蠟狀芽胞桿菌促進(jìn)紅球菌發(fā)酵產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶

郭依依,吳崢,馬天穎,蔡俊*

1(發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北工業(yè)大學(xué)),湖北 武漢,430068) 2(工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北工業(yè)大學(xué)),湖北 武漢,430068)

甲殼素(C8H13O5N)n,又稱幾丁質(zhì),是存在于各類甲殼動(dòng)物的外殼及真菌細(xì)胞壁中的一種難溶的N-乙酰-D-葡萄糖胺聚合物。甲殼素脫乙酰率達(dá)到55%及以上即為殼聚糖,殼聚糖廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、漁業(yè)、醫(yī)療產(chǎn)業(yè)等領(lǐng)域,尤其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,由于其良好的生物相容性,在組織工程、創(chuàng)傷愈合、生物傳感器上有很好的應(yīng)用前景[1-3]。

甲殼素脫乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)是專一性的用于甲殼素脫去乙酰基的酶,它可代替現(xiàn)有的濃堿熱解法,生產(chǎn)出化學(xué)法無法得到的某些高質(zhì)量的殼聚糖[4-5]。紅球菌屬(Rhodococcus)是一類呈短桿狀、不產(chǎn)孢子、革蘭氏染色呈陽(yáng)性的細(xì)菌,可由甲殼素誘導(dǎo)產(chǎn)CDA[6-7]。但研究發(fā)現(xiàn),由于天然大分子甲殼素水溶性低,暴露的乙?；鶊F(tuán)過少,導(dǎo)致紅球菌無法高效利用天然大分子甲殼素,從而造成酶活力低,應(yīng)用價(jià)值不高[1-2,7-9]。本文作者發(fā)現(xiàn),將蠟狀芽胞桿菌與紅球菌混合培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)基中的膠體甲殼素降解速度明顯增快,對(duì)發(fā)酵液的脫乙酰酶活力測(cè)定結(jié)果顯示,酶活力得到了極大的提高。本文將2株菌進(jìn)行混合發(fā)酵,以單菌發(fā)酵為對(duì)比,同時(shí)監(jiān)測(cè)甲殼素酶和CDA的酶活力變化,并對(duì)兩菌的混合時(shí)間、接種量配比及發(fā)酵條件等單因素進(jìn)行優(yōu)化,并進(jìn)一步設(shè)計(jì)Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)、中心組合設(shè)計(jì)(central composite design,CCD)實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定適宜兩菌株協(xié)同發(fā)酵的培養(yǎng)基中各成分的水平,為工業(yè)化生產(chǎn)CDA提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種及培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)菌株：RhodococcusHQcdag從潛江市蝦池土壤中篩選得到,并經(jīng)16S rRNA鑒定;BacilluscereusCJPE209為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

活化培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10,牛肉膏3,NaCl 5,瓊脂 20,pH 6.6。

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10,牛肉膏3,NaCl 5,瓊脂 20,pH 6.6。

富集培養(yǎng)基(g/L)：膠體甲殼素5,NaCl 8,K2HPO40.5,KH2PO41,MgSO40.5,pH 6.8。

篩選培養(yǎng)基(g/L)：膠體甲殼素5,NaCl 8,K2HPO40.5,KH2PO41,MgSO40.5,對(duì)硝基乙酰苯胺0.2,瓊脂20,pH 7。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：膠體甲殼素5,酪蛋白2,酵母浸粉2,NaCl 8,K2HPO40.5,KH2PO41,MgSO40.5,pH 6.8。

優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨2.5,K2HPO40.6,MgSO41.5,酵母浸粉3.0,NaCl 8.5,KH2PO40.8,膠體甲殼素8.0。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料

甲殼素,上海源葉生物有限公司；對(duì)硝基乙酰苯胺,上海麥克林生化科技有限公司；膠體甲殼素,自制。

1.1.3 儀器與設(shè)備

FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī),天津市泰斯特儀器有限公司；YXQ-LS—75211型立式壓力蒸汽滅菌器,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HH-S型水浴鍋,鞏義市矛華儀器有限公司；ZSD-1270型全自動(dòng)生化培養(yǎng)箱,上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；TG16-II,高速離心機(jī)長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；SYNERGY2酶標(biāo)儀,Gene Company Limited；ZHWY系列雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器,中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雙菌株協(xié)同作用驗(yàn)證

將蠟狀芽胞桿菌和紅球菌37 ℃分別培養(yǎng)24 h制備種子液,將其單獨(dú)和按活菌數(shù)1∶1接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min發(fā)酵36 h,同時(shí)監(jiān)測(cè)CDA酶和甲殼素酶的酶活力變化,采用變色圈法[9-10]測(cè)定CDA的酶活力,甲殼素酶活力用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法測(cè)定[11]。

