MFGE8在缺血性腦損傷中表達(dá)及對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用

柳 正, 王朝暉, 周春亭,2

缺血性腦損傷(ischemic brain injury，IBI)是由于遠(yuǎn)端動(dòng)脈狹窄、腦血流下降及永久性腦梗死引發(fā)的突發(fā)神經(jīng)功能缺損疾病[1～4]。研究報(bào)道，小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的不同表型極化與IBI的病理性發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。在缺血性腦卒中和IBI后，腦內(nèi)皮質(zhì)和紋狀體中出現(xiàn)動(dòng)態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞的M1極化[6]。引起包括高表達(dá)促炎細(xì)胞因子，如TNF-α和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶等；相反，M2亞型的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在促進(jìn)腦修復(fù)過(guò)程中起重要作用，包括神經(jīng)發(fā)生、血管生成、軸突重塑及髓鞘再生等[5,7]。因此，闡明M1向M2亞型過(guò)渡的機(jī)制可能為腦卒中提供新的和有針對(duì)性的治療方法。

乳脂球-表皮生長(zhǎng)因子VIII(Milk Fat Globule-EGF Factor 8，MFGE8)是一種分泌型糖蛋白，具有調(diào)節(jié)凋亡性細(xì)胞吞噬和抗炎作用等[8～10]。MFGE8在腦缺血和腦外傷中已顯示出有益作用[11,12]。MFGE8具有調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M2型巨噬細(xì)胞極化的作用[13]。因此，本研究擬分析:(1)MFGE8蛋白在IBI和MCAO模型大鼠外周血中的表達(dá)變化；(2)持續(xù)激活Mfge8的N2a細(xì)胞上清對(duì)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系極化比例的影響；(3)持續(xù)激活Mfge8的N2a細(xì)胞上清對(duì)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的影響。進(jìn)而，為揭示IBI患者低表達(dá)MFG-E8和M1型巨噬細(xì)胞極化之間聯(lián)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只無(wú)特定病原體級(jí)別的健康雄性Sprague-Dawley大鼠(年齡：2～3 個(gè)月)購(gòu)自北京維塔爾河實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(中國(guó)北京)。大鼠被關(guān)在8個(gè)獨(dú)立的籠子里，每個(gè)籠子里有2只大鼠，自由進(jìn)食和飲水。所有大鼠均在(25±2)℃的室溫下喂養(yǎng)，12 h光照/黑暗循環(huán)，持續(xù)7 d。

1.2 主要試劑 小鼠N2a神經(jīng)元細(xì)胞系和小鼠BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。胎牛血清(FBS)和Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司。Mfge8持續(xù)激活(Continual activation，CA)慢病毒質(zhì)粒購(gòu)自武漢奧克鼎盛生物科技有限公司。人MFGE8酶聯(lián)免疫吸附(ELISA，D711255)試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，大鼠MFGE8酶聯(lián)免疫吸附(ELISA，ABIN6957839)試劑盒購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司，小鼠MFGE8酶聯(lián)免疫吸附(ELISA，SEB286Mu)試劑盒購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司。抗大鼠Fc-Blocker、CD45-APC、F4/80-FITC、iNOS-PE和Arginase 1-PE-Cy7抗體購(gòu)自北京達(dá)科為生物科技有限公司。Mfge8(Protein Tech)、NeuN(Protein Tech)、F4/80(Protein Tech)、αv/β3-integrin(Protein Tech)、Fak(Protein Tech)、p-P65(Affinity)、P65(Affinity)、p-Erk1/2(Affinity)、Erk1/2(Protein Tech)、Jnk1/2(Protein Tech)、P38(Protein Tech)、P110α(Service bio)、P110β(Service bio)、p-P85(Affinity)、P85、p-AKT(Ser473)(Affinity)、p-AKT(Thr308)(Affinity)、p-mTOR(Ser2481)(Affinity)、p-mTOR(Ser2488)(Affinity)、mTOR(Protein Tech)和β-actin(Protein Tech)。FITC、CoraLite594和HRP兔和鼠二抗(Protein Tech)。其他試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 一般資料 征集2019年2月-2021年1月本院收治的24例缺血性腦卒中患者和40名正常對(duì)照人群。正常對(duì)照人群：年齡(66.51±4.42)年，男20例，女20例。缺血性腦卒中組：年齡(69.52±7.56)年。男14例，女12例，兩組一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)CT檢查明確診斷為缺血性腦損傷；(2)未進(jìn)行相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)缺氧性腦損傷患者和外傷性腦損傷患者；(2)臨床資料不全者;(3)CT檢查以除外腦出血、硬膜下或硬膜外血腫、瘤卒中等。本文研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者、志愿者均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書(shū)。

