Msi1過表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖及干性維持的影響及其機(jī)制

劉 憲,張燕茹,2,陳 茜,馮 倩,2,崔 南*

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科,西安 710061;2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部;*通訊作者,E-mail:cuin2003@xjtufh.edu.cn)

宮頸癌是嚴(yán)重影響生活質(zhì)量、威脅女性健康的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤,是世界第四大高發(fā)腫瘤[1]。盡管宮頸癌的篩查和疫苗的推廣大大推進(jìn)了其早期發(fā)現(xiàn)與治療,但是宮頸癌發(fā)病年輕化及難治性宮頸癌仍然為臨床醫(yī)生面對(duì)的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。宮頸癌的發(fā)生需要一個(gè)漫長的過程,如不及時(shí)干預(yù)腫瘤將快速生長,甚至發(fā)生轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重降低了宮頸癌病人的生存期和生活質(zhì)量。

Msi1是RNA結(jié)合蛋白Musashi家族的成員之一,能夠通過對(duì)靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄后及翻譯環(huán)節(jié)發(fā)揮抑制或激活作用而調(diào)控靶基因的蛋白表達(dá)。以往研究顯示Msi1在多種腫瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)[2-5]。Msi1能夠特異性識(shí)別并結(jié)合靶基因的mRNA3′UTR區(qū),即(G/A)UnAGU(n=1-3),調(diào)控靶基因的表達(dá)[6-8]。Msi1不僅在神經(jīng)干細(xì)胞、胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮作用,而且還參與了腫瘤增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移及腫瘤干細(xì)胞的自我更新等過程,其中涉及了Notch、Akt、Wnt等多個(gè)通路。Msi1在宮頸癌的進(jìn)展中發(fā)揮何種作用研究仍較少。既往研究報(bào)道Msi1能夠加快宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期G0/G1-S轉(zhuǎn)換進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖[9],但Msi1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖調(diào)控作用是否存在其他途徑有待進(jìn)一步深入探討。Msi1對(duì)宮頸癌細(xì)胞干細(xì)胞樣特性的影響目前仍然不十分明確。因此,本研究擬構(gòu)建Msi1穩(wěn)定表達(dá)的宮頸癌SiHa、HeLa細(xì)胞系,通過裸鼠成瘤、細(xì)胞計(jì)數(shù)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察Msi1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、腫瘤形成能力的影響,通過腫瘤球培養(yǎng)的方法觀察Msi1對(duì)宮頸癌細(xì)胞干細(xì)胞樣特性的影響,通過報(bào)告基因分析、real-time PCR、Western blot探討Msi1通過何種機(jī)制對(duì)宮頸癌增殖及腫瘤干細(xì)胞樣特性發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

宮頸癌細(xì)胞系SiHa、HeLa購于美國模式培養(yǎng)物寄存庫(American Type Culture Collection, ATCC)。Msi1過表達(dá)載體由pCAG-IRES2-AcVEC-neo構(gòu)建(pCAG-IRES2-AcVEC-Msi1)并保存于西安交通大學(xué)環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞系SiHa、HeLa的DMEM培養(yǎng)基購自上海源培生物科技有限公司,胎牛血清購自美國Biological Industries公司,Msi1蛋白抗體購于中國臺(tái)灣Abnova公司,β-catenin、SOX2、GAPDH蛋白抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及Msi1穩(wěn)定表達(dá)宮頸癌細(xì)胞株的構(gòu)建

在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中接種人宮頸癌細(xì)胞系SiHa、HeLa細(xì)胞,于5% CO2、37 ℃常規(guī)培養(yǎng)。前期研究中,穩(wěn)定過表達(dá)Msi1的宮頸癌SiHa、HeLa細(xì)胞株已成功制備。在SiHa-Msi1組中選取兩個(gè)Msi1穩(wěn)定過表達(dá)的單克隆(分別編號(hào)為SiHa-Msi1-1和SiHa-Msi1-2),在SiHa-EGFP組中選取兩個(gè)單克隆(分別編號(hào)為SiHa-EGFP-1和SiHa-EGFP-2);在HeLa-Msi1組中選取兩個(gè)Msi1穩(wěn)定過表達(dá)的單克隆(分別編號(hào)為HeLa-Msi1-1和HeLa-Msi1-2),在HeLa-EGFP組中選取兩個(gè)單克隆(分別編號(hào)為HeLa-EGFP-1和HeLa-EGFP-2),以上細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),并均通過G418壓力篩選,以維持Msi1穩(wěn)定表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞在G418選擇性培養(yǎng)基中生長,并保存于本實(shí)驗(yàn)室[9]。

