二甲雙胍對高脂喂養(yǎng)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞PGC-1α及PI3K表達(dá)的影響

張 穎,徐 靜,李 楠

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,西安 710032;2空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科;3西安市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科;*通訊作者,E-mail:xujingjdey85@163.com)

高游離脂肪酸血癥和高甘油三酯血癥可導(dǎo)致心肌脂質(zhì)沉積,心肌細(xì)胞脂肪酸氧化代謝增強(qiáng)可直接引起心肌細(xì)胞的耗氧量增高,長脂酰輔酶A的增多,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)超氧化簇的聚集、抑制一氧化氮合酶活性及引起心肌細(xì)胞凋亡,進(jìn)而引起心室壁增厚、心室重構(gòu)、從而引起心臟收縮功能障礙等。糖尿病心肌對脂肪酸的攝取和利用遠(yuǎn)大于心肌細(xì)胞實際的氧化代謝需要,脂肪酸的過度活化可誘發(fā)心肌脂毒性,導(dǎo)致心肌細(xì)胞脂代謝產(chǎn)物和介質(zhì)堆積,線粒體活性氧產(chǎn)生過量,進(jìn)而引起糖尿病心肌肥大和功能障礙[1]。因此,脂毒性與心肌損害的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。胰島素抵抗(insulin resistance,IR)伴發(fā)的3個特征性代謝紊亂(高血糖癥、高胰島素血癥、高脂血癥)也可通過各種途徑導(dǎo)致心肌間質(zhì)纖維化的發(fā)生,與心肌能量代謝、心肌細(xì)胞胰島素敏感性亦密切相關(guān)。二甲雙胍對心血管有一定的保護(hù)作用,已被較多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持[2,3],但二甲雙胍對心肌作用機(jī)制仍需探討。過氧化物酶體增殖物激活受體γ協(xié)同刺激因子-1α(peroxisome proliferator activated receptor γ co-activator 1α,PGC-1α)作為心肌線粒體能量代謝的主要因子[4],PGC-1α在肝臟中的表達(dá)可被二甲雙胍所抑制,在肝臟中,二甲雙胍可抑制由于PGC-1α過表達(dá)導(dǎo)致的磷酸烯醇式丙酮酸脫羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)以及6-磷酸葡萄糖脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogense,G-6-Pase)增加[5],但二甲雙胍并不影響PGC-1α介導(dǎo)的線粒體基因誘導(dǎo)。目前二甲雙胍對心肌細(xì)胞PGC-1α作用尚不明確。該研究通過觀察二甲雙胍對高脂喂養(yǎng)并且由鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的2型糖尿病(T2DM)大鼠模型心肌細(xì)胞PGC-1α及磷酸肌醇3激酶(phosphatidylinositide 3-kinase,PI3K)p85亞基在大鼠心肌細(xì)胞表達(dá)的影響,以進(jìn)一步探究二甲雙胍對糖尿病大鼠心肌細(xì)胞中胰島素信號傳導(dǎo)及心肌細(xì)胞能量代謝的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心健康雄性SD大鼠36只，清潔級，體質(zhì)量180-280 g，血糖正常。飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境溫度(23±2)℃、濕度(55±5)%，光照維持晝夜循環(huán)每日12 h，自由進(jìn)飲食，每天換水、墊料。

