CRMP2過表達(dá)及沉默對Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響

胡 楊,張 宇,呂俊杰,薛 歡,高媛媛

(1山西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室,太原 030001;2細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室,山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系;3山西醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室;4山西醫(yī)科大學(xué)微生物與免疫學(xué)教研室;*通訊作者,E-mail:891583967@qq.com)

腦衰反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2(collapsin response mediator protein 2,CRMP2)是一種具有多種神經(jīng)功能的磷蛋白,在海馬區(qū)和腦皮質(zhì)表達(dá)豐富,調(diào)節(jié)微管功能并參與細(xì)胞骨架的形成,調(diào)節(jié)神經(jīng)元極性及遷移,參與突出鏈接及軸突運(yùn)輸,參與多種電壓和配體門控離子通道調(diào)控[1,2]。大量研究發(fā)現(xiàn),CRMP2蛋白表達(dá)及修飾異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),包括阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、慢性疼痛、雙相情感障礙、缺血缺氧性腦病和癌癥等[3]。研究表明,CRMP2與AD起病早期的Tau蛋白異常及神經(jīng)纖維纏結(jié)密切相關(guān)[4]。主流的β淀粉樣蛋白(amyloid-β,Aβ)級聯(lián)理論認(rèn)為,Aβ在腦內(nèi)過度沉積并誘導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡,對AD的發(fā)生發(fā)展具有重要作用[5]。Aβ在AD中主要以Aβ1-42和Aβ1-40兩種結(jié)構(gòu)存在,其中Aβ1-42的神經(jīng)毒性較強(qiáng),人工合成的Aβ25-35與Aβ1-42具有接近的神經(jīng)毒性[6]。目前,CRMP2蛋白表達(dá)及修飾異常對各種因素誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的影響研究較少。本研究旨在通過慢病毒感染使CRMP2在SH-SY5Y細(xì)胞中過表達(dá)及沉默,探究CRMP2對Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響,進(jìn)一步揭示CRMP2在AD病理機(jī)制中的作用,為AD的治療提供新的靶點(diǎn)及理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑

SH-SY5Y細(xì)胞系購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。培養(yǎng)基成分:RPMI-1640、10%小牛血清;培養(yǎng)環(huán)境:5% CO2、37 ℃恒溫孵育箱。RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司;小牛血清購自以色列Biological Industries公司;CRMP2抗體,β-actin抗體,Aβ25-35、MTT及DMSO購自美國Sigma-Aldrich公司;LDH細(xì)胞毒性檢測試劑盒、Hoechst染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 慢病毒感染及分組

為獲得CRMP2過表達(dá)及沉默SH-SY5Y細(xì)胞株,將細(xì)胞分為4組進(jìn)行實(shí)驗:CRMP2過表達(dá)組、空載體組、CRMP2沉默組及擾亂載體組。根據(jù)GenBank提供的人源CRMP2基因信息,CRMP2基因序列與pGLV5-EF1a-GFP&Puro載體經(jīng)酶切鏈接,獲得CRMP2過表達(dá)重組慢病毒載體及空白對照載體;以CRMP2為靶基因設(shè)計shRNA,shRNA與pGLV3-H1-GFP&Puro載體經(jīng)酶切鏈接,獲得CRMP2沉默重組慢病毒載體(5′-AGCCAAAGTCTTCAACCTTTA-3′),及擾亂對照載體(5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)。將上述慢病毒載體與病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,培養(yǎng)并收集上清液濃縮獲得相應(yīng)慢病毒。將4種慢病毒分別感染SH-SY5Y細(xì)胞并用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)SH-SY5Y細(xì)胞株。采用熒光檢測和Western blot檢測分別驗證轉(zhuǎn)染效果和CRMP2過表達(dá)及沉默效果。為后續(xù)探究CRMP2過表達(dá)及沉默在Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷中的影響,四組細(xì)胞均用終濃度為3 μmol/L的Aβ25-35孵育處理24 h后,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

1.3 熒光檢測慢病毒感染效率

將經(jīng)篩選的細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行明場和熒光觀察,統(tǒng)計發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)和不發(fā)熒光細(xì)胞數(shù),計算感染效率。感染效率(%)=綠色熒光細(xì)胞數(shù)/(綠色熒光細(xì)胞數(shù)+不發(fā)熒光細(xì)胞數(shù))。