1.3.2 IBI大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)大鼠模型 依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1]，大鼠接受大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)。大鼠在手術(shù)前禁食12 h，但仍可飲水。術(shù)中腹腔注射2%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉。之后，切開(kāi)頸部的右前部。暴露右側(cè)頸動(dòng)脈三角后，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、左頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)的起始端。然后用動(dòng)脈夾夾住CCA近端和 ECA 遠(yuǎn)端，使用眼科剪刀將ECA分叉到距CCA10 mm 處。將5號(hào)動(dòng)脈導(dǎo)管置入CCA端，松開(kāi)CCA近端動(dòng)脈夾，用20 ml注射器采集動(dòng)脈血10 ml。接下來(lái)，夾住CCA近端，移除動(dòng)脈導(dǎo)管，然后打開(kāi)ECA。將一根 20 mm尼龍線沿血流插入ECA，縫合切口。缺血2 h后，將尼龍線拉回CCA(恢復(fù)大腦中動(dòng)脈供血)。手術(shù)后使用加熱墊將動(dòng)物環(huán)境溫度保持在37 ℃±0.5 ℃。手術(shù)結(jié)束后，將動(dòng)物放入帶有干凈墊子的飼養(yǎng)箱中，并提供自由取食和飲水?？瞻讓?duì)照組采用類似操作的假手術(shù)(Sham)。

1.3.3 免疫熒光檢測(cè) 大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)大鼠腦組織切片采用常規(guī)脫水、石蠟包埋切片。檸檬酸緩沖液修復(fù)后，加入Mfge8(1∶200)、NeuN(1∶500)或F4/80(1∶200)抗體，4 ℃孵育18 h，TBST漂洗3次(5 min/次)后二抗(1∶250)室溫孵育2 h。TBST漂洗3次(5 min/次)后采用明美熒光顯微鏡拍照。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠N2a神經(jīng)元細(xì)胞系和小鼠BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系常規(guī)培養(yǎng)與含有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中。以5×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種細(xì)胞于12孔板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。隨后，小鼠N2a神經(jīng)元細(xì)胞系轉(zhuǎn)染Mfge8持續(xù)激活(Continual activation，CA)慢病毒質(zhì)粒，收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清，小鼠N2a神經(jīng)元細(xì)胞系培養(yǎng)上清加入至小鼠BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化 腦組織加入含2%FBS的PBS，并采用注射器頭部于冰上碾碎。采用70 μm濾網(wǎng)過(guò)濾后，染色。培養(yǎng)細(xì)胞采用EDTA消化后，400 g 室溫離心5 min收集。細(xì)胞重懸于PBS中，加入Fc-Blocker室溫孵育30 min,400 g 室溫離心5 min。細(xì)胞重懸于PBS中，加入CD45-APC、F4/80-FITC染色室溫孵育30 min，400 g 室溫離心5 min。細(xì)胞重懸于PBS中，加入4%多聚甲醛固定 15 min，1% TritonX-100破膜 30 min，加入iNOS-PE和Arginase 1-PE-Cy7抗體室溫孵育30 min。400 g 室溫離心5 min。細(xì)胞重懸于500 μl PBS中。漂洗兩次后，細(xì)胞重懸于500 μl PBS中上機(jī)檢測(cè)。

1.3.6 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)MFGE8蛋白表達(dá) 根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒使用說(shuō)明，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測(cè)缺血性腦損傷(IBI)、大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)大鼠和小鼠N2a神經(jīng)元細(xì)胞系培養(yǎng)上清中MFGE8蛋白表達(dá)。