1.2 動物分組及T2DM大鼠模型建立

雄性SD大鼠36只隨機(jī)分為正常對照組(12只)和2型糖尿病模型組(24只)。正常對照組喂以普通飼料，2型糖尿病模型組喂以高脂高糖飼料(基礎(chǔ)飼料82%，豬油10%，膽固醇2.5%，蔗糖5%，膽酸鈉0.5%)[6]，其中膽固醇、膽酸鈉購于上海如吉生物科技發(fā)展有限公司。普通飼料購于北京科澳協(xié)力飼料有限公司。豬油、蔗糖為自備。喂養(yǎng)至12周末，隔夜空腹給予2型糖尿病模型組大鼠腹腔注射STZ 30 mg/kg(購于美國Sigma公司，于使用前用0.1 mmol/L pH為4.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液臨時配成1%的溶液)。正常對照組注射相應(yīng)體積的檸檬酸緩沖液。于實驗第15周正常對照組及2型糖尿病模型組進(jìn)行眼底靜脈取血，測空腹血糖(FBG)和空腹胰島素(FINS)。連續(xù)兩次以上FBG≥7.8 mmol/L，計算HOMA-IR指數(shù)較正常對照組升高有統(tǒng)計學(xué)差異者，定義為伴有胰島素抵抗[7]，為造模成功，造模成功大鼠共24只。隨機(jī)抽取其中12只為糖尿病組，余12只大鼠為干預(yù)組。正常對照組和糖尿病組給予等體積生理鹽水灌胃。二甲雙胍干預(yù)組給予鹽酸二甲雙胍300 mg/(kg·d)灌胃[8]，其中鹽酸二甲雙胍由中美上海施貴寶制藥有限公司提供，共持續(xù)8周。22周末大鼠禁食水12 h后，稱重，用10%的水合氯醛按0.6 g/kg體質(zhì)量腹腔麻醉，收集血液以測定空腹血糖(FBG)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、極低密度脂蛋白(VLDL)、游離脂肪酸(FFAs)、空腹胰島素(FINS)，計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。留取部分心肌組織固定于10%甲醛，供HE染色，另一部分置于-80 ℃冰箱中，供免疫印跡法檢測使用。

1.3 生化指標(biāo)測定

于22周末進(jìn)行生化指標(biāo)測定，血糖采用羅氏血糖儀測定。總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白均按試劑盒方法操作。游離脂肪酸采用比色法測定。膽固醇、膽酸鈉購于上海如吉生物科技發(fā)展有限公司。生物試劑盒購自南京建成生物工程研究所，游離脂肪酸試劑盒購自英國RANDOX公司。胰島素采用酶聯(lián)免疫法測定，鼠胰島素檢測試劑盒購自美國R&D公司。

1.4 HE染色

經(jīng)固定、脫水、制作蠟塊、切片脫蠟、染色過程，于光鏡下放大至高倍，照相。

1.5 免疫印跡法(Western blot法)檢測蛋白表達(dá)

心肌組織總蛋白提取后，取上清液分裝于離心管中并置于-20 ℃保存。將樣品放置于生物分光光度計(NanoDrop ND-1000)比色分析，計算含50 μg蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5 ml離心管中，加入5×SDS上樣緩沖液與蛋白樣品按1 ∶4混勻。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，用TBST將一抗稀釋至適當(dāng)濃度，放入1.5 ml離心管中；撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實驗臺面上，將抗體溶液加到保鮮膜上；其中PI3K p85多克隆抗體購自美國SCT生物技術(shù)公司。PGC-1α多克隆抗體購自英國Abcam生物技術(shù)公司。從封閉液中取出膜，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角趕出殘留氣泡；放入冰箱內(nèi)4 ℃孵育過夜。第2天取出膜，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min。室溫下封閉1 h。4 ℃封閉過夜。凝膠成像系統(tǒng)拍照，進(jìn)行密度值測定。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般情況

正常對照組12只大鼠普通飼料喂養(yǎng)，毛發(fā)光潔、精神狀態(tài)良好、生長發(fā)育正常；2型糖尿病模型組大鼠高脂高糖喂養(yǎng)過程中，毛發(fā)易脫落、豎立無光澤，反應(yīng)遲鈍、精神萎靡、生長發(fā)育遲緩。第15周用STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型成功后，2型糖尿病模型組24只大鼠在原有特殊癥狀的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)了多飲、多食、多尿、腹瀉、消瘦癥狀明顯。第15周至22周末進(jìn)行藥物干預(yù)過程中，正常對照組和糖尿病組僅使用生理鹽水灌胃，各自特征較前無特殊改變，其中糖尿病組2只于20周自然死亡；二甲雙胍干預(yù)組大鼠腹瀉較其他組嚴(yán)重，余多飲、多尿癥狀好轉(zhuǎn)，其中2只于21周因灌胃死亡。

