骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)抑制破骨細(xì)胞相關(guān)因子改善膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎

馮 唱,李克文,扎西達(dá)娃,張斌斌,季健坤,趙宏濤,陸 川,楊森林

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科,西寧 810000;*通訊作者,E-mail:QDFYkwl@126.com)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是膝關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及關(guān)節(jié)周?chē)琴|(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病,高達(dá)10%的60歲以上的人患有KOA,由于關(guān)節(jié)軟骨自我修復(fù)能力有限和人口老齡化,KOA在許多國(guó)家的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]。其特征是由于細(xì)胞外基質(zhì)的喪失、廣泛的纖維化和裂隙的形成而導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨退變,最終導(dǎo)致軟骨表面的完全喪失[2]。雖然一些藥物如非甾體抗炎藥(NSAIDs)和細(xì)胞外基質(zhì)成分透明質(zhì)酸可以通過(guò)改變軟骨下骨和滑膜來(lái)緩解KOA的癥狀,但由于KOA的復(fù)雜病理和慢性性質(zhì),目前還沒(méi)有有效的治療方法,且許多KOA患者在疾病后期需要關(guān)節(jié)置換治療,但假體的壽命是有限的[3]。因此尋找積極的KOA治療方法非常必要。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)是一種來(lái)源于骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞,作為具有多向分化潛能的干細(xì)胞,BMSCs可以分化為不同類(lèi)型的組織,包括軟骨和骨骼,此外,BMSCs還可以進(jìn)行自我更新并產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)[4,5]。因此,BMSCs在軟骨損傷和關(guān)節(jié)疾病的治療中得到了積極的應(yīng)用。盡管BMSCs已經(jīng)用于治療關(guān)節(jié)炎,但BMSCs治療KOA的具體機(jī)制尚不清楚,有研究者懷疑BMSCs通過(guò)分泌一系列免疫因子和細(xì)胞因子發(fā)揮作用,進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用[6]。此外,在低氧環(huán)境培養(yǎng)MSCs期間,細(xì)胞表現(xiàn)出一套獨(dú)特的分化、增殖和衰老特性[7]。基于此,本研究擬通過(guò)建立KOA動(dòng)物模型,將BMSCs在缺氧條件下共培養(yǎng),研究BMSCs預(yù)處理對(duì)KOA的治療作用并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠40只,體質(zhì)量160-180 g,購(gòu)自四川大學(xué)華西醫(yī)院,使用許可證號(hào):SYXK(川)2018-119,飼養(yǎng)于恒溫20-25 ℃、恒濕(50%±5%)環(huán)境中,自然采光,自由飲水。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,其中32只隨機(jī)分為4組:空白組、模型組、甲氨蝶呤組和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組(BMSCs組),每組8只,剩余8只大鼠用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離。

1.2 主要試劑及儀器

L-DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco;木瓜蛋白酶(S10011;CAS:9001-73-4)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;蘇木素染液(批號(hào):ZH193907)購(gòu)自武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司;伊紅染液(批號(hào):C200403)購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司;核因子κB受體活化因子配基(RANKL,貨號(hào):ZC-36698)、骨保護(hù)素(OPG,貨號(hào):ZC-36651)、CXC趨化因子配體10(CXCL10,貨號(hào):ZC-M6646)ELISA試劑盒購(gòu)自上海茁彩生物科技有限公司;RNA Trizol Reagent(批號(hào)vs18061730)購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;TB Green TM Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(貨號(hào)RR820A)購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司;抗RANKL(貨號(hào):ab239607)、OPG(貨號(hào):ab73400)、TRAF6(貨號(hào):ab33915)、CXCL10(貨號(hào):ab214668)、CXCR3(貨號(hào):ab71864)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào):P0009)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;BMJ-A型包埋機(jī)(常州郊區(qū)中威電子儀器廠);BA210Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán));SpectraMAX Plus384酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司);PIKORed 96實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)儀(美國(guó)ThermoFisher儀器有限公司)。

1.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和鑒定

取剩余10只大鼠,1%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉,75%乙醇全身浸泡消毒10 min,在無(wú)菌條件下分離股骨和脛骨,用添加青/鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基沖出骨髓,然后制成單細(xì)胞懸液,1 000 r/min離心5 min后棄去上清液,重懸以1×109/L的細(xì)胞濃度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中,置37 ℃、CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3 d更換1次新鮮培養(yǎng)基,待細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%-80%融合時(shí),用0.25%胰酶消化,1 ∶2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng),1% O2濃度條件低氧培養(yǎng)。培養(yǎng)后采用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長(zhǎng)狀況并拍照。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記(CD29、CD34、CD105、CD45)鑒定MSCs,具體步驟:收集培養(yǎng)后的細(xì)胞于1 000 r/min,4 ℃離心5 min,各管依次加入單克隆抗體CD29、CD34、CD105、CD45(稀釋度均1 ∶200),避光冰上孵育45 min,用500 μl PBS(含1%BSA)重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.4 膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型構(gòu)建

