高效液相色譜法同時測定巴氏殺菌乳中 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白

胡 敏，張彩云，李志君，段國霞

（內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

巴氏殺菌乳是指在72 ℃條件下經(jīng)過15～30 s的短時巴氏殺菌處理得到的液體產(chǎn)品[1-2]。GB 19645—2010《食品安全國家標準 巴氏殺菌乳》[3]中明確，巴氏殺菌乳蛋白質(zhì)含量≥2.9 g/100 g。蛋白質(zhì)是生命體中最豐富和最重要的大分子之一，在生命活動中起重要作用，是牛乳中最重要的營養(yǎng)物質(zhì)之一。乳中的蛋白質(zhì)，根據(jù)其在牛乳pH值調(diào)節(jié)到4.6時溶解度特性的不同可分為兩大類，一類為酪蛋白（約占乳蛋白質(zhì)含量的80%），一類為乳清蛋白（約占乳蛋白質(zhì)含量的20%）[4-7]。乳清蛋白中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白為主要成分，分別占乳清蛋白總量的12%～19%和48%～50%[8-10]，乳清蛋白對熱不穩(wěn)定，巴氏殺菌乳可使15.4%的乳清蛋白發(fā)生變性[11]。

α-乳白蛋白是唯一能結(jié)合鈣的乳清蛋白，屬于小分子蛋白質(zhì)，是必需氨基酸和支鏈氨基酸的重要來源。α-乳白蛋白富含色氨酸，是神經(jīng)發(fā)育的重要因子，能夠調(diào)節(jié)睡眠、食欲和情緒[4]。β-乳球蛋白是由162 個氨基酸殘基、2 個二硫基團（S-S）和1 個硫氫基團（-SH）組成的一種分子質(zhì)量約18.3 kDa的球狀蛋白，至少有9 種變體（A、B、C、D、E、H、I、J和W），已知最常見的是A、B變體[12-13]。β-乳球蛋白與葉酸結(jié)合，可以有效增強其穩(wěn)定性；與脂溶性維生素和脂肪酸等結(jié)合，可以改善牛乳的風味、促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，也可以延緩某些脂肪酸和維生素的氧化降解，起到保護作用[14]。

隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活水平的提高，消費者對牛乳中營養(yǎng)物質(zhì)的需求日漸增強。對牛乳蛋白的研究集中于對健康具有促進作用的蛋白質(zhì)及酪蛋白降解后形成的生物性肽[15]。巴氏殺菌乳因其較高的營養(yǎng)價值[16]， 最大限度保留生乳的純正口味，被消費者青睞[17]。但目前檢測巴氏殺菌乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白尚無國標方法。本研究采用最為常用的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法同時檢測α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，選擇分離度較好的C4色譜柱，通過調(diào)整柱溫、色譜檢測條件，將α-乳白蛋白與β-乳球蛋白（A和B）徹底分離，為巴氏殺菌乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的檢測提供一定依據(jù)與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：市售巴氏殺菌乳及其生產(chǎn)用生乳、市售滅菌乳。其中，巴氏殺菌乳為72 ℃條件下經(jīng)15～30 s短時巴氏殺菌處理得到的液體產(chǎn)品[1-2]；生乳為從符合國家有關(guān)要求的健康奶畜乳房中擠出的無任何成分改變的常乳[18]；滅菌乳（α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量約為200 mg/L）： 以生牛（羊）乳為原料，添加或不添加復(fù)原乳，在連續(xù)流動的狀態(tài)下，加熱到至少132 ℃并保持很短時間滅菌，再經(jīng)無菌灌裝等工序制成液體產(chǎn)品[19]。

α-乳白蛋白標準品（純度≥94%）、β-乳球蛋白標準品（純度≥95%） 美國Sigma公司；乙腈（色譜純）、鹽酸（優(yōu)級純） 成都市科隆化學品有限公司；三氟乙酸（色譜純） 上海安譜實驗科技股份有效公司；實驗室用水均采用電阻率不低于18.2 MΩ·cm的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

UItiMate 3000 HPLC儀（配備紫外檢測器） 美國 賽默飛公司；ME204分析天平、FE20實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Synergy超純水機 德國Merk Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

