分散固相萃取-氣相色譜法測(cè)定雞蛋中氟蟲腈及其代謝物

郝莉花,賈利平

1(河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院,河南 鄭州,450047) 2(河南省食品安全數(shù)據(jù)智能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州,450047)

氟蟲腈是一種高活性的苯基吡唑類殺蟲劑[1]。氟蟲腈在雞蛋中殘留可能的原因主要是在家禽飼養(yǎng)過程中,飼養(yǎng)人員違規(guī)使用了氟蟲腈來防治跳蚤、虱子等有害生物[2],或使用了受氟蟲腈污染的飼料,導(dǎo)致氟蟲腈通過母體遷移并蓄積在雞蛋中。

氟蟲腈是目前水稻上使用的主要?dú)⑾x劑之一,具有良好的殺蟲效果。但該農(nóng)藥及其代謝物在水和土壤中降解緩慢[3-4],對(duì)水生生物、家蠶、蜜蜂等都具有較強(qiáng)的毒性,對(duì)生態(tài)環(huán)境造成一定的影響。動(dòng)物研究表明,氟蟲腈在生殖發(fā)育毒性、慢性毒性、神經(jīng)毒性和致癌性實(shí)驗(yàn)方面均有一定的不良作用[5]。各國陸續(xù)限制其使用,并規(guī)定了氟蟲腈在食品中的最大殘留量[6-7],其中歐盟規(guī)定氟蟲腈和氟蟲腈砜總計(jì)的最大殘留限量值僅為0.005 mg/kg[8]；國際食品法典委員會(huì)(Codex Alimentarius Commission,CAC)規(guī)定禽蛋中氟蟲腈的最大殘留限量值為0.02 mg/kg,禽肉中則為0.01 mg/kg[8]。2009年我國農(nóng)業(yè)部公告第1157號(hào)[9]規(guī)定自2009年10月1日起,除衛(wèi)生用殺蟲劑、玉米等部分旱田種子包衣劑外,在我國境內(nèi)停止銷售和使用用于其他方面的含氟蟲腈成分的農(nóng)藥制劑。GB 2763—2021[10]《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定：氟蟲腈在玉米及鮮食玉米中最大殘留量不得超過0.1 mg/kg,在谷物、油料和油脂、蔬菜、水果、糖類和食用菌中最大殘留限量不得超過0.02 mg/kg；但對(duì)雞蛋中氟蟲腈最大殘留限量沒有規(guī)定。

2017年7月，比利時(shí)食品安全監(jiān)管部門在雞蛋中檢出氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物，成為第一個(gè)向歐盟食品安全警戒系統(tǒng)通報(bào)“毒雞蛋”事件的歐洲國家。同年8月，荷蘭、德國等歐洲16國及韓國等地更是爆出大規(guī)模氟蟲腈污染雞蛋的食品安全事件，造成惡劣影響。自此，有關(guān)雞蛋中氟蟲腈再次引起人們的高度關(guān)注。GB 2763—2021[11]《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定了氟蟲腈在蛋類中的最大殘留量殘留限量為 0.02 mg/kg，標(biāo)志殘留物為氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈亞砜和氟蟲腈砜。指定檢驗(yàn)方法為GB 23200.115—2018[12]《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》，因其使用的儀器為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，對(duì)儀器設(shè)備的要求比較高，不利于方法在基層檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的廣泛推廣。近年來，關(guān)于雞蛋中的氟蟲腈的方法研究，大多采用質(zhì)譜分析上，如采用氣相色譜-質(zhì)譜法[13-14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-16]，對(duì)于采用成本較低的氣相色譜儀的研究較少。