1.3 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測體內(nèi)腫瘤形成能力

通過此方法檢測不同組宮頸癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)形成的腫瘤的大小和質(zhì)量,評(píng)估Msi1過表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞體內(nèi)腫瘤形成能力的影響。選取4-6周雌性BALB/c裸鼠,分別將對(duì)數(shù)生長期的Msi1過表達(dá)的SiHa細(xì)胞(SiHa-Msi1)及其對(duì)照組(SiHa-EGFP)、Msi1過表達(dá)的HeLa細(xì)胞(HeLa-Msi1)及其對(duì)照組(HeLa-EGFP)注射入小鼠的背部兩側(cè)。準(zhǔn)備約200 μl含有1×106個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基混勻用于接種。于接種后每隔3 d用卡尺測量一次腫瘤大小,體積(mm3)按標(biāo)準(zhǔn)公式計(jì)算:長×寬2/2。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),解剖腫瘤,測量每只小鼠腫瘤的凈重。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)審定。

1.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測腫瘤細(xì)胞體外增殖速度

通過此方法檢測腫瘤細(xì)胞的體外增殖速度,以評(píng)估Msi1過表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響。本研究將5×104個(gè)Msi1過表達(dá)細(xì)胞及相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞分別接種于35 mm培養(yǎng)皿,并加入2 ml培養(yǎng)基,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別于接種后的第1,4,7天收取細(xì)胞,使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并記錄。

1.5 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤細(xì)胞惡性增殖能力

通過本方法檢測軟瓊脂中懸浮形成的腫瘤細(xì)胞單克隆數(shù)量,評(píng)估Msi1過表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞惡性增殖程度的改變。取對(duì)數(shù)生長期的Msi1過表達(dá)細(xì)胞及相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶處理使之成為單細(xì)胞,作活細(xì)胞計(jì)數(shù),用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/ml。用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖液,高壓滅菌后維持在40 ℃環(huán)境中保證其不發(fā)生凝固。將1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)等體積混合,取1 ml混合液注入6孔板中,冷卻凝固,可作底層瓊脂置于37 ℃、5% CO2溫箱中備用。將0.7%的瓊脂糖和配置好的2倍濃度的DMEM(2×DMEM)培養(yǎng)基等體積加入無菌管,再加入細(xì)胞懸液,使SiHa細(xì)胞(SiHa-Msi1,SiHa-EGFP)數(shù)量達(dá)3 000個(gè)/管,HeLa細(xì)胞(HeLa-Msi1,HeLa-EGFP)數(shù)量達(dá)5 000個(gè)/管,并使每管總體積達(dá)1 ml,充分混勻,注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中,形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后,置入37 ℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)14-28 d。將6孔板置于倒置顯微鏡下,觀察細(xì)胞克隆數(shù),計(jì)算形成率。每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.6 腫瘤球培養(yǎng)及連續(xù)腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤干細(xì)胞樣特性

通過計(jì)數(shù)原代細(xì)胞及成腫瘤球后重新種植后形成的腫瘤球數(shù)量,檢測Msi1過表達(dá)對(duì)宮頸癌干細(xì)胞樣特性的改變。收集對(duì)數(shù)生長期Msi1過表達(dá)細(xì)胞及相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞,接種于由DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、N2和B27補(bǔ)充劑(Invitrogen)、20 ng/ml人類重組表皮生長因子(EGF)和20 ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)組成的干細(xì)胞培養(yǎng)基。對(duì)于腫瘤球形成試驗(yàn),在96孔中以1個(gè)細(xì)胞/150 μl的密度接種細(xì)胞,在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。記錄2周內(nèi)出現(xiàn)的腫瘤球。收集96孔板中的腫瘤球,用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化細(xì)胞,并如上所述重新接種。連續(xù)傳代2次。每種細(xì)胞類型均設(shè)置為3個(gè)復(fù)孔,兩個(gè)人以盲法計(jì)數(shù)。