除空白組外,其余三組均采用木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔注射建立膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型[8]。用0.9%氯化鈉溶液配4%(W/V)木瓜蛋白酶溶液,用1%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,然后雙膝關(guān)節(jié)備皮、消毒、屈曲約45°,從髕骨下緣前內(nèi)側(cè)的膝眼向髁間窩方向進(jìn)針,明顯有落空感后,針尖抵達(dá)股骨內(nèi)側(cè)髁再回撤2 mm,并注射木瓜蛋白酶,分別向雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔注入4%木瓜蛋白酶0.2 ml。每隔3 d注射1次,連續(xù)注射3次(即第1天、第4天、第7天注射)。注射后1周,觀察各組大鼠膝關(guān)節(jié)外觀,并在各組各取1只大鼠處死后,取關(guān)節(jié)軟骨行組織病理切片,驗(yàn)證造模是否成功。

1.5 治療方法

造模成功后第2天,空白組和模型組大鼠膝關(guān)節(jié)腔注射生理鹽水0.3 ml,每周1次,共4次;甲氨蝶呤組大鼠腹腔注射0.5 mg/kg甲氨蝶呤,每周1次,共4次;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)一次性注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞0.3 ml(細(xì)胞濃度為1×108/L),同時(shí)每周1次膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射生理鹽水0.3 ml,共4次。治療結(jié)束后,進(jìn)行大鼠關(guān)節(jié)指數(shù)(AI)評(píng)分[9]:0分,無(wú)腫脹或紅斑;1分,輕度腫脹或紅斑;2分,中度腫脹;3分,重度腫脹;4分,關(guān)節(jié)僵硬或畸形,評(píng)分之和作為最終的AI評(píng)分。然后處死大鼠,采集軟骨和血清樣本進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 HE染色觀察軟骨組織病理學(xué)變化 分離膝關(guān)節(jié)軟骨組織,經(jīng)10%多聚甲醛固定,將固定的軟骨組織,經(jīng)脫鈣、水合、透明、石蠟包埋后切片,切片厚度5 μm,采用HE染色,梯度酒精脫水,中性樹(shù)膠封固,鏡檢觀察膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)變化。

1.6.2 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)血清RANKL、OPG、CXCL10含量 采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清RANKL、OPG、CXCL10含量,根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明步驟嚴(yán)格操作。

1.6.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)軟骨組織RANKL、OPG、TRAF6、CXCL10、CXCR3 mRNA表達(dá) 采用RNA提取試劑盒提取軟骨組織總RNA。將總RNA加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(10 μl),根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)用特異性RT引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。進(jìn)行qRT-PCR分析,以β-actin作為內(nèi)參,引物序列見(jiàn)表1。qRT-PCR反應(yīng)條件:95 ℃初始變性10 min,隨后95 ℃變性10 s,60 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,45個(gè)循環(huán),記錄Ct值,采用2-ΔΔCt分析相對(duì)表達(dá)水平。

表1 RANKL、OPG、TRAF6、CXCL10、CXCR3基因引物序列Table 1 Primer sequences of RANKL, OPG, TRAF6, CXCL10 and CXCR3 genes

1.6.4 蛋白印跡法(Western blot)檢測(cè)軟骨組織RANKL、OPG、TRAF6、CXCL10、CXCR3蛋白表達(dá) 取軟骨組織,RIPA裂解緩沖液提取總蛋白,BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度,樣品煮沸變性后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用等量蛋白質(zhì)上樣,經(jīng)10% SDS-PAGE分離后,置于聚偏氟乙烯膜上,在5%脫脂牛奶中封閉1 h后,與RANKL、OPG、TRAF6、CXCL10、CXCR3(稀釋度均1 ∶500)一抗結(jié)合,于4 ℃孵育過(guò)夜,然后選擇合適的二抗在室溫孵育1 h,ECL暗室顯色。以β-actin表達(dá)作為內(nèi)參,用Image-Pro Plus6.0軟件分析各條帶的光密度值,并用樣品光密度值與β-actin光密度值的比值進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