1.2.2 雙菌株協(xié)同發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.2.1 菌種活化

分別測(cè)定兩菌株的生長(zhǎng)曲線,確定其最佳的混合接種時(shí)間。

1.2.2.2 種子液的配比優(yōu)化

根據(jù)測(cè)定的兩菌株的生長(zhǎng)曲線,取兩菌株的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期用血球計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù),然后按一定數(shù)量比例(10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10)換算成體積比同時(shí)接入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵。以對(duì)硝基乙酰苯胺為底物,用分光光度法測(cè)定酶活力。

1.2.2.3 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

發(fā)酵條件優(yōu)化：由上述實(shí)驗(yàn)所得種子液最佳配比,在其他條件不變的前提下,依次改變發(fā)酵周期、發(fā)酵溫度、發(fā)酵轉(zhuǎn)速、裝液量、接種量5因素的水平,用分光光度法測(cè)定酶活力,確定促進(jìn)產(chǎn)酶的最適條件。

發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化：由上述實(shí)驗(yàn)所得最佳發(fā)酵條件,在其他條件不變的前提下,依次改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源、無機(jī)鹽等,確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組分。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,將上述所得發(fā)酵培養(yǎng)基組分根據(jù)PB設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn),篩選出影響酶活力的顯著性因子[7,12-14],實(shí)驗(yàn)的因素水平如表1所示,CDA的酶活力(Y)作為響應(yīng)值。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平 單位：g/L

1.2.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于PB實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,根據(jù)CCD中心組合設(shè)計(jì)原理,以酵母浸粉(X2),NaCl(X3),KH2PO4(X5),膠體甲殼素(X7)4個(gè)因素為自變量,以酶活力為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)4因素5水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),因素水平如表2所示[7,12-14]。

表2 CCD設(shè)計(jì)試驗(yàn)的因素與水平 單位：g/L

1.2.2.5 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次,采用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行PB實(shí)驗(yàn)、CCD實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙菌株協(xié)同發(fā)酵效果驗(yàn)證

由圖1可知,蠟狀芽胞桿菌單獨(dú)發(fā)酵時(shí)只產(chǎn)甲殼素酶,紅球菌單獨(dú)發(fā)酵只產(chǎn)CDA,但酶活力并不太高。兩菌混合發(fā)酵時(shí)CDA的活力在24 h時(shí)最高,比紅球菌單獨(dú)發(fā)酵提前了約12 h,且最高點(diǎn)約為其單獨(dú)發(fā)酵的10倍。此外,混合發(fā)酵時(shí)甲殼素酶的活力與桿菌單獨(dú)發(fā)酵相比也有所提高。可見,甲殼素酶和CDA共同作用,不僅提高了底物膠體甲殼素的降解速率和效果,還對(duì)各自酶的產(chǎn)生有促進(jìn)作用。

圖1 菌株B.cereus、Rhodococcus和兩菌混合發(fā)酵過程中甲殼素酶和甲殼素脫乙酰酶酶活力的變化Fig.1 Effects of culture time on activity of chitin deacetylase and chitinase during B.cereus,Rhodococcus and co-fermentation

2.2 雙菌株協(xié)同發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 菌種活化

兩菌株活化后所測(cè)生長(zhǎng)曲線如圖2所示,由于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛,產(chǎn)酶活力強(qiáng)。因此選取皆處于兩菌株生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的第20 h的種子液,將兩菌按比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。

圖2 菌株B.cereus和Rhodococcus的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of strain B.cereus and Rhodococcus

2.2.2 種子液優(yōu)化

由圖3可知,蠟狀芽胞桿菌單獨(dú)發(fā)酵時(shí)CDA的酶活力為1.43 U,可忽略不計(jì)。紅球菌單獨(dú)發(fā)酵時(shí),CDA的酶活力為19.47 U,經(jīng)過混合發(fā)酵后,發(fā)酵液中的酶活力大幅提升。而當(dāng)配比為蠟狀芽胞桿菌∶紅球菌=2∶8時(shí),發(fā)酵液中的CDA的酶活力達(dá)到最高值,為226.27 U,然后隨著蠟狀芽孢桿菌比例的增加而逐漸降低。這意味著協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)酶的過程是以紅球菌為主導(dǎo),在此過程中借助蠟狀芽胞桿菌分泌的糖苷酶對(duì)底物甲殼素的糖鏈進(jìn)行水解,使其更易被紅球菌利用或其他方式使得酶活力大幅提升。而桿菌比重逐漸增大后,培養(yǎng)液的酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì),很可能是由于桿菌擠壓了球菌的生存空間導(dǎo)致。

圖3 菌株B.cereus和Rhodococcus的接種比例對(duì)酶活力的影響Fig.3 Effects of ratio of B/R on activity of chitin deacetylase

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化

發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果表明,促進(jìn)產(chǎn)酶的最佳單因素條件分別為發(fā)酵周期24 h,發(fā)酵溫度35 ℃,轉(zhuǎn)速160 r/min,裝液量50 mL/250 mL,接種量3%。發(fā)酵條件的交互影響較小,因此,在確定發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上,再對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3.2 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

