性”的雙重提升，有助于增強腫瘤細胞的“免疫原性”[7]。目前，ATO 誘導(dǎo)的細胞死亡是否能影響腫瘤細胞的免疫原性尚未明確。本文主要總結(jié)ATO 的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀和發(fā)展瓶頸，分析ATO 可能誘導(dǎo)的多種細胞死亡方式，及其相互調(diào)控的分子機制，并就ATO 用于腫瘤免疫治療的新策略及可行性進行探討和展望。

1 砷劑治療腫瘤的概況

上世紀70年代以來，張亭棟、馬軍、陳竺、王振義等國內(nèi)多位醫(yī)學(xué)專家先后在ATO 治療急性早幼粒細胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）的療效和機制探索中獲得重大突破。多項國內(nèi)外研究證實，ATO 對原發(fā)性和復(fù)發(fā)性APL 患者的完全緩解率（complete response，CR）可達85%～90%，且5年生存率較高[8]。鑒于其良好的臨床治療效果，ATO 相繼被美國食品藥品監(jiān)督管理局、歐洲藥品管理局批準用于APL 的治療[9]。

ATO 在APL 治療上的成功為其他類型血液腫瘤的治療提供了理論依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，ATO 與全反式維甲酸聯(lián)合可治療攜帶IDH2 突變的急性髓細胞性白血?。╝cute myeloid leukemia，AML ）（約占AML 患者的20%）[10]。對于FLT3-ITD 突變型AML（約占AML 患者的25%），ATO 能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等促進腫瘤細胞凋亡，改善患者預(yù)后[11]。此外，對慢性髓細胞白血病、復(fù)發(fā)和獲得性耐藥的多發(fā)性骨髓瘤、成人T細胞白血病和骨髓增生異常綜合癥患者，ATO 也具有治療潛力[12-15]。值得注意的是，APL 對ATO 有較高的敏感性，低劑量藥物（0.15 mg·kg-1/d）便可有效治療患者，而大多數(shù)非APL 血液腫瘤需要較高劑量的藥物（0.25 mg·kg-1/d），其臨床應(yīng)用受限于嚴重的不良反應(yīng)（表1，ClinicalTrail.gov 網(wǎng)站已公布的部分血液腫瘤臨床試驗）。

表1 ATO 治療血液腫瘤的臨床試驗

ATO 能有效控制晚期原發(fā)性肝癌肺轉(zhuǎn)移，延長患者總體生存期[16]。然而，對于其他大多數(shù)實體腫瘤（如肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胰腺癌、膀胱癌、子宮癌、乳腺癌、口腔癌等），其臨床應(yīng)用非常有限?？赡茉虬ǎ?）藥物難以到達并留存于腫瘤病灶；2）藥物在體內(nèi)代謝失活并排出；3）藥物損傷正常組織和免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生較強的不良反應(yīng)。為改善ATO對實體瘤的療效，研究者嘗試了多種聯(lián)合策略。遺憾的是，ATO 與放療、化療、小分子靶向藥物等聯(lián)用雖然能增強其胞毒作用，但臨床療效的改善并不顯著。近年來，脂質(zhì)體、聚合物膠束、多孔硅等納米載體遞送策略極大地提高了ATO 的生物利用度，改善了其體內(nèi)藥代動力學(xué)，提高了靶向性，降低了不良反應(yīng)[17]。然而，ATO 納米藥物也面臨著一些技術(shù)瓶頸，包括：載藥量低、緩釋量常難以滿足治療需求；易被單核吞噬細胞系統(tǒng)等清除；病灶局部藥物聚積可抑制免疫細胞浸潤。因此，探索合適的劑量、給藥途徑、藥物聯(lián)合策略是ATO 用于實體瘤治療的重要命題（表2，ClinicalTrail.gov 網(wǎng)站已公布的部分實體腫瘤臨床試驗）。