1.4 Western blot檢測CRMP2過表達(dá)及沉默效果

按照Western blot實(shí)驗方法,收集細(xì)胞,提取并測定細(xì)胞總蛋白。蛋白樣品用10%的SDS-PAGE凝膠分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h,抗CRMP2(1 ∶1 000)4 ℃孵育12 h,相應(yīng)二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h,ECL顯影,Quantity One軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 MTT實(shí)驗檢測細(xì)胞活性

活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使MTT還原為藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜,而死亡細(xì)胞無此功能,活性較低的細(xì)胞此功能較弱,故MTT實(shí)驗可以間接反映細(xì)胞活性。四組細(xì)胞均設(shè)置未經(jīng)Aβ25-35處理的對照細(xì)胞孔即對照孔,無細(xì)胞對照孔即空白孔,以及Aβ25-35處理的細(xì)胞孔即處理孔。96空板中孵育24 h后,每孔中加入10 μl MTT,37 ℃孵育4 h,吸棄孔內(nèi)液體,每孔加入100 μl DMSO,搖床上震蕩10 min,酶標(biāo)儀在490 nm處檢測吸光度。細(xì)胞活性(%)=(處理孔OD值-空白孔OD值)/(對照孔OD值-空白孔OD值)。

1.6 LDH釋放實(shí)驗檢測細(xì)胞毒性

LDH是存在于細(xì)胞漿中的酶,當(dāng)細(xì)胞膜損傷時快速釋放到胞外,故LDH釋放實(shí)驗可以間接反映細(xì)胞毒性。四組細(xì)胞均設(shè)置未經(jīng)Aβ25-35處理的對照細(xì)胞孔即對照孔,未經(jīng)Aβ25-35處理用于后續(xù)裂解的細(xì)胞孔即最大酶活性對照孔,以及Aβ25-35處理的細(xì)胞孔即處理孔。96空板中孵育24 h后,每孔各吸取上清液120 μl,400g離心5 min,取上清液100 μl于新的96孔板相應(yīng)孔中,按照LDH細(xì)胞毒性檢測試劑盒說明書進(jìn)行測定,酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm。細(xì)胞毒性=(處理孔OD值-對照孔OD值)/(最大酶活性的OD值-對照孔OD值)。

1.7 Hoechst 33258熒光染色實(shí)驗檢測細(xì)胞凋亡

潔凈蓋玻片置于六孔板培養(yǎng)細(xì)胞,Aβ25-35孵育處理后,吸棄培養(yǎng)液,加入1 ml固定液,固定20 min后用PBS洗滌。加入1 ml Hoechst 33258染色液,染色5 min后用PBS洗滌?？篃晒獯銣缫哼M(jìn)行封片,立即進(jìn)行熒光觀察。正常細(xì)胞核呈規(guī)則的藍(lán)色,而凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)致密或碎塊狀致密的亮藍(lán)色。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CRMP2在SH-SY5Y細(xì)胞中過表達(dá)及沉默

熒光檢測結(jié)果顯示,各組細(xì)胞均表達(dá)較強(qiáng)的熒光(圖1),慢病毒感染效率均達(dá)95%以上。WB檢測結(jié)果顯示,與擾亂載體組相比,CRMP2沉默組CRMP2蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.01);與空載體組相比,CRMP2過表達(dá)組CRMP2蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01,見圖1)。

與擾亂載體組比較,##P<0.01;與空載體組比較,**P<0.01圖1 熒光檢測和Western blot檢測驗證轉(zhuǎn)染效果Figure 1 Validation of transfection efficy by fluorescence detection and Western blot

2.2 CRMP2過表達(dá)及沉默對Aβ25-35孵育后SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響

MTT實(shí)驗結(jié)果顯示,以擾亂載體組細(xì)胞活性為100%,與擾亂載體組相比,CRMP2沉默組細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05);與空載體組相比,CRMP2過表達(dá)組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01,見圖2)。

2.3 CRMP2過表達(dá)及沉默對Aβ25-35孵育后SH-SY5Y細(xì)胞毒性的影響

LDH實(shí)驗結(jié)果顯示,以擾亂載體組細(xì)胞毒性為100%,與擾亂載體組相比,CRMP2沉默組細(xì)胞毒性顯著降低(P<0.05);與空載體組相比,CRMP2過表達(dá)組細(xì)胞毒性顯著增加(P<0.01,見圖3)。