在前處理方法上，由于雞蛋基質(zhì)本身成分復(fù)雜，含有多種雜質(zhì)而不能直接檢測(cè)氟蟲腈及其代謝物[17-18]，QuEChERS凈化具有快速(Quick)、簡(jiǎn)單(Easy)、廉價(jià)(Cheap)、有效(Effective)、可靠(Rugged)及安全(Safe)的優(yōu)點(diǎn)，是目前大部分農(nóng)獸藥殘留量常用的前處理方法之一[19]，該法可較好地應(yīng)用于零脂肪或低脂肪樣品(如：牛奶、雞蛋、蔬菜和水果等)的農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)。

本研究通過對(duì)分散固相萃取凈化材料及其配比的優(yōu)化，采用氣相色譜法檢測(cè)，以期得到一種有效降低或消除雞蛋中蛋白、脂肪等基質(zhì)干擾，并具有分析速度快、檢測(cè)成本較低、對(duì)儀器要求較低等優(yōu)勢(shì)的雞蛋中氟蟲腈及其代謝物測(cè)定的方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜儀(配有ECD檢測(cè)器)、HP-5色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),安捷倫科技有限公司；FA2004 N電子天平,上海箐海儀器有限公司；B-400均質(zhì)機(jī),瑞士步琪有限公司；QL-866渦旋混合器,Vortex Mixer公司。

1.2 試劑與材料

氟蟲腈標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度均≥99%),德國Dr·Ehrenstorfer公司；乙腈(色譜純),德國Merck公司；氯化鈉、無水硫酸鈉(分析純),天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

雞蛋：市售。

1.3 儀器參數(shù)

HP-5色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,Agilent,美國)；進(jìn)樣口溫度280 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；升溫程序：初始溫度60 ℃,保持2 min,以10 ℃/min升溫至240 ℃,保持2 min；進(jìn)樣量1 μL；載氣：氮?dú)猓惠d氣流速1 mL/min(恒流)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液

取100 mg/L的氟甲腈、氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液,用乙腈做溶劑配制成質(zhì)量濃度均為10 mg/L的氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈、氟蟲腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,儲(chǔ)存于-18 ℃冰箱待用。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)使用溶液

分別準(zhǔn)確吸取氟甲腈、氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液50、100、200、500、800 μL以及1、2 mL至100 mL容量瓶中,用溶劑定容,配制成質(zhì)量濃度0.005、0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.2 g/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5 樣品制備與前處理

1.5.1 樣品制備

空白樣品：取獸殘陰性樣品雞蛋約1 000 g,洗凈去殼,用組織均漿機(jī)充分?jǐn)嚢杈鶆?置于聚乙烯瓶中備用。

0.5 mg/kg加標(biāo)樣品：稱取空白樣品100 g,準(zhǔn)確加入1.4.1中配制的10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5 mL,均質(zhì),配制成0.5 mg/kg的加標(biāo)樣品。

1.5.2 樣品前處理

方法1(不凈化)：稱取2 g樣品于50 mL離心管中,加入10 mL乙腈,加入2 g NaCl,渦旋振蕩1 min,在6 000 r/min條件下離心5 min,上清液過0.22 μm有機(jī)膜,待測(cè)。

方法2(Prime HLB凈化)：稱取2 g均質(zhì)樣品于50 mL離心管中,加入8 mL含0.2%甲酸的80∶20(mL∶mL)乙腈/水溶液,渦旋振蕩2 min,超聲10 min,在12 000 r/min條件下冷凍離心5 min,取3 mL上清液過Prime HLB柱子,然后收集1 mL濾液過0.22 μm有機(jī)膜,待測(cè)。

方法3(QuEChERS凈化)：稱取2 g均質(zhì)樣品于50 mL離心管中,加入10 mL乙腈,渦旋振蕩2 min,超聲10 min,再加入2 g NaCl,6 g Na2SO4,渦旋振蕩1 min,在6 000 r/min條件下離心3 min,取1 mL上清液在2 mL離心管中,并加入50 mg的乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(ethylenediamine-N-propylsilylated silica gel，PSA),50 mg的C18,150 mg的MgSO4,渦旋振蕩1 min,6 000 r/min條件下離心3 min,上清液過0.22 μm有機(jī)膜,待測(cè)。