1.3.7 免疫印跡檢測(cè)MFGE8蛋白表達(dá) 將處理的小鼠N2a神經(jīng)元細(xì)胞系和小鼠BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系加入100 μl的RIPA裂解液，冰上孵育30 min，超聲破碎 10 s。14000 g 4℃離心20 min。上清通過(guò)BCA法檢測(cè)蛋白濃度后，加入5X 上樣緩沖液于95 ℃變形5 min。以50 μg蛋白上樣量用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，Turbo干轉(zhuǎn)15 min于0.22 μm的聚偏二氟乙烯膜上，5%牛血清白蛋白溶液封閉1 h，孵育一抗，4 ℃孵育18 h，TBST漂洗3次(5 min/次)后二抗室溫孵育2 h。TBST漂洗3次(5 min/次)后采用ECL顯影液于Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)顯影，采用Image 2X軟件分析灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 MFGE8蛋白在IBI和MCAO模型大鼠外周血中的表達(dá) IBI外周血中MFGE8的相對(duì)含量明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.051，P=0.0446)(見(jiàn)圖1A)；MCAO模型大鼠腦梗死面積(見(jiàn)圖1B、C)、神經(jīng)功能缺損評(píng)分(mNSS)(見(jiàn)圖1D)和外周血中Mfge8的相對(duì)含量明顯低于假手術(shù)組(Sham)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.223，P=0.0259)(見(jiàn)圖1E)。

圖1 缺血腦損傷患者和MCAO模型大鼠外周血中MFGE8蛋白表達(dá)。A:ELISA法檢測(cè)缺血腦損傷(IBI)患者外周血中MFGE8蛋白表達(dá)；B:MCAO模型大鼠腦組織梗死代表圖；C：MCAO模型大鼠梗死面積統(tǒng)計(jì)分析圖；D:MCAO模型大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分(mNSS)統(tǒng)計(jì)分析圖；E:ELISA法檢測(cè)缺血腦損傷患者外周血中MFGE8含量(*P<0.05,**P<0.01)

2.2 Mfge8蛋白在MCAO模型大鼠腦組織中的定位表達(dá) Mfge8蛋白與神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志(NeuN)高度共定位表達(dá)(見(jiàn)圖2A)；Mfge8蛋白與巨噬細(xì)胞標(biāo)志(F4/80)并不共定位表達(dá)(見(jiàn)圖2B)。

圖2 MCAO模型大鼠腦組織Mfge8蛋白表達(dá)檢測(cè)。A:免疫熒光法檢測(cè)Mfge8和NeuN定位表達(dá)代表圖；B:免疫熒光法檢測(cè)Mfge8和F4/80定位表達(dá)代表圖

2.3 MCAO模型大鼠腦組織巨噬細(xì)胞極化比例檢測(cè) MCAO模型大鼠腦組織中M1型巨噬細(xì)胞比例明顯高于Sham，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.063，P=0.0004)(見(jiàn)圖3A～C)；M2型巨噬細(xì)胞比例明顯低于Sham，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.964，P<0.0001)(見(jiàn)圖3A、B、D)。

圖3 缺血腦損傷患者和MCAO模型大鼠腦組織巨噬細(xì)胞極化比例變化。A:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化設(shè)門(mén)策略；B:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCAO模型大鼠腦組織巨噬細(xì)胞極化代表圖;C：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCAO模型大鼠腦組織巨噬細(xì)胞極化統(tǒng)計(jì)圖(***P<0.0001)

2.4 持續(xù)激活Mfge8的N2a細(xì)胞上清對(duì)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系極化的影響 Mfge8蛋白在Mfge8CA組的N2a神經(jīng)細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)量和培養(yǎng)上清中的含量明顯高于WT組的N2a神經(jīng)細(xì)胞系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.638，P<0.0001;t=4.484，P=0.0003)(見(jiàn)圖4A、B)。Mfge8CA 組N2a神經(jīng)細(xì)胞系培養(yǎng)上清處理的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞M1型巨噬細(xì)胞比例明顯低于WT，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.405，P=0.0230)(見(jiàn)圖4C、D)；M2型巨噬細(xì)胞比例明顯高于野生組WT，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.859，P<0.0001)(見(jiàn)圖4C、E)。

圖4 持續(xù)激活Mfge8對(duì)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響 A:免疫印跡法檢測(cè)持續(xù)激活Mfge8的N2a神經(jīng)細(xì)胞Mfge8蛋白表達(dá)代表圖和統(tǒng)計(jì)圖；B:ELISA法檢測(cè)持續(xù)激活Mfge8的N2a神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)上清統(tǒng)計(jì)圖；C:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)持續(xù)激活Mfge8的N2a神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞極化代表圖;D&E：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCAO模型大鼠腦組織巨噬細(xì)胞極化的統(tǒng)計(jì)圖(*P<0.05,***P<0.0001)