與擾亂載體組比較,#P<0.05;與空載體組比較,**P<0.01圖2 CRMP2過表達(dá)及沉默對Aβ25-35孵育后SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響Figure 2 Effects of CRMP2 overexpression and knockdown on SH-SY5Y cell activity after incubation with Aβ25-35

2.4 CRMP2過表達(dá)及沉默對Aβ25-35孵育后SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst 33258實(shí)驗結(jié)果顯示,與擾亂載體組相比,CRMP2沉默組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與空載體組相比,CRMP2過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01,見圖4)。

與擾亂載體組比較,#P<0.05;與空載體組比較,**P<0.01圖3 CRMP2過表達(dá)及沉默對Aβ25-35孵育后SH-SY5Y細(xì)胞毒性的影響Figure 3 Effects of CRMP2 overexpression and knockdown on SH-SY5Y cell cytotoxicity after incubation with Aβ25-35

圖4 CRMP2過表達(dá)及沉默對Aβ25-35孵育后SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 Effects of CRMP2 overexpression and knockdown on SH-SY5Y cell apoptosis after incubation with Aβ25-35

3 討論

AD是一種起病隱匿的神經(jīng)退行性疾病,為最常見的癡呆癥類型,主要病理特征為腦皮質(zhì)和海馬萎縮,突觸減少及神經(jīng)元缺失,腦內(nèi)出現(xiàn)老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié),其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明,且臨床尚無理想的治療藥物[7]。CRMP2可與α-微管蛋白和β-微管蛋白結(jié)合,促進(jìn)微管的組裝及維持微管穩(wěn)定性[8]。磷酸化的CRMP2與微管解離,影響軸突蛋白傳遞功能,導(dǎo)致神經(jīng)元功能損傷,促進(jìn)AD的發(fā)生發(fā)展[9]。

除微管蛋白外,CRMP2還能與肌動蛋白、波形蛋白及多種離子通道等相互作用,調(diào)節(jié)多種生理功能[10]。研究表明,CRMP2表達(dá)降低及CRMP2磷酸化程度增加可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖[11]。本研究通過慢病毒感染SH-SY5Y細(xì)胞,構(gòu)建了CRMP2過表達(dá)及沉默SH-SY5Y細(xì)胞,探究CRMP2在Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷中的具體作用。在創(chuàng)傷性腦損傷和腦缺血再灌注損傷的研究表明,CRMP2修飾異常誘導(dǎo)NMDA受體過度激活,導(dǎo)致大量胞外Ca2+進(jìn)入胞內(nèi),引起突觸后神經(jīng)元Ca2+超載,進(jìn)而引起神經(jīng)元損傷,且干擾CRMP2與NMDA受體的相互作用可以抑制胞內(nèi)Ca2+超載,起到神經(jīng)保護(hù)作用[12,13]。CRMP2在神經(jīng)元損傷和神經(jīng)保護(hù)方面具有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究通過MTT實(shí)驗,LDH釋放實(shí)驗及Hoechst 33258熒光染色實(shí)驗表明,在Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型中,CRMP2過表達(dá)導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞活性降低,毒性增強(qiáng)及凋亡增加,CRMP2沉默具有使SH-SY5Y細(xì)胞活性增加,毒性降低及凋亡減少的神經(jīng)保護(hù)作用。

CRMP2通過復(fù)雜的機(jī)制調(diào)節(jié)多種生理功能并在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,但其與AD關(guān)聯(lián)的研究較少。有研究表明,CRMP2能被CDK5在Ser-522位點(diǎn)磷酸化,從而增強(qiáng)其與CaV2.2離子通道的相互作用,導(dǎo)致大量胞外Ca2+內(nèi)流引起Ca2+超載,從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[14]。本研究結(jié)果表明,CRMP2過表達(dá)及沉默在Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中具有重要作用,猜測其機(jī)制可能與CRMP2表達(dá)增加,導(dǎo)致Aβ25-35誘導(dǎo)的CRMP2磷酸化增加,進(jìn)而導(dǎo)致下游調(diào)節(jié)異常有關(guān)。本研究提示,通過靶向CRMP2調(diào)控其表達(dá)或靶向CRMP2的下游通路,可能達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的目的,以期對包括AD在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病起到預(yù)防或治療作用。