2.2 血糖、血脂、游離脂肪酸、胰島素及胰島素抵抗指數(shù)的比較

實驗室第15周測空腹血糖(FBG)和空腹胰島素(FINS)，連續(xù)兩次以上FBG≥7.8 mmol/L，HOMA-IR指數(shù)較正常對照組升高有統(tǒng)計學(xué)差異者定義為伴有胰島素抵抗，為造模成功(見表1)。22周末測糖尿病組大鼠FBG、TC、TG、LDL-C、VLDL、FFAs、FINS、HOMA-IR指標(biāo)均較正常對照組大鼠升高(P<0.01)，HDL-C指標(biāo)較正常對照組降低(P<0.01)；干預(yù)組大鼠FBG、TC、TG、LDL-C、VLDL、FFAs、FINS、HOMA-IR指標(biāo)均較糖尿病組降低，HDL-C指標(biāo)較糖尿病組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見表2)。

表1 第15周兩組大鼠HOMA-IR指標(biāo)的比較Table 1 Comparison of HOMA-IR of rats between two groups at week

表2 22周末各組大鼠生化指標(biāo)的比較Table 2 Comparison of the biochemical index of rats between groups at the end of 22

2.3 免疫印跡法結(jié)果

與正常對照組比較，糖尿病組PGC-1α表達(dá)升高(P<0.05)；與糖尿病組比較，干預(yù)組PGC-1α表達(dá)降低(P<0.05)。與正常對照組比較，糖尿病組PI3K p85表達(dá)降低(P<0.05)；與糖尿病組比較，干預(yù)組PI3K p85表達(dá)升高(P<0.05，見圖1)。

2.4 HE染色結(jié)果

22周末取大鼠心肌組織固定于10%甲醛，行HE染色。正常對照組心肌細(xì)胞排列整齊、致密，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則。糖尿病組，可見心肌細(xì)胞排列不整齊，心肌細(xì)胞腫脹明顯，部分細(xì)胞核可見形態(tài)不規(guī)則；心肌細(xì)胞部分融合，邊界不清楚。二甲雙胍干預(yù)組，心肌細(xì)胞形態(tài)排列較整齊，未見明顯細(xì)胞腫脹，核形態(tài)較規(guī)則(見圖2)。

與正常對照組比較，*P<0.05；與糖尿病組比較，△P<0.05圖1 各組心肌組織PI3K p85、PGC-1α表達(dá)免疫印跡法結(jié)果Figure 1 Western blotting results of PI3K p85 and PGC-1α expression in myocardial tissues in each group

圖2 22周末各組心肌組織HE染色結(jié)果Figure 2 HE staining results of myocardial tissue in each group at the end of 22 weeks