移取10 mL巴氏殺菌乳樣品于100 mL燒杯中，加入25 mL 40 ℃水進行稀釋，用1.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值為4.6，然后轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，用水定容、過濾，濾液過0.22 μm水系濾膜，上機測定。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Xbridge Protein BEH C4柱（250 mm× 4.6 mm，3.5 μm）；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；柱溫60 ℃；檢測器：紫外檢測器；檢測波長210 nm；流動相A：體積分數(shù)0.1%三氟乙酸-水溶液，流動相B：體積分數(shù)0.09%三氟乙酸-乙腈溶液。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

1.3.3 標準溶液的配制

標準儲備液配制：α-乳白蛋白標準儲備液（1.0 mg/mL）： 準確稱取按其純度折算為100%的α-乳白蛋白標準品0.05 g，加水定容至50 mL容量瓶，并進行分裝，置于 -18～-20 ℃密封可保存1 個月；β-乳球蛋白標準儲備液（2.0 mg/mL）：準確稱取按其純度折算為100%的β-乳球蛋白標準品0.1 g，加水定容至50 mL容量瓶，并進行分裝，置于-18～-20 ℃密封可保存1 個月。

標準工作溶液配制：分別吸取適量的α-乳白蛋白標準儲備液、β-乳球蛋白標準儲備液，加水稀釋成α-乳白蛋白質(zhì)量濃度分別為10、50、70、100、200、300、500 mg/L，β-乳球蛋白質(zhì)量濃度分別為20、50、70、100、300、600、900 mg/L的混合標準工作溶液。

1.3.4 結(jié)果計算

試樣中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白含量按下式計算。

式中：X為試樣中α-乳白蛋白或β-乳球蛋白含量/（mg/L）；ρ為由標準曲線得到的樣品溶液質(zhì)量濃度/（mg/L）；V定容為樣品溶液定容體積/mL；V樣品為樣品體積/mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和Origin軟件對數(shù)據(jù)和圖譜進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪蛋白沉淀溫度的選擇

根據(jù)牛乳中酪蛋白在其等電點溶解度最低的原理，在一定溫度下，將牛乳pH值調(diào)整到酪蛋白等電點，酪蛋白即發(fā)生沉淀，酪蛋白不溶于水和有機溶劑[20-21]，根據(jù)以上特性，采用酸沉淀法對酪蛋白進行沉淀，分離不變性的乳清蛋白。觀察20、30、40 ℃溫度下酪蛋白的沉淀效果及速率，確定水溫為40 ℃時稀釋樣品、進行pH值調(diào)節(jié)，樣品凝結(jié)更快，酪蛋白沉淀效果最好。

2.2 色譜柱的選擇

查閱文獻[22]、T/TDSTIA007—2019《奶及奶制品中β-乳球蛋白的測定 液相色譜法》[23]選用安捷倫Zorbax SB-C18色譜柱、資生堂Capcell PAK C18色譜柱、Waters Xbridge Protein BEH C4色譜柱，分別對質(zhì)量濃度為100 mg/L 的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白混合標準工作液進行測定。

由圖1～3可知，相比較C18色譜柱，Xbridge Protein BEH C4色譜柱分離度較好。相同檢測條件下，采用Xbridge Protein BEH C4色譜柱時，α-乳白蛋白、β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B能完全分離，且峰型好、方便積分。

圖1 安捷倫Zorbax SB-C18色譜柱檢測α-乳白蛋白、 β-乳球蛋白HPLC圖譜Fig. 1 HPLC chromatogram of α-lactalbumin and β-lactoglobulin on Agilent Zorbax SB-C18 column

圖2 資生堂Capcell PAK C18色譜柱檢測α-乳白蛋白、 β-乳球蛋白HPLC圖譜Fig. 2 HPLC chromatogram of α-lactalbumin and β-lactoglobulin on Shiseido Capcell PAK C18 column

圖3 Xbridge Protein BEH C4色譜柱檢測α-乳白蛋白、 β-乳球蛋白HPLC圖譜Fig. 3 HPLC chromatogram of α-lactalbumin and β-lactoglobulin on Xbridge Protein BEH C4 column