表2 ATO 治療實體腫瘤的臨床試驗

2 砷劑調(diào)控腫瘤細胞命運的分子機制

ATO 作用下的腫瘤細胞命運如何，不同細胞命運的關(guān)鍵調(diào)控機制如何，是值得深入探索的重要科學(xué)問題。ATO 可直接或間接作用于細胞內(nèi)諸多分子及信號通路，影響多種細胞應(yīng)激和死亡方式，包括：氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬、凋亡、程序性壞死、焦亡、鐵死亡等。圖1 顯示細胞應(yīng)激反應(yīng)與死亡方式的關(guān)鍵調(diào)控機制和形態(tài)學(xué)特征：凋亡細胞膜起泡、DNA 濃縮以及斷裂，形成凋亡小體并釋放內(nèi)容物；自噬過程形成自噬小體，隨后與溶酶體結(jié)合成自噬溶酶體對隔離底物進行降解；程序性壞死中磷酸化的MLKL 能插入細胞膜形成孔道，膜破裂，該過程常伴隨ROS 的增加；焦亡主要依靠CASP 的激活，并活化GSDM 蛋白轉(zhuǎn)位到膜上，形成孔洞，胞質(zhì)外流；鐵死亡表現(xiàn)為線粒體變小、脊變少、脂質(zhì)過氧化等，該過程受GPX4、ASCL4等調(diào)控。

圖1 細胞應(yīng)激反應(yīng)與死亡方式的關(guān)鍵調(diào)控機制和形態(tài)學(xué)特征

研究發(fā)現(xiàn)，ATO 引發(fā)的氧化應(yīng)激會擾亂細胞內(nèi)蛋白折疊，錯誤折疊蛋白累積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白質(zhì)降解等以恢復(fù)細胞穩(wěn)態(tài)。持續(xù)或過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可促進ROS 生成，引發(fā)惡性循環(huán)并導(dǎo)致細胞凋亡[18]。ATO 可破壞線粒體膜的通透性，釋放細胞色素C 并與APAF1、半胱氨酸蛋白酶9（CASP9）結(jié)合形成凋亡小體，招募并活化CASP3/6/7 等，對胞內(nèi)蛋白進行高效切割，誘導(dǎo)細胞以CASP 依賴的方式凋亡[19]。此外，ATO 能顯著增加BCL-2 家族中促凋亡蛋白（如BAX、BAK）的表達及其向線粒體的轉(zhuǎn)運[20]。ATO 誘導(dǎo)的ROS 還能直接開啟線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔，導(dǎo)致凋亡誘導(dǎo)因子的釋放及入核，誘導(dǎo)核固縮及染色質(zhì)碎片化，觸發(fā)非CASP 依賴的凋亡[21]。

自噬是細胞在外界不良刺激下維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機制。自噬溶酶體可降解自身蛋白或受損細胞器，以便循環(huán)使用代謝產(chǎn)物。研究表明，ATO 可增強自噬相關(guān)蛋白LC3A/B、Beclin1 的表達，激活JNK、p38-AMPK 通路，并抑制PI3K/Akt-mTOR 通路，從而引發(fā)自噬。ATO 聯(lián)合卡莫司汀可以提高ROS/GSH比例，誘導(dǎo)實體瘤細胞發(fā)生自噬性死亡[22]。ATO 處理人成骨肉瘤細胞，可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子TFEB 在Ser142 位點去磷酸化并入核，繼而促進自噬溶酶體必需蛋白的表達，加速自噬性死亡[6]。自噬對腫瘤進展的影響具有雙面性，一方面，自噬可緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與氧化應(yīng)激，減少DNA 損傷和基因突變，限制細胞的癌變及快速增殖，阻礙腫瘤的早期發(fā)生；另一方面，自噬可幫助癌細胞適應(yīng)惡劣的腫瘤微環(huán)境，促進其存活和進展。而在腫瘤治療過程中，自噬一方面有助于癌細胞產(chǎn)生藥物抵抗，另一方面也能參與誘導(dǎo)自噬樣細胞死亡（由自噬分子機制驅(qū)動的非凋亡、非壞死的細胞死亡形式）。

焦亡是一種程序性的細胞炎性壞死，依賴于CASP1/4/5/11、顆粒酶等的活化，以及其對Gasdermin（GSDM）蛋白家族分子的切割。GSDM 的N 端結(jié)構(gòu)域能在細胞膜上寡聚成孔，引發(fā)細胞裂解性死亡并促進白介素-1 細胞因子家族成員的成熟與釋放。無機砷可誘導(dǎo)β 細胞焦亡和炎癥小體的活化[2]，而ATO 處理膠質(zhì)瘤細胞U251 后能激活CASP3 和GSDME 依賴的焦亡和乳酸脫氫酶的釋放[3]。

