烏梅有機(jī)酸基于TGF-β/Smad信號通路對高糖誘導(dǎo)心肌纖維化的保護(hù)作用

代 天,劉 敏,楊 萍,姚 峰,余信強(qiáng),趙 璠,張?zhí)K川

(江漢大學(xué)附屬醫(yī)院,武漢市第六醫(yī)院心血管內(nèi)科,武漢 430015;*通訊作者,E-mail:zhangsuchuan1@163.com)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病患者常發(fā)生的一種并發(fā)癥,心肌纖維化是其致病基礎(chǔ),能導(dǎo)致心臟順應(yīng)性及收縮功能下降,引發(fā)心衰、泵衰竭、房顫等多種心臟病理癥狀[1,2]。糖基化終末產(chǎn)物在高糖環(huán)境中大量合成,誘導(dǎo)炎性因子過表達(dá),引發(fā)炎癥,刺激心臟成纖維細(xì)胞增殖,促進(jìn)膠原蛋白合成分泌,是導(dǎo)致心肌纖維化的主要原因,減輕炎癥是緩解心肌纖維化過程的有效方法[3,4]。烏梅是藥食同源藥材,來自于薔薇科植物梅的成熟果實(shí),具有生津止渴、斂肺澀腸、安蛔止瀉、清咽止咳的功效,烏梅丸能顯著抑制免疫性結(jié)腸炎大鼠炎性因子表達(dá),降低結(jié)直腸組織損傷,還可降低2型糖尿病大鼠血糖,調(diào)節(jié)腸道菌群,減輕炎癥反應(yīng),改善其臨床癥狀[5,6]。烏梅有機(jī)酸是烏梅的主要活性成分,具有抑制消炎的作用[7],但其是否可防治心肌纖維化,目前還未有明確研究。TGF-β/Smad是調(diào)控成纖維細(xì)胞增殖,組織纖維化發(fā)生發(fā)展的主要信號,在DCM病理過程中,TGF-β1表達(dá)上調(diào),Smad3磷酸化增強(qiáng),成纖維細(xì)胞活化增殖,引發(fā)心肌纖維化;阻斷TGF-β/Smad信號傳導(dǎo),可抑制成纖維細(xì)胞增殖,減少膠原蛋白合成沉積,減輕心肌纖維化,改善心功能[8,9]。另有研究發(fā)現(xiàn),以升陷烏梅湯干預(yù)哮喘大鼠,可抑制TGF-β1/Smad信號激活,延緩肺功能損傷[10]。但烏梅有機(jī)酸能否通過調(diào)控TGF-β/Smad信號緩解高糖誘導(dǎo)的心肌纖維化,目前還沒有報(bào)道,本文以烏梅有機(jī)酸處理高糖誘導(dǎo)的新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞,對此進(jìn)行探索研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 新生大鼠原代心肌成纖維細(xì)胞(貨號PR486),購自廣州柏賽柯生物技術(shù)有限公司;烏梅藥材(貨號XY26138),購自上海信裕生物科技有限公司;TGF-β1重組蛋白(貨號A04398),購自上海禾午生物科技有限公司;D-葡萄糖粉(貨號G8150)、DMEM低糖培養(yǎng)基(貨號31600)、青鏈霉素混合液(貨號P1400)、胎牛血清(貨號11011-8611)、胰蛋白酶-EDTA消化液(貨號T1300)、CCK-8試劑盒(貨號CA1210)、大鼠TNF-α ELISA試劑盒(貨號SEKR-0009)、大鼠IL-6 ELISA試劑盒(貨號SEKR-0005)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(貨號P1200-50T)、高效RIPA裂解液(貨號R0010)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號PC0020),均購自美國Solarbio公司;大鼠Ⅲ型前膠原氨基端肽(procollagen Ⅲ N-terminal peptide,PⅢNP)ELISA試劑盒(貨號JL20753),購自上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司;大鼠Ⅰ型前膠原蛋白羧基末端肽(procollagen type Ⅰ carboxy-terminal peptide,PICP)ELISA試劑盒(貨號ER0322),購自武漢菲恩生物科技有限公司;兔源GAPDH一抗(貨號ab181602)、兔源TGF-β1一抗(貨號ab179695)、兔源Smad3一抗(貨號ab40854)、兔源p-Smad3一抗(貨號ab52903)、羊抗兔二抗(貨號ab150077),均購自美國Abcam公司等。