3 討論

3.1 脂毒性心肌病與胰島素抵抗

脂肪酸的攝取和利用不相平衡，造成脂質(zhì)氧化不充分，不能充分氧化的脂質(zhì)在心臟沉積，導(dǎo)致心肌功能障礙或心肌肥厚，進(jìn)而形成脂毒性心肌病[9]。糖尿病患者血漿中FFAs和TAGs水平升高和心肌細(xì)胞脂質(zhì)積聚均為糖尿病性心肌病發(fā)展的必然經(jīng)過。心肌細(xì)胞胰島素抵抗是心肌病發(fā)生的一個重要原因。胰島素抵抗使心肌細(xì)胞利用葡萄糖氧化來提供的能量減少，從利用葡萄糖和脂肪酸供能轉(zhuǎn)變幾乎全部通過脂肪酸β-氧化提供能量[10]。糖尿病患者心臟長期處于高血糖、高血脂的代謝環(huán)境，促進(jìn)大量基因序列的改變，主要涉及有關(guān)免疫反應(yīng)、細(xì)胞信號通路、增殖及轉(zhuǎn)錄的基因，繼而引起一系列細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化[11]。因此，脂毒性與胰島素抵抗始終互為因果。本實驗是在首先誘導(dǎo)動物出現(xiàn)胰島素抵抗的基礎(chǔ)上再注射小劑量STZ，兩者結(jié)合起來更加有利于誘導(dǎo)出病理、生理方面改變都接近于人類的2型糖尿病，實驗中大鼠經(jīng)高脂高糖喂養(yǎng)后，出現(xiàn)了明顯的高脂血癥，模型組大鼠膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白及游離脂肪酸、胰島素抵抗指數(shù)均出現(xiàn)明顯升高，高密度脂蛋白明顯降低，是研究2型糖尿病之毒性、胰島素抵抗的理想模型，通過HE染色后亦可見糖尿病組大鼠心肌的病理形態(tài)學(xué)改變。

3.2 PI3K-Akt途徑與心肌細(xì)胞的胰島素敏感性

PI3K-蛋白激酶B(Akt/PKB)途徑介導(dǎo)胰島素的大部分生物效應(yīng)，是胰島素調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能的主要信號通路，可調(diào)節(jié)葡萄糖攝取、促進(jìn)細(xì)胞分裂、增生及生存、抗凋亡、激活多個基因表達(dá)等，PI3K-Akt-mTOR通路是目前研究熱點，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生理活動，包括細(xì)胞的生長、增殖和分化，其過度激活參與糖尿病心肌病、糖尿病腎病、胰島素抵抗等[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，正常狀態(tài)下大鼠心肌組織有PI3K的表達(dá)，但2型糖尿病組PI3K的表達(dá)較正常組明顯減低，提示PI3K的表達(dá)與2型糖尿病心肌細(xì)胞胰島素敏感性降低密切相關(guān)。在參與基因調(diào)控方面，分析可能是由于PI3K的表達(dá)減低，導(dǎo)致下游因子Akt的表達(dá)變化，由于Akt處于PI3K/Akt通路的中心環(huán)節(jié)，是PI3K的直接靶基因。許多細(xì)胞因子、生長因子和物理刺激等都可通過激活PI3K而使Akt磷酸化，活化的Akt引起下游磷酸化級聯(lián)反應(yīng)和靶蛋白之間的相互作用，調(diào)控細(xì)胞生長與存活、增殖與凋亡，糖類代謝，基因轉(zhuǎn)錄等多種細(xì)胞活動和生物學(xué)效應(yīng)，而PI3K的表達(dá)直接影響下游因子的表達(dá)變化。因此，PI3K表達(dá)增加可促進(jìn)外周組織的糖利用，減輕胰島素抵抗，增強(qiáng)將葡萄糖作為能量來源的能力，使心臟供能加強(qiáng)并防止心功能不全，而PI3K表達(dá)下降則影響心肌細(xì)胞生理活動。