方法4(HLB凈化)：稱取2 g均質(zhì)樣品于50 mL離心管中,加入10 mL(0.1 mL/L)的EDTA-MCLLVAINE緩沖液,渦旋振蕩2 min,超聲10 min,在10 000 r/min條件下冷凍離心5 min,取上清液備用,再加入10 mL(0.1 mL/L)的EDTA-MCLLVAINE緩沖液,渦旋振蕩2 min,超聲10 min,在10 000 r/min條件下冷凍離心5 min,合并2次提取液,取2 mL提取液過HLB柱子(預(yù)先用6 mL甲醇6 mL水活化),然后加入2 mL的5%甲醇淋洗液淋洗,2 mL甲醇溶液洗脫,氮吹吹干后用乙腈定容到1 mL,過0.22 μm有機(jī)膜,待測(cè)。

1.6 基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算

方法基質(zhì)效應(yīng)按照公式(1)[20]計(jì)算：

(1)

式中：ME,前處理過程總基質(zhì)效應(yīng),%；SA,目標(biāo)化合物在純?nèi)軇┗|(zhì)中檢測(cè)的峰面積；SB,目標(biāo)化合物經(jīng)過前處理后處理液基質(zhì)中檢測(cè)的峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱選擇

目前,在國內(nèi)市場(chǎng)上銷售的商品GC毛細(xì)管色譜柱的生產(chǎn)廠家主要有安捷倫公司(Agilent)、奧泰公司(Alltech)、瑞斯泰克公司(Restek)、SGE公司、薩帕克公司(Supelco)等。在這些廠家生產(chǎn)的毛細(xì)管色譜柱中以含5%苯基和95%二甲基聚硅氧烷固定相的中等極性色譜柱(HP-5、HP-5MS、DB-5、DB-5MS等)較為常見,其次是100%二甲基聚硅氧烷的固定相的弱極性色譜柱(HP-1、HP-1MS、DB-1、DB-1MS、Rtx-1MS等)和聚乙二醇固定相的極性色譜柱,這些色譜柱的尺寸多為標(biāo)準(zhǔn)型(30 m×0.25 mm×0.25 μm)[27-28]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)氟蟲腈的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)選取實(shí)驗(yàn)室常用的4種色譜柱,即HP-5、DB-5、DB-1701、DB-1進(jìn)行上機(jī)測(cè)定實(shí)驗(yàn),進(jìn)樣質(zhì)量濃度為0.000 5 μg/mL的氟蟲腈工作液,通過比較氟蟲腈色譜峰對(duì)稱因子、信噪比和保留時(shí)間確定最佳色譜柱,結(jié)果詳見表1。

表1 氟蟲腈色譜峰參數(shù)Table 1 Chromatographic peak parameters of fipronil

由表1可知,HP-5的對(duì)稱因子為0.88,說明氟蟲腈標(biāo)準(zhǔn)品在色譜柱HP-5的峰形較其他3種色譜柱好,其信噪比為7,儀器檢出限為0.000 2 μg/mL,說明氟蟲腈標(biāo)準(zhǔn)品在色譜柱HP-5上通量高,能夠獲得最低的檢出限；在相同進(jìn)樣濃度條件下,氟蟲腈在HP-5上有較長(zhǎng)的保留時(shí)間,可降低低沸點(diǎn)雜質(zhì)的干擾。綜上分析,本實(shí)驗(yàn)采用HP-5彈性石英柱。

配制0.2 μg/mL氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈和氟蟲腈砜標(biāo)準(zhǔn)品,采用HP-5彈性石英柱分離檢測(cè),4種化合物在色譜柱上基線分離,出峰效果好,色譜圖見圖1。

圖1 氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈和氟蟲腈砜色譜圖Fig.1 Chromatograms of fluorocarbonitrile,fipronil sulfoxide,fipronil and fipronil sulfone