1.1.2 主要儀器 酶標(biāo)儀(型號varioskan LUX)、凝膠成像系統(tǒng)(型號IBright CL 1500)購自美國Thermo Fisher Scientific公司;電泳儀(型號EPS 300)、轉(zhuǎn)膜儀(型號Tanon)購自美國Bio-Rad公司等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞模型制備及烏梅有機(jī)酸濃度篩選 培養(yǎng)液配制:DMEM低糖(5.5 mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、100 U/ml青鏈霉素溶液,混勻,即獲得細(xì)胞完全培養(yǎng)液;細(xì)胞完全培養(yǎng)液中加入D-葡萄糖粉,至葡萄糖終濃度為33.3 mmol/L[11],混勻,即獲得細(xì)胞高糖培養(yǎng)液。

通過CCK-8實(shí)驗(yàn)測得不同濃度烏梅有機(jī)酸對原代心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響,計(jì)算出IC50值,進(jìn)而篩選出最佳作用濃度:購買的新生大鼠原代心肌成纖維細(xì)胞快速解凍,復(fù)蘇后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶,平放在95%濕度、37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的傳代細(xì)胞,以0.5×105個/ml的密度接種在96孔板,培養(yǎng)24 h后,更換高糖培養(yǎng)液進(jìn)行高糖誘導(dǎo),同時以終濃度0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mg/ml的烏梅有機(jī)酸[7]處理,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,更換為完全培養(yǎng)液,同時加入CCK-8試劑,1.5 h后于450 nm波長下測出各孔吸光度(optical density,OD),計(jì)算細(xì)胞活力,獲得IC50值,細(xì)胞活力=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇2 mg/ml的烏梅有機(jī)酸進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組及處理 取處于對數(shù)生長期的傳代細(xì)胞,接種在24孔板,隨機(jī)分為對照組、高糖組、烏梅有機(jī)酸(2 mg/ml)組、TGF-β1(5 ng/ml)組、烏梅有機(jī)酸(2 mg/ml)+TGF-β1(5 ng/ml)組。高糖組和用藥組細(xì)胞按照1.2.1中方法進(jìn)行高糖誘導(dǎo),同時烏梅有機(jī)酸組細(xì)胞以終濃度2 mg/ml的烏梅有機(jī)酸處理,TGF-β1組細(xì)胞以終濃度5 ng/ml的TGF-β1[12]處理,烏梅有機(jī)酸+TGF-β1組細(xì)胞以終濃度2 mg/ml的烏梅有機(jī)酸和終濃度5 ng/ml的TGF-β1聯(lián)合處理,48 h后收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞活力 取處于對數(shù)生長期的傳代細(xì)胞,以0.5×105個/ml的密度接種在96孔板,按照1.2.2中方法分組處理,通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞活力。

1.2.4 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6水平及Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原水平檢測 以細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PICP及PⅢNP含量來分別表示心肌成纖維細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原水平。取1.2.2中收集的各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液,離心取上清,以ELISA試劑盒測量其中TNF-α、IL-6、PICP及PⅢNP水平,具體操作參照各自說明書進(jìn)行。

1.2.5 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取1.2.2中收集的各組細(xì)胞,以高效RIPA裂解液于4 ℃裂解、離心,提取總蛋白,使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測出其濃度,混入適量上樣緩沖液,煮沸變性蛋白備用。運(yùn)用SDS-PAGE凝膠制備試劑盒配制分離膠及濃縮膠,取20 μg各組蛋白加入濃縮膠上樣孔中,110 V恒壓下電泳后濕轉(zhuǎn),均用時約1.5 h,以5%脫脂奶粉封閉PVDF膜上蛋白,截取蛋白條帶分別以兔源GAPDH、TGF-β1、Smad3、p-Smad3一抗孵育、洗膜,加入羊抗兔二抗孵育、洗膜,以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影后,使用凝膠成像系統(tǒng)拍照,運(yùn)用Quantity One軟件定量分析各蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度烏梅有機(jī)酸對高糖誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響