鐵死亡是一種依賴于二價鐵離子、由酯氧合酶介導(dǎo)的新型細胞死亡形式。ROS 等自由基在胞內(nèi)聚集、以谷胱甘肽過氧化物酶GPX4 為核心的抗氧化系統(tǒng)的耗竭，最終可導(dǎo)致脂膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，并造成細胞膜破裂。ATO 可誘導(dǎo)大量ROS 生成，提示ATO 可能和鐵死亡密切相關(guān)。最新研究證實，無機砷可誘導(dǎo)胰島細胞MIN6 發(fā)生鐵死亡，且該過程可以被鐵死亡小分子抑制劑ferropstatin-1阻斷[4]。

程序性壞死是一種受絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶RIPK1 和RIPK3 精密控制的、CASP 非依賴性的細胞死亡。由RIPK1 和RIPK3 形成的壞死小體可導(dǎo)致MLKL 的寡聚化和磷酸化，最終產(chǎn)生細胞膜損傷、胞質(zhì)腫脹、細胞器膨大、釋放細胞內(nèi)容物并引發(fā)炎癥反應(yīng)。目前尚缺乏ATO 能誘導(dǎo)細胞程序性壞死的直接報道，但有研究表明，ROS 能通過直接氧化RIPK1上的三個關(guān)鍵半胱氨酸，增強其自身磷酸化，促進程序性壞死的發(fā)生[5]。

在不同的細胞死亡命運的調(diào)控中，CASP8 或許是關(guān)鍵的分子開關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，抑制CASP8 可導(dǎo)致TNFα 誘導(dǎo)的細胞死亡由凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)槌绦蛐詨乃?。程序性壞死途徑受阻時，喪失酶活性的CASP8 可充當(dāng)?shù)鞍字Ъ?，促進炎性小體復(fù)合物形成并導(dǎo)致細胞焦亡[23]，而自噬導(dǎo)致的CASP8 降解能促使凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)槌绦蛐詨乃繹24]。值得注意的是，本研究組前期研究提示，不同的細胞死亡形式可同時存在于腫瘤組織中。可能原因為：腫瘤組織的細胞構(gòu)成復(fù)雜（腫瘤細胞、基質(zhì)細胞、多種免疫細胞）；腫瘤細胞克隆存在高度的異質(zhì)性；組織內(nèi)不同區(qū)域的微環(huán)境有差異；細胞死亡逐漸進行而并非同步發(fā)生。此外，就單個細胞而言，不同的細胞死亡途徑能否同時或先后激活，不同細胞死亡途徑的關(guān)鍵執(zhí)行分子能否借助相分離等機制富集在細胞內(nèi)不同區(qū)域，值得細致觀察、深入探索。

3 砷劑誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生免疫原性細胞死亡

細胞應(yīng)激及死亡可打破組織局部穩(wěn)態(tài)，引發(fā)免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)。細胞死亡如何被免疫系統(tǒng)有效感知，不同細胞死亡形式引發(fā)免疫應(yīng)答的類型是否相同，均是值得深入探索的問題。傳統(tǒng)觀點認為凋亡可誘導(dǎo)免疫耐受，盡管具體機制尚不夠明確，但凋亡過程中CASP3/6/7 的激活可以下調(diào)固有免疫應(yīng)答的多個關(guān)鍵調(diào)控因子（如cGAS、MAVS、IRF3 等）[25]。細胞壞死過程中伴隨著細胞內(nèi)容物的大量釋放，有學(xué)者認為這些物質(zhì)屬于細胞固有成分，而非誘導(dǎo)產(chǎn)生的“危險信號”，雖然能誘導(dǎo)強烈的炎癥反應(yīng)，但并不一定能激活抗腫瘤免疫應(yīng)答[26]。腫瘤細胞的“免疫原性”是指癌細胞被免疫系統(tǒng)識別和清除的特性，由“抗原性”及“佐劑原性”共同決定。瀕死的腫瘤細胞能釋放腫瘤抗原，并釋放或暴露多種損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），包括鈣網(wǎng)蛋白（CALR）、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、腺苷三磷酸（ATP）、I 型干擾素（IFNα/β）、膜聯(lián)蛋白A1（ANXA1）等。上述“危險信號”分子可調(diào)控抗腫瘤免疫應(yīng)答，也成為公認的免疫原性細胞死亡的生物標(biāo)志物[7]。圖2 顯示ATO 用于治療型疫苗制備的策略：ATO 介導(dǎo)的癌細胞死亡不僅暴露腫瘤抗原，同時能釋放一系列“危險信號”分子（如ATP、CALR、F-actin、IFNα/β、HMGB1、AnexA1），這些信號分子能與單核細胞、髓系樹突狀細胞（DC）細胞上的相關(guān)受體結(jié)合，促進抗原吞噬和提呈，并激活T 細胞，最終抑制腫瘤生長。