3.3 PGC-1信號傳導(dǎo)途徑在心肌代謝中起關(guān)鍵作用

在復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄途徑的主要成分中，過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(PGC-1α)起關(guān)鍵作用，作為代謝傳感器，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的微調(diào)對過多刺激的反應(yīng)[13]，并且調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞糖酵解到有氧氧化的代謝轉(zhuǎn)換。PGC-1α表達(dá)增多明顯加強(qiáng)脂肪酸的氧化，并發(fā)生在糖酵解的肌肉中[14]。本實驗經(jīng)過高脂喂養(yǎng)并通過STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中，PGC-1α表達(dá)水平升高。PGC-1α表達(dá)加強(qiáng)脂肪酸β-氧化，而利用葡萄糖和脂肪酸供能轉(zhuǎn)變幾乎全部通過脂肪酸β-氧化提供能量為糖尿病心肌病發(fā)生的重要機(jī)制之一。此外，低氧刺激PGC-1α表達(dá)，而后PGC-1α與核受體相互作用，增加血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的分泌[15]。我們推測PGC-1α的表達(dá)增加,加強(qiáng)糖尿病心肌細(xì)胞由葡萄糖供能轉(zhuǎn)變?yōu)橹舅嵫趸┠?，可能為不利因素。此外，PGC-1α在決定線粒體含量中起主要作用。線粒體增生失控，導(dǎo)致線粒體數(shù)量和體積驟增，同時伴有線粒體生物發(fā)生相關(guān)基因的上調(diào)；或許已有線粒體超微結(jié)構(gòu)破壞和病理心肌的發(fā)生[16]。綜上所述，我們可以推測PGC-1α在心肌細(xì)胞中的表達(dá)增加可能引起線粒體的增生，數(shù)量與體積劇增。線粒體含量的任何增加都會以肌原纖維體積增大為代價，從而使心肌肥大，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致心臟功能失代償。

3.4 二甲雙胍的心血管保護(hù)作用

作為2型糖尿病治療一線治療藥物，許多循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明，二甲雙胍除了能夠降低血糖，改善胰島素抵抗之外，還具有心血管保護(hù)作用，能夠減輕缺氧、缺血再灌注損傷、減少心肌細(xì)胞凋亡。保護(hù)血管內(nèi)皮、延緩心肌纖維化、改善心肌肥厚的積極作用。二甲雙胍能夠通過PI3K-Akt依賴途徑誘導(dǎo)Akt磷酸化抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)體(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)開放來減輕缺血再灌注損傷[17]。近期有文獻(xiàn)報道二甲雙胍還可以激活A(yù)kt1并使JNK3及c-Jun磷酸化水平降低，達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡改善缺血再灌注損傷。其具體分子機(jī)制是經(jīng)由PI3K-Akt-mTOR途徑介導(dǎo)抑制缺血心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)心肌存活，對大鼠心肌細(xì)胞發(fā)揮正性肌力作用[18]。從本實驗可以看出，二甲雙胍組較糖尿病組PI3K表達(dá)升高，說明二甲雙胍可以通過PI3K-Akt介導(dǎo)的途徑對糖尿病心肌細(xì)胞發(fā)揮作用。此外，本實驗中二甲雙胍干預(yù)后心肌細(xì)胞PGC-1α表達(dá)較糖尿病組降低，提示二甲雙胍可能通過PGC-1α表達(dá)的減少，減少脂肪酸β-氧化，加強(qiáng)葡萄糖供能，改善心肌代謝。同樣近期有研究結(jié)果顯示大鼠梗死心肌中PGC-1α的蛋白質(zhì)表達(dá)水平上調(diào)，細(xì)胞凋亡率上升，二甲雙胍干預(yù)后，PGC-1α蛋白質(zhì)表達(dá)水平下降，細(xì)胞凋亡率提升[19]，研究結(jié)果與本實驗一致。

綜上所述，二甲雙胍干預(yù)組大鼠的血脂相關(guān)生化指標(biāo)及胰島素抵抗指數(shù)均較糖尿病組有明顯改善，可改善脂毒性及胰島素抵抗?？赡芡ㄟ^抑制大鼠心肌細(xì)胞PGC-1α表達(dá)，同時上調(diào)大鼠心肌細(xì)胞PI3K p85的途徑完成，改善心肌能量代謝，增強(qiáng)心肌細(xì)胞的胰島素敏感性。PGC-1α與PI3K-Akt途徑之間的調(diào)節(jié)機(jī)制，其下游因子之間的相互作用，仍需進(jìn)一步研究，進(jìn)而更深入地研究糖尿病心肌病機(jī)制及二甲雙胍對2型糖尿病患者心臟保護(hù)作用機(jī)制。