1.7 real-time PCR檢測基因mRNA的表達(dá)水平

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR

1.8 報(bào)告基因分析(TOP-Flash/FOP-Flash)檢測Wnt通路活性

將TOP-Flash reporter和pTK-RL質(zhì)粒用Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分別瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染到接種在24孔板的Msi1過表達(dá)細(xì)胞及相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞中,按照說明書使用雙熒光素酶分析試劑盒(Promega,Madison,WI,USA)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,在轉(zhuǎn)染后48 h測定Firefly和Renilla熒光素酶報(bào)告基因的活性。Firefly熒光素酶活性與Renilla熒光素酶活性的相對(duì)比值表示TOP-Flash報(bào)告基因活性。所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次,每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)管。

1.9 Western blot檢測Wnt通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

收集對(duì)數(shù)生長期的Msi1過表達(dá)細(xì)胞及相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞,收集細(xì)胞蛋白并進(jìn)行濃度定量。用SDS-PAGE分蛋白,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將PVDF膜用5%無脂牛奶封閉后,用抗人Msi1(1 ∶1 000稀釋)、β-catenin(1 ∶1 000稀釋)、SOX2(1 ∶1 000稀釋)、GAPDH(1 ∶1 000稀釋)的一抗4 ℃孵育過夜,洗膜,然后用二抗室溫孵育1 h,再次洗膜,最后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(Millipore,Billerica,MA,USA)進(jìn)行發(fā)光反應(yīng),通過Western blot化學(xué)發(fā)光成像一體機(jī)(陜西鑫來博生物工程有限公司)拍照、觀察。將目標(biāo)蛋白的Western blot結(jié)果與GAPDH的Western blot結(jié)果用ImageJ進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以進(jìn)行定量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Msi1過表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞的體內(nèi)腫瘤形成的影響

裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,裸鼠背部種植40 d,SiHa-Msi1組細(xì)胞形成的腫瘤質(zhì)量顯著大于SiHa-EGFP組(P<0.05),且腫瘤體積亦顯著大于SiHa-EGFP組體積(P<0.05,見圖1)。相似地,HeLa-Msi1組形成的腫瘤質(zhì)量顯著大于HeLa-EGFP組(P<0.05),腫瘤體積亦顯著大于HeLa-EGFP組(P<0.05,見圖1)。這些結(jié)果表明,Msi1過表達(dá)能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞在體內(nèi)的腫瘤形成。

圖1 Msi1過表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞的體內(nèi)腫瘤形成的影響Figure 1 Effect of Msi1 overexpression on tumor formation of cervical cancer cells in vivo in nude mice

2.2 Msi1過表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞體外增殖的影響

細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,細(xì)胞接種后第7天SiHa-Msi1組和HeLa-Msi1組細(xì)胞數(shù)量顯著高于相應(yīng)的對(duì)照組(P<0.05,見圖2)。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SiHa-Msi1組和HeLa-Msi1組細(xì)胞形成的單克隆數(shù)量顯著多于相應(yīng)的對(duì)照組(P<0.05,見圖3)。以上結(jié)果顯示,外源性過表達(dá)Msi1促進(jìn)了宮頸癌細(xì)胞的增殖能力。

圖2 細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測Msi1過表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞的體外增殖的影響Figure 2 Effect of Msi1 overexpression on the proliferation of cervical cancer cells in vitro by cytometry

圖3 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測Msi1過表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞的體外增殖的影響Figure 3 Effect of Msi1 overexpression on the proliferation of cervical cancer cells in vitro by soft agar colony formation assay