圖2 ATO 用于治療型疫苗制備的策略

該領(lǐng)域研究的關(guān)鍵科學(xué)問題包括：不同細胞死亡形式對腫瘤細胞“免疫原性”的影響、對上述“危險信號”分子釋放的調(diào)控機制。多項研究表明，凋亡并非意味著免疫耐受，蒽環(huán)類藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡可促進CALR 和磷脂酰絲氨酸暴露于胞膜表面，增強其抗原的攝取和提呈，提升其免疫原性。借助泛CASP 抑制劑Z-VAD-fmk 不可逆地阻斷細胞凋亡，雖然不影響腫瘤細胞的死亡，但其免疫原性顯著下降[27]。瀕死細胞釋放ATP 依賴于凋亡和自噬通路，多種CASP 分子、自噬相關(guān)基因（autophagy related genes，ATG）都參與了這一過程。ATG5 和ATG7 缺陷型腫瘤細胞的自噬通路受阻，ATP 釋放量顯著減少，化療效果大幅降低[28]。ATP 的膜外釋放也受到CASP 蛋白的調(diào)控，CASP3 可切割縫隙連接蛋白家族成員PANX1，后者活化后形成跨膜通道并導(dǎo)致ATP 的釋放，而ZVAD-fmk 可以有效阻止該過程[28]。程序性壞死通路的活化有助于ATP 和HMGB1 的釋放，從而增強腫瘤細胞的免疫原性。RIPK3 或MLKL 缺陷型腫瘤對化療不敏感，借助三磷酸腺苷雙磷酸酶抑制劑提高組織內(nèi)ATP 濃度，聯(lián)合使用TLR4 激動劑能顯著增強上述缺陷型腫瘤細胞的化療效果[29]。目前，尚不明確鐵死亡是否參與調(diào)控腫瘤細胞的免疫原性，特別是“危險信號”分子的釋放和暴露，有文獻提示HMGB1 可能是鐵死亡相關(guān)的DAMPs[30]。

4 砷劑對免疫細胞的直接作用

除了誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡，砷劑可直接作用于免疫細胞，引發(fā)免疫功能障礙。砷劑可改變免疫細胞DNA 甲基化水平，導(dǎo)致基因表達譜重編程，影響細胞的脂質(zhì)代謝、pH 調(diào)節(jié)、NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[31]。低濃度的ATO 能誘導(dǎo)單核細胞壞死，減少DC 的產(chǎn)生，降低DC 的吞噬、抗原提呈和細胞因子分泌功能[32]。巨噬細胞是參與抗原呈遞和清除非己成分的專職吞噬細胞。體外實驗提示，ATO 可嚴重阻礙單核細胞向巨噬細胞分化，并通過NF-κB 途徑抑制巨噬細胞的黏附能力和吞噬活性[33]。砷的積累還能抑制淋巴細胞增殖、遷移和活化，誘導(dǎo)T 細胞凋亡，并通過增加氧化應(yīng)激和減少IL-2 的分泌來抑制T 細胞活性，這也是慢性砷中毒導(dǎo)致鮑文病的主要原因[34]。ATO 對免疫細胞的抑制效應(yīng)也被運用于治療自身免疫疾病，如改善骨髓移植造成的排斥反應(yīng)和緩解系統(tǒng)性紅斑狼瘡[35-36]。值得注意的是，ATO 在某些情況下還可以作為佐劑增強免疫應(yīng)答。ATO 能增強自然殺傷細胞（NK）對APL 的殺傷活性[37]。低劑量的ATO 能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和亞硝化應(yīng)激，選擇性地清除調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg），增強效應(yīng)T 細胞對結(jié)腸癌和乳腺癌的殺傷活性[38]。骨髓來源的抑制性細胞（MDSC）對建立及維持免疫耐受、免疫抑制至關(guān)重要，ATO 可誘導(dǎo)MDSC 凋亡或促進其分化，該發(fā)現(xiàn)有助于拓展探索ATO 臨床應(yīng)用的新可能[39]。