細(xì)胞形態(tài)觀察顯示細(xì)胞排列緊密,逐漸融合成片,且細(xì)胞形態(tài)均一,呈梭形生長(zhǎng),生長(zhǎng)旺盛(見(jiàn)圖1)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,培養(yǎng)后的BMSCs均表達(dá)CD29、CD34、CD45、CD105(見(jiàn)圖1)。表明BMSCs具有較強(qiáng)的分裂增殖能力。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定Figure 1 Identification of bone marrow mesenchymal stem cells

2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)KOA大鼠關(guān)節(jié)指數(shù)的影響

與空白組比較,模型組大鼠AI評(píng)分明顯升高(P<0.01);與模型組比較,甲氨蝶呤組和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組均能明顯降低大鼠AI評(píng)分(P<0.05,見(jiàn)圖2)。

與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05圖2 各組大鼠AI評(píng)分比較Figure 2 Comparison of AI scores of rats in each group

2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)KOA大鼠組織病理學(xué)的影響

空白組關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整,未見(jiàn)明顯軟骨缺損、軟骨細(xì)胞壞死及纖維增生等病理改變。模型組關(guān)節(jié)軟骨侵蝕,軟骨面不平整,表層缺失,表面纖維組織增生和新生毛細(xì)血管形成,軟骨細(xì)胞數(shù)量顯著增多,軟骨細(xì)胞成簇,排列不規(guī)律,大量軟骨細(xì)胞壞死。甲氨蝶呤組關(guān)節(jié)軟骨侵蝕,軟骨面不平整,表層缺失,表面大量纖維組織增生,且見(jiàn)較多膠原纖維,軟骨細(xì)胞數(shù)量增多,排列紊亂,部分軟骨細(xì)胞壞死。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組關(guān)節(jié)軟骨損傷,軟骨面不平整,軟骨基質(zhì)著色變淡,軟骨細(xì)胞數(shù)量顯著增多,排列紊亂,軟骨細(xì)胞成簇,較多新生軟骨細(xì)胞,嗜酸性增強(qiáng)(見(jiàn)圖3)。

圖3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)KOA大鼠組織病理學(xué)的影響Figure 3 Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on histopathology of knee osteoarthritis rats

2.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)KOA大鼠RANKL、OPG和CXCL10水平的影響

與空白組比較,模型組大鼠血清RANKL、OPG、CXCL10含量均明顯增加(P<0.01);與模型組比較,甲氨蝶呤組OPG、CXCL10含量明顯降低,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組RANKL、OPG、CXCL10含量明顯降低(P<0.05,見(jiàn)表2)。

表2 各組大鼠血清RANKL、OPG、CXCL10含量 (pg/ml)Table 2 Serum RANKL, OPG and CXCL10 levels of rats in each group (pg/ml)

2.5 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)KOA大鼠RANKL/OPG/TRAF6信號(hào)的影響

與空白組比較,模型組大鼠軟骨組織RANKL、OPG、TRAF6、CXCL10、CXCR3 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01);與模型組比較,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組RANKL、OPG、TRAF6、CXCL10、CXCR3 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05,見(jiàn)圖4)。

與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01圖4 各組大鼠軟骨組織RANKL/OPG/TRAF6相關(guān)因子表達(dá)Figure 4 Expression of RANKL/OPG/TRAF6 related factors in cartilage tissues of rats in each group

3 討論

KOA是一種導(dǎo)致疼痛、軟骨變形和關(guān)節(jié)炎癥的退行性關(guān)節(jié)疾病,其臨床特征為關(guān)節(jié)劇烈疼痛,也是導(dǎo)致殘疾的主要原因之一[10]。研究表明BMSCs有潛力作為再生細(xì)胞治療關(guān)節(jié)炎[11]。然而B(niǎo)MSCs治療KOA的具體機(jī)制尚仍有待進(jìn)一步研究。甲氨蝶呤已被報(bào)道是關(guān)節(jié)炎的首選藥物,在關(guān)節(jié)炎中具有確切的治療療效,由此,本研究選用甲氨蝶呤作為陽(yáng)性藥物對(duì)照,擬建立KOA動(dòng)物模型,將BMSCs在缺氧條件下共培養(yǎng),研究BMSCs預(yù)處理對(duì)KOA的治療作用并初步探討其機(jī)制。