不同濃度烏梅有機(jī)酸可抑制高糖誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖,并隨劑量升高而作用增強(qiáng),IC50為1.92 mg/ml(見圖1)。

與0 mg/ml比較,*P<0.05圖1 不同濃度烏梅有機(jī)酸對高糖誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響 (n=6)Figure 1 Effects of different concentrations of organic acids from Fructus mume on proliferation of cardiac fibroblasts induced by high glucose (n=6)

2.2 各組細(xì)胞活力檢測結(jié)果

與對照組相比,高糖組細(xì)胞活力明顯升高(P<0.05);與高糖組相比,烏梅有機(jī)酸組細(xì)胞活力降低(P<0.05),TGF-β1組細(xì)胞活力升高(P<0.05);與烏梅有機(jī)酸組相比,烏梅有機(jī)酸+TGF-β1組細(xì)胞活力升高(P<0.05);與TGF-β1組相比,烏梅有機(jī)酸+TGF-β1組細(xì)胞活力降低(P<0.05,見表1)。

表1 不同處理后各組細(xì)胞活力Table 1 Cell viability in each group after different

2.3 各組細(xì)胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6水平檢測結(jié)果

與對照組相比,高糖組細(xì)胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6水平明顯升高(P<0.05);與高糖組相比,烏梅有機(jī)酸組細(xì)胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05),TGF-β1組細(xì)胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05);與烏梅有機(jī)酸組相比,烏梅有機(jī)酸+TGF-β1組細(xì)胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05);與TGF-β1組相比,烏梅有機(jī)酸+TGF-β1組細(xì)胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05,見表2)。

表2 不同處理后各組細(xì)胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6水平Table 2 TNF-α and IL-6 levels secreted by the cells in each group after different

2.4 各組細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原檢測結(jié)果

與對照組相比,高糖組細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原明顯升高(P<0.05);與高糖組相比,烏梅有機(jī)酸組細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原降低(P<0.05),TGF-β1組細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原升高(P<0.05);與烏梅有機(jī)酸組相比,烏梅有機(jī)酸+TGF-β1組細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原升高(P<0.05);與TGF-β1組相比,烏梅有機(jī)酸+TGF-β1組細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原降低(P<0.05,見表3)。

表3 各組細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原水平Table 3 The expression of type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen in cells in each

2.5 各組細(xì)胞TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

與對照組相比,高糖組細(xì)胞TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白p-Smad3/Smad3、TGF-β1表達(dá)明顯升高(P<0.05);與高糖組相比,烏梅有機(jī)酸組細(xì)胞TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白p-Smad3/Smad3、TGF-β1表達(dá)降低(P<0.05),TGF-β1組細(xì)胞TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白p-Smad3/Smad3、TGF-β1表達(dá)升高(P<0.05);與烏梅有機(jī)酸組相比,烏梅有機(jī)酸+TGF-β1組細(xì)胞TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白p-Smad3/Smad3、TGF-β1表達(dá)升高(P<0.05);與TGF-β1組相比,烏梅有機(jī)酸+TGF-β1組細(xì)胞TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白p-Smad3/Smad3、TGF-β1表達(dá)降低(P<0.05,見圖2,3)。

圖2 蛋白免疫印跡檢測各組細(xì)胞TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 2 Expression of TGF-β/Smad pathway related proteins in each group by Western blotting