PB實(shí)驗(yàn)的分析結(jié)果如表3所示,模型具有高度的顯著性,失擬項(xiàng)不顯著。其中酵母浸粉(X2)、NaCl(X3)、KH2PO4(X5)和膠體甲殼素(X7)的P值在5%水平上是顯著的,這說明酵母浸粉、NaCl、KH2PO4和膠體甲殼素是促進(jìn)CDA產(chǎn)生的顯著影響因素。

表3 PB設(shè)計(jì)試驗(yàn)的回歸分析Table 3 Regression analysis for the PB design

2.3.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表4 CCD設(shè)計(jì)試驗(yàn)與結(jié)果Table 4 Experiment design and results of CCD

表5 響應(yīng)面二次式模型的方差分析表Table 5 ANOVA table of response surface quadratic model

續(xù)表5

通過軟件對(duì)回歸方程中的X2X5、X2X7、X3X7、X5X7交互項(xiàng)繪制響應(yīng)面分析圖,結(jié)果如圖4所示。用方程預(yù)測(cè)的結(jié)果表明,酵母浸粉3.0 g/L、NaCl 8.5 g/L、KH2PO40.8 g/L、甲殼素8.0 g/L是CDA生產(chǎn)的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成,與表4中的運(yùn)行結(jié)果一致。

a-酵母浸粉和KH2PO4；b-酵母浸粉和膠體甲殼素；c-NaCl和膠體甲殼素；d-KH2PO4和膠體甲殼素圖4 不同因素的交互作用對(duì)混合菌株發(fā)酵產(chǎn)CDA的影響響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface contour plots of CDA production by complex bacteria optimization of variables

3 結(jié)論

本文發(fā)現(xiàn)了蠟狀芽孢桿菌和紅球菌混合發(fā)酵,可大幅提高CDA產(chǎn)量的現(xiàn)象,并測(cè)得兩菌株接種量最佳配比為2∶8,相比紅球菌單獨(dú)發(fā)酵酶活力提升了約12倍。對(duì)混合發(fā)酵產(chǎn)CDA的培養(yǎng)基條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,兩菌協(xié)同發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)組分為：蛋白胨0.25 g/L、K2HPO40.6 g/L、MgSO41.5 g/L、酵母浸粉3.0 g/L、NaCl 8.5 g/L、KH2PO40.8 g/L、膠體甲殼素8.0 g/L。優(yōu)化后菌株產(chǎn)CDA的活力約為優(yōu)化前的1.96倍。

天然甲殼素由于其高度延伸的氫鍵半晶結(jié)構(gòu)使其難以溶于一般的稀酸、稀堿及有機(jī)溶劑,在沒有經(jīng)過處理的情況下難以被CDA作用[2,15-18]。有文獻(xiàn)表明,在預(yù)先使用類似糖苷酶的多糖裂解單加氧酶氧化裂解甲殼素原纖維表面上的糖鏈后,其晶體內(nèi)部的乙?；┞冻鰜?大大加快了CDA后續(xù)的脫乙酰進(jìn)程[16,19-20]。根據(jù)文獻(xiàn)提示,蠟狀芽胞桿菌可產(chǎn)多種糖苷酶(如甲殼素酶),因此產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因很可能是由于蠟狀芽胞桿菌產(chǎn)生的甲殼素酶通過作用于糖鏈的糖苷鍵,使甲殼素分子鏈長(zhǎng)度減小并破壞其晶態(tài)結(jié)構(gòu),內(nèi)部乙?；┞稄亩妆籆DA作用的同時(shí)誘導(dǎo)紅球菌產(chǎn)生更多的CDA[1,15-17,21]。

作者已驗(yàn)證了蠟狀芽胞桿菌中甲殼素酶基因(CP028009.1)和紅球菌中甲殼素脫乙酰酶基因(MH244430.1)的存在。下一階段將通過對(duì)其及殼聚糖酶(CP029454.1)、甲殼二糖酶(CP001176.1)等甲殼素酶系基因的轉(zhuǎn)錄水平分析,來進(jìn)一步揭示雙菌株協(xié)同降解甲殼素,并促進(jìn)紅球菌產(chǎn)脫乙酰酶的機(jī)理。同時(shí)作者也在進(jìn)一步研究誘導(dǎo)紅球菌產(chǎn)脫乙酰酶的物質(zhì),實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),蠟狀芽胞桿菌單獨(dú)發(fā)酵滅菌后的培養(yǎng)液仍能誘導(dǎo)紅球菌產(chǎn)脫乙酰酶。因此下一階段將對(duì)該菌株發(fā)酵甲殼素的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和分離,并對(duì)紅球菌做產(chǎn)酶誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。但發(fā)酵液中成分復(fù)雜,要準(zhǔn)確的分析出發(fā)酵液中產(chǎn)酶誘導(dǎo)物的組分,對(duì)于其純化制備的精度和產(chǎn)量有著很高的要求。