近年來(lái),研究顯示間充質(zhì)干細(xì)胞在減緩骨關(guān)節(jié)炎中具有重要作用,間充質(zhì)干細(xì)胞直接在關(guān)節(jié)內(nèi)注射是臨床應(yīng)用最簡(jiǎn)單的方法[12]。在骨關(guān)節(jié)炎的山羊模型中注射自體BMSCs顯示骨關(guān)節(jié)炎內(nèi)側(cè)半月板的明顯再生[13]。在膠原蛋白酶誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎模型中早期注射自體脂肪衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞可以抑制滑膜增厚和軟骨破壞[14]。而自體MSCs單次關(guān)節(jié)內(nèi)植入6個(gè)月可顯著緩解骨關(guān)節(jié)炎患者臨床相關(guān)疼痛[15]。此外,研究顯示關(guān)節(jié)內(nèi)注射骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞可獲得更好的臨床結(jié)果[16]。這些結(jié)果提示間充質(zhì)干細(xì)胞具有減緩骨關(guān)節(jié)炎的作用。另研究發(fā)現(xiàn),體內(nèi)移植缺氧預(yù)處理的hBM-MSCs可促進(jìn)無(wú)菌小鼠軟骨細(xì)胞的增殖并產(chǎn)生軟骨樣組織[17]。含1% O2的精氨酸-天冬氨酸-海藻酸鈉水凝膠中培養(yǎng)的細(xì)胞可促進(jìn)成骨和血管生成反應(yīng),2%的O2可提高干細(xì)胞的增殖和成骨分化水平,提示低氧預(yù)處理是促進(jìn)骨愈合的有效治療方法[18,19]。在免疫缺陷小鼠中,hBM-MSCs在1%的O2中預(yù)處理后植入到由羥基磷灰石和磷酸三鈣組成的支架上,可促進(jìn)可溶性和不溶性膠原的合成,從而產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞外基質(zhì),進(jìn)而促進(jìn)骨再生[20]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)KOA模型大鼠AI評(píng)分較空白組明顯升高,且關(guān)節(jié)軟骨侵蝕,軟骨細(xì)胞數(shù)量顯著增多,大量軟骨細(xì)胞壞死;甲氨蝶呤和BMSCs低氧預(yù)處理可明顯降低大鼠AI評(píng)分,且BMSCs低氧預(yù)處理可明顯改善KOA軟骨組織病理學(xué)變化,結(jié)果表明BMSCs低氧預(yù)處理對(duì)KOA軟骨組織病變具有延緩作用。

此外,骨重建受局部和全身破骨細(xì)胞分化和激活的刺激,由核因子κB激活劑受體(RANK)、核因子κB受體激活劑配體(RANKL)、骨保護(hù)素(OPG)組成的分子系統(tǒng)對(duì)于調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞功能的不同特征至關(guān)重要,包括增殖、分化、融合、激活和凋亡[21]。RANKL被認(rèn)為通過(guò)一系列的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)啟動(dòng)破骨細(xì)胞前體的唯一受體RANK,從而啟動(dòng)破骨細(xì)胞的分化和活化[22]。OPG可充當(dāng)RANKL的誘餌受體,通過(guò)與RANKL結(jié)合來(lái)抑制骨吸收,并阻止它與其受體RANKL相互作用[23]。研究表明大劑量的RANKL和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)培養(yǎng)的MSCs可以通過(guò)分泌OPG來(lái)抑制破骨細(xì)胞的分化和活性,RANKL可以改變MSCs的功能,從而抑制破骨細(xì)胞的形成[24]。然而,BMSCs低氧預(yù)處理對(duì)KOA大鼠破骨細(xì)胞功能的直接作用尚不確定,在本研究,我們發(fā)現(xiàn)BMSCs低氧預(yù)處理明顯抑制了模型大鼠RANKL、OPG、CXCL10含量。提示BMSCs低氧預(yù)處理可能抑制破骨細(xì)胞形成。TRAF6是一種重要的接頭分子,參與RANKL/RANK、TLR、IL-1βR等經(jīng)典途徑的下游,是激活NF-κB途徑促進(jìn)促炎細(xì)胞因子和破骨細(xì)胞相關(guān)因子釋放的關(guān)鍵因子[25]。此外,低氧可影響牙周韌帶細(xì)胞RANKL和OPG表達(dá),是牙槽骨吸收的重要致病事件[26]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)BMSCs低氧預(yù)處理可明顯降低KOA大鼠RANKL、OPG、TRAF6、CXCL10、CXCR3 mRNA和蛋白表達(dá)。提示BMSCs低氧預(yù)處理可能調(diào)控RANKL/OPG/TRAF6信號(hào)通路,在關(guān)節(jié)軟骨的維持中發(fā)揮重要作用。

綜上所述,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞低氧預(yù)處理可能通過(guò)RANKL/OPG/TRAF6信號(hào)通路來(lái)減緩膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展,進(jìn)一步完善低氧預(yù)處理BMSCs的研究可能會(huì)促進(jìn)BMSCs在骨關(guān)節(jié)炎潛在的臨床應(yīng)用。