2.2 凈化方式選擇

有關(guān)凈化方式已有較多的文獻(xiàn)研究[21]。本研究比較QuEChERS凈化、Prime HLB固相萃取柱凈化和HLB固相萃取柱凈化方式,以確定一種更合適的凈化方式。稱取1.5.1中0.5 mg/kg加標(biāo)樣品,按照1.5.2所述4種方法處理,經(jīng)1.3條件檢測(cè),數(shù)據(jù)按照1.6分析,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次,以平均值計(jì),結(jié)果見表2。

表2 三種凈化方法的總基質(zhì)效應(yīng) 單位：%

由表2可以看出,未凈化的基質(zhì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)顯著,4種化合物ME為68.0%～92.3%,發(fā)生了“基質(zhì)誘導(dǎo)色譜響應(yīng)減弱現(xiàn)象”[29]。經(jīng)過凈化后ME升高并接近100%,Prime HLB凈化后ME為82.8%～120.1%,平均值102.8%,差值37.3%,QuEChERS凈化后ME為76.6%～111.9%,平均值94.1%,差值35.3%,HLB凈化后ME為102.2%～143.5%,平均值125.0%,差值41.3%。QuEChERS凈化后4種化合物ME差值最小,結(jié)果集中,平均值94.1%,接近100%。此外,QuEChERS操作步驟簡(jiǎn)單,容易獲得較高回收率和較好重現(xiàn)性,因此本研究采用QuEChERS凈化方法。

2.3 線性范圍、檢出限

本研究在優(yōu)化氣相色譜條件下,能較好地分離樣品中的氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈和氟蟲腈砜。采用HP-5色譜柱分離,QuEChERS凈化,外標(biāo)法定量。結(jié)果表明,氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈和氟蟲腈砜分別在線性范圍0.005～0.2 μg/mL內(nèi),回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2均>0.999,線性較好。4種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖2。

a-氟甲腈;b-氟蟲腈亞砜;c-氟蟲腈;d-氟蟲腈砜圖2 四種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curves of four compounds

以氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈和氟蟲腈砜呈陰性的雞蛋為樣品在定量限、標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),即樣品加標(biāo)濃度0.025、0.4、1.0水平下進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度測(cè)試,每個(gè)水平平行實(shí)驗(yàn)6次(n=6),準(zhǔn)確度以回收率表示,精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)表示。

表3 三種加標(biāo)濃度下氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈和氟蟲腈砜的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations of fluorocarbonitrile,fipronil sulfoxide,fipronil and fipronil sulfone at the three spiked concentrations

從表3中可知,氟甲腈加標(biāo)回收率為88.8%～99.3%,RSD在1.22%～4.04%,氟蟲腈亞砜加標(biāo)回收率為96.8%～104.7%,RSD在0.86%～4.71%,氟蟲腈加標(biāo)回收率為91.5%～115.1%,RSD在3.09%～5.22%,氟蟲腈砜加標(biāo)回收率為100.1%～106.1%,RSD在0.93%～2.04%,氟蟲腈及其代謝物的總加標(biāo)回收率為88.8%～115.1%,RSD在0.86%～5.22%。本研究采用的方法其精密度和準(zhǔn)確度滿足雞蛋中氟蟲腈及代謝物殘留檢測(cè)的要求。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)3種常見的凈化方式進(jìn)行對(duì)比選擇后,采用氣相色譜法檢測(cè),試樣經(jīng)QuEChERS凈化,有效降低或消除雞蛋中蛋白質(zhì)、脂肪等基質(zhì)干擾,采用該方法4種氟蟲腈及其代謝物的檢出限均為0.01 mg/kg,平均回收率為88.8%～115.1%,RSD為0.86%～5.22%。與其他方法相比,該研究具有操作簡(jiǎn)單、分析速度快、經(jīng)濟(jì)成本低等優(yōu)勢(shì),可應(yīng)用于雞蛋中氟蟲腈的檢測(cè)分析,并適合廣泛推廣。