3 討論

糖尿病作為一種代謝性疾病,患者因血糖長期處于高水平,而易導(dǎo)致DCM的發(fā)生,引發(fā)心功能障礙、心衰竭等臨床癥狀,心肌成纖維細(xì)胞的活化增殖在其中發(fā)揮著重要作用[13,14]。高糖可誘導(dǎo)炎癥發(fā)生,促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖,導(dǎo)致膠原過量沉積在細(xì)胞外,造成心肌纖維化變性[15,16]。在本實(shí)驗(yàn)中,高糖可導(dǎo)致心肌成纖維細(xì)胞活力、分泌的TNF-α、IL-6、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原水平明顯升高,表明高糖可誘導(dǎo)促炎因子過量表達(dá),引發(fā)炎癥,促使心肌成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成,揭示本文關(guān)于研究DCM的高糖細(xì)胞模型成功建立。

與對照組相比,*P<0.05;與高糖組相比,#P<0.05;與烏梅有機(jī)酸組相比,&P<0.05;與TGF-β1組相比,△P<0.05圖3 各組細(xì)胞TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 3 Expression of TGF-β/Smad pathway related proteins in each group

研究表明,抑制炎癥可延緩膠原合成沉積,減輕心肌纖維化[15,16]。烏梅作為一種安全性高的重要中藥材,具有鎮(zhèn)咳、抗菌、抗病毒、抗炎、抗纖維化、抗氧化、降血脂、降血糖等多種藥理作用,烏梅丸可補(bǔ)瀉兼施、寒熱并調(diào),減輕炎癥,對放射性腸炎具有很好的治療作用[17],烏梅湯和鹽酸二甲雙胍合用,可增強(qiáng)降血糖作用,改善胰島素抵抗癥狀,比各自單用療效更好[18],烏梅有機(jī)酸是提取自烏梅的有機(jī)酸類物質(zhì),可抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成,發(fā)揮明顯的抑菌作用[7]。本實(shí)驗(yàn)以0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mg/ml濃度烏梅有機(jī)酸處理高糖誘導(dǎo)的新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)烏梅有機(jī)酸呈劑量依賴性地抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖,根據(jù)IC50值,選出最佳藥物濃度,以此濃度再次處理上述細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)烏梅有機(jī)酸可明顯降低細(xì)胞活力、TNF-α、IL-6、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原分泌水平,表明烏梅有機(jī)酸可抑制高糖誘導(dǎo)的炎性因子過表達(dá),減少心肌成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成分泌,緩解心肌纖維化。

TGF-β1是一種轉(zhuǎn)化生長因子,具有很強(qiáng)的促纖維化作用,TGF-β1可激活Smad信號,增強(qiáng)Smad3的磷酸化,促進(jìn)膠原蛋白合成,引發(fā)組織纖維化,下調(diào)TGF-β/Smad信號通路蛋白表達(dá),可抑制心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá),防治心肌纖維化;敲除小鼠Smad3基因,可明顯緩解心肌間質(zhì)纖維化,減輕心肌不良重塑,修復(fù)心功能[19,20]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),以TGF-β1處理高糖誘導(dǎo)的新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞,可明顯激活Smad3磷酸化,加重心肌纖維化變性,烏梅有機(jī)酸可下調(diào)細(xì)胞TGF-β1表達(dá)及p-Smad3/Smad3,而以烏梅有機(jī)酸和TGF-β1聯(lián)合處理高糖誘導(dǎo)的新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞,可逆轉(zhuǎn)TGF-β1加重心肌細(xì)胞纖維化的作用,并減弱烏梅有機(jī)酸對心肌細(xì)胞纖維化的改善作用,表明烏梅有機(jī)酸可通過下調(diào)TGF-β/Smad信號通路延緩心肌纖維化。

綜上所述,烏梅有機(jī)酸可逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的促炎因子和膠原蛋白表達(dá)上調(diào),減輕炎癥,抑制細(xì)胞外基質(zhì)沉積,緩解心肌細(xì)胞纖維化,為臨床DCM的治療提供了新的參考,下調(diào)TGF-β/Smad通路是其藥理機(jī)制之一。但本研究只在細(xì)胞水平上進(jìn)行了研究,存在一定不足,后續(xù)還需動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證,進(jìn)而推廣到臨床治療中。