5 結(jié)語與展望

傳統(tǒng)的砷劑治療主要通過靜脈滴注的方式，雖然有部分口服制劑被批準用于臨床治療，但目前應(yīng)用較少。雖然砷劑在體外實驗中具有廣譜的抗癌活性，然而其應(yīng)用于實體腫瘤的臨床治療進展有限，僅在原發(fā)性晚期肝癌治療中顯示出一定效果。究其原因，主要有如下幾點：1）ATO 是水溶性化合物，容易全身擴散，難以富集至腫瘤病灶部位。由于肝臟是重要的解毒器官，ATO 相對富集，局部濃度相對較高，更易誘導(dǎo)肝癌細胞死亡；2）ATO 的全身擴散容易導(dǎo)致免疫細胞死亡，引發(fā)系統(tǒng)性免疫抑制；3）由于ATO 具有較強的不良反應(yīng)，體內(nèi)用藥的劑量受限，難以達到有效殺傷腫瘤細胞的濃度；4）由于ATO 的高水溶性，納米載體材料包裹ATO 并靶向遞送的策略雖然有應(yīng)用前景，但嚴重受限于低下的藥物包封率。因此，探索砷劑治療實體瘤的新策略有望帶來重要臨床突破。

部分化療藥物預(yù)處理的腫瘤細胞能用作預(yù)防型疫苗，接種至小鼠皮下可有效抑制腫瘤的再活化。對于腫瘤患者而言，治療型疫苗的應(yīng)用前景遠大于預(yù)防型疫苗。本團隊新開展的預(yù)實驗提示，實體瘤細胞在ATO 處理后能出現(xiàn)多種細胞應(yīng)激反應(yīng)和死亡方式，可釋放多種“危險信號”分子，具備增強腫瘤細胞免疫原性的潛力。因此，借助ATO 在體外預(yù)處理自體來源的腫瘤細胞，可制備治療型全細胞腫瘤疫苗。該策略具有如下優(yōu)勢：可有效避免藥物在體內(nèi)的不良反應(yīng)；可廣泛覆蓋腫瘤細胞表達的多種抗原；可選擇最佳治療窗口多次注射；可根據(jù)特定腫瘤類型優(yōu)化藥物濃度和處理時間等條件，最大限度地誘導(dǎo)免疫原性細胞死亡，通過激活持久的抗腫瘤免疫降低腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

上述治療型疫苗可與其它多種治療策略聯(lián)用，旨在實現(xiàn)協(xié)同抗癌效應(yīng)。近些年來，基于免疫檢查點阻斷的免疫療法取得了巨大的突破，但治療應(yīng)答率亟需提升，新型不良反應(yīng)的發(fā)生也帶來新的挑戰(zhàn)。腫瘤微環(huán)境中缺乏T 淋巴細胞浸潤，也稱為“冷腫瘤”，是導(dǎo)致PD-1 單抗療效不佳的原因之一，而聯(lián)合使用周期素依賴性激酶抑制劑（如dinaciclib）誘導(dǎo)免疫原性死亡，激活DC 并增加T 細胞浸潤有望顯著提升PD-1單抗的療效[40]。基于ATO 的治療型全細胞腫瘤疫苗與免疫檢查點阻斷聯(lián)用，是否能發(fā)揮1+1＞2 的效果值得嘗試和探索，該策略對晚期腫瘤患者的臨床獲益，很有可能大于化療。