2.5 持續(xù)激活Mfge8N2a細(xì)胞上清對(duì)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞極化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 αv/β3-整合素和Fak在Mfge8CA 組BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.405，P<0.0001；t=3.274,P<0.0113)(見(jiàn)圖5A、B)。p-P65蛋白在Mfge8CA 組BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量明顯低于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.013，P<0.0001)(見(jiàn)圖5A、D)。

圖5 持續(xù)激活Mfge8對(duì)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞極化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。A:免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)代表圖；B～E: 免疫印跡法檢測(cè)蛋白統(tǒng)計(jì)圖(*P<0.05,***P<0.0001)

2.6 持續(xù)激活Mfge8對(duì)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號(hào)蛋白表達(dá)的影響 P85、P85、p-AKT(Ser473)、p-mTOR(Ser2481)和p-mTOR(Ser2488)蛋白在Mfge8CA組BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(**P<0.001,P<0.0001)(見(jiàn)圖6)。

圖6 持續(xù)激活Mfge8對(duì)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號(hào)蛋白表達(dá)的影響。A:免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)代表圖；B～G:免疫印跡法檢測(cè)蛋白統(tǒng)計(jì)圖(**P<0.001,***P<0.0001)

3 討 論

缺血性腦損傷(ischemic brain injury，IBI)是一種復(fù)雜的病理變化，極易導(dǎo)致殘疾和癡呆[1]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，IBI早期小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化是導(dǎo)致神經(jīng)性血管炎癥和腦血管重塑抑制的重要誘因[7,14]。促炎因子的釋放極易導(dǎo)致神經(jīng)毒性和神經(jīng)元損傷[15,16]。MFGE8在急性損傷和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮多種作用[8,9]。MFGE減少缺血再灌注損傷，減輕早期腦損傷中的細(xì)胞凋亡和炎癥[13,17]。然而，MFGE8在IBI中的表達(dá)及對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞極化的調(diào)控作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中患者外周血中的Mfge8蛋白含量明顯降低。大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)大鼠模型外周血和腦組織中Mfge8蛋白含量明顯低于假手術(shù)組。同時(shí)，MCAO大鼠模型腦組織中巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)M1型極化增強(qiáng)，M2型極化減弱。提示，MFG-E8下調(diào)與腦組織中巨噬細(xì)胞的促炎性M1型極化有關(guān)。這與早期報(bào)道的重組MFG-E8在體調(diào)節(jié)炎癥、氧化應(yīng)激，尤其是腦缺血和神經(jīng)退行性疾病中的細(xì)胞凋亡來(lái)提供神經(jīng)保護(hù)一致[18]。其次，本研究證實(shí)，Mfge8主要來(lái)源與神經(jīng)元細(xì)胞，且持續(xù)激活Mfge8的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)上清可體外促進(jìn)M2小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化，抑制M1小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化。MFGE8可通過(guò)整合素β3/FAK/PI3K/AKT 信號(hào)通路減少大鼠腦外傷后細(xì)胞凋亡[18]，通過(guò)整合素β3/SOCS3/STAT3信號(hào)促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為 M2 來(lái)抑制神經(jīng)元炎癥[18]。因此，本研究檢測(cè)Mfge8下游巨噬細(xì)胞極化相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，神經(jīng)元細(xì)胞來(lái)源的Mfge8可激活整合素β3/FAK/PI3K/AKT/mTOR信號(hào)促進(jìn)M2小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化，并抑制Nf-κB炎性蛋白表達(dá)。因而，Mfge8是抑制IBI腦組織炎性反應(yīng)的重要調(diào)控分子之一。并且，神經(jīng)元細(xì)胞Mfge8分泌下調(diào)是IBI腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化異常的重要誘因。

綜上所述，IBI外周血中下調(diào)的MFGE8可能是腦組織中炎性增強(qiáng)的重要標(biāo)志，且神經(jīng)元細(xì)胞來(lái)源的MFGE8減少導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞M1型極化增強(qiáng)，誘發(fā)炎性反應(yīng)并抑制抗炎反應(yīng)，繼而可能損傷血管重塑等引起缺血損傷。MFGE8對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用與整合素β3/FAK/PI3K/AKT/mTOR信號(hào)相關(guān)。