2.3 流動相體積比的選擇

采用體積分數(shù)0.09%三氟乙酸-乙腈溶液和體積分數(shù)0.1%三氟乙酸-水溶液作為流動相，參考T/TDSTIA 007—2019[23]、李慧[24]等的流動相梯度洗脫條件進行測定，α-乳白蛋白在10.70 min出峰，受雜峰影響，基線有偏移；β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B分別在18.83、21.10 min出峰，出峰時間較晚，整體運行時間較長。經(jīng)確認，在多肽及蛋白質(zhì)的反相液相色譜分離中，初始洗脫條件下流動相中有機溶劑體積分數(shù)較低，多肽及蛋白質(zhì)與固定相間的疏水作用較強，多肽及蛋白質(zhì)幾乎完全被固定相吸附。而一旦流動相中的有機溶劑達到特定的體積分數(shù)，使多肽或蛋白質(zhì)與固定相的作用小于與流動相的作用時，多肽或蛋白質(zhì)就會完全從固定相上洗脫下來，幾乎不再與固定相發(fā)生作用[25]。

故實驗過程中，將第1階段洗脫程序中0.1%三氟乙酸-水溶液體積分數(shù)增大[12]、加強雜質(zhì)洗脫強度，減少α-乳白蛋白出峰處的雜峰干擾，同時整體運行時間從21.10 min縮短到14.90 min，峰型得到更好的改善。在兼顧保留時間和分離效果的前提下，將第1階段洗脫條件中0.1%三氟乙酸-水溶液體積分數(shù)增大至65%。

2.4 標準曲線和線性范圍

將不同質(zhì)量濃度的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白系列標準工作液在本研究確定的條件下測定。結(jié)果表明，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白標準曲線的相關(guān)系數(shù)均為0.999 9，線性良好。

2.5 加標回收率和精密度

在不含α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的滅菌乳、巴氏殺菌乳中分別添加不同質(zhì)量濃度的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白標準品，每個樣品平行測定6 次（滅菌乳）或2 次（巴氏殺菌乳），計算加標回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

由表2可知：α-乳白蛋白加標量為200～1 032 mg/L 時，平均加標回收率為97.9%～104.0%、RSD為0.00%～1.09%；β-乳球蛋白加標量為600～4 727 mg/L 時，平均加標回收率為96.1%～103.0%，RSD為0.00 %～2.23%。

表2 滅菌乳、巴氏殺菌乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的 加標回收率與RSDTable 2 Recovery and RSD of added α-lactalbumin and β-lactoglobulin in sterilized milk and pasteurized milk

由表3可知，對市售巴氏殺菌乳進行6 次重復(fù)測定，α-乳白蛋白、β-乳球蛋白RSD分別為0.48%和0.56%，說明該方法測定市售巴氏殺菌乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量具有很好的精密度。

表3 市售巴氏殺菌乳精密度測定結(jié)果（n=6）Table 3 Precision RSD for determination of α-lactalbumin and β-lactoglobulin in commercial pasteurized milk (n = 6)

2.6 定量限

在不含α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的滅菌乳中分別添加理論含量為25 mg/L的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白標準品，進行定量限測定。由圖4可知，色譜圖雜質(zhì)峰干擾較小，可進行準確定量測定，同時，RS/N≥10，確定該方法α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的定量限均為25 mg/L。

圖4 滅菌乳α-乳白蛋白、β-乳球蛋白加標樣品HPLC圖Fig. 4 HPLC chromatograms of sterilized milk spiked with α-lactalbumin and β-lactoglobulin

2.7 不同實驗室間測定結(jié)果比較

由表4可知，采用本方法測定3 個不同批次的巴氏殺菌乳，不同實驗室間測定結(jié)果無明顯差別，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量測定結(jié)果經(jīng)格拉布斯檢驗法計算，均無離群值，表明方法穩(wěn)定性好。

表4 不同實驗室間3 個不同批次巴氏殺菌乳測定結(jié)果Table 4 Comparison of results of different laboratories for α-lactalbumin and β-lactoglobulin in pasteurized milk

2.8 生乳和市售巴氏殺菌乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量測定結(jié)果

由表5可知，巴氏殺菌乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量均較生乳低。

表5 生乳與巴氏殺菌乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量比較Table 5 Comparison of α-lactalbumin and β-lactoglobulin contents in raw milk and pasteurized milk

3 結(jié) 論

建立一種適用于巴氏殺菌乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量測定的HPLC法。對參考T/TDSTIA 007—2019[23]的樣品前處理條件、色譜條件進行討論及合理優(yōu)化。結(jié)果表明，該方法具有較好的準確度、精密度和重現(xiàn)性，適用于巴氏殺菌乳的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量測定。