2.3 Msi1過表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性的影響

96孔板腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)中,SiHa-Msi1組細(xì)胞原代、初代腫瘤球形成的數(shù)量具有增多趨勢,且次代腫瘤球形成的數(shù)量顯著多于SiHa-EGFP組(P<0.05,見圖4);相似地,HeLa-Msi1組細(xì)胞原代、初代腫瘤球形成的數(shù)量具有增多趨勢,且次代腫瘤球形成的數(shù)量顯著多于HeLa-EGFP組(P<0.05,見圖4)。同時(shí),SiHa-Msi1組和HeLa-Msi1組細(xì)胞形成腫瘤球的直徑明顯大于相應(yīng)的對(duì)照組(P<0.001,見圖4)。以上結(jié)果顯示,外源性過表達(dá)Msi1顯著增強(qiáng)了宮頸癌細(xì)胞干細(xì)胞樣特性的維持。

圖4 Msi1過表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞干細(xì)胞樣特性的影響Figure 4 The effect of Msi1 overexpression on stem cell like characteristics of cervical cancer cells

2.4 Msi1過表達(dá)對(duì)干細(xì)胞相關(guān)因子及Wnt/β-catenin通路的作用

real-time PCR檢測Klf4、Oct4、Sox2、Aldh的mRNA水平的結(jié)果表明,SiHa-Msi1細(xì)胞與SiHa-EGFP細(xì)胞相比,Sox2、Oct4、Aldh的RNA水平顯著上調(diào)(P<0.05,見圖5),但Klf4的RNA水平無明顯變化(P>0.05);相似地,HeLa-Msi1細(xì)胞與HeLa-EGFP細(xì)胞相比,Sox2、Oct4、Aldh的RNA表達(dá)亦呈現(xiàn)顯著上調(diào)(P<0.05),但Klf4 的RNA水平無明顯變化(P>0.05,見圖5)。TOP-Flash/FOP-Flash實(shí)驗(yàn)檢測Wnt通路活性的結(jié)果顯示,與相應(yīng)對(duì)照組相比,SiHa-Msi1組和HeLa-Msi1組細(xì)胞中,Wnt通路活性顯著增強(qiáng)(P<0.05,見圖6)。Western blot結(jié)果顯示,與相應(yīng)對(duì)照組相比,SiHa-Msi1組和HeLa-Msi1組細(xì)胞中Wnt通路下游β-catenin、SOX2蛋白表達(dá)均上調(diào)(P<0.05,見圖7)。以上結(jié)果說明Msi1的表達(dá)可能活化了Wnt/β-catenin通路,從而上調(diào)SOX2的表達(dá)。

圖5 Real-time PCR檢測Msi1過表達(dá)對(duì)宮頸癌干細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)水平的變化Figure 5 Effect of Msi1 overexpression on stem cell related factors by real-time PCR

圖6 TOP-Flash/FOP-Flash檢測Msi1過表達(dá)對(duì)Wnt通路活性的作用Figure 6 Effect of Msi1 overexpression on Wnt pathway in cervical cancer by TOP-Flash/FOP-Flash

圖7 Western blot檢測Msi1過表達(dá)對(duì)Wnt通路下游蛋白的表達(dá)變化Figure 7 Effect of Msi1 overexpression on Wnt signaling downstream protein levels by Western blot

3 討論

宮頸上皮從不典型增生向原位癌、浸潤癌發(fā)展,甚至轉(zhuǎn)移至周邊及遠(yuǎn)處器官,宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)較為緩慢的過程。雖然HPV感染是一個(gè)重要的促癌因素,但在復(fù)雜的機(jī)體內(nèi)環(huán)境下多種抑癌和促癌因子的異常表達(dá)更是宮頸癌發(fā)生、發(fā)展、惡化的重要因素。在多種腫瘤中高表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白Msi1被認(rèn)為是一種促癌因子[6,10]。為探究Msi1蛋白高表達(dá)在宮頸癌細(xì)胞的作用,Msi1穩(wěn)定表達(dá)的宮頸癌SiHa、HeLa細(xì)胞株在前期研究中已成功構(gòu)建[9],并作為本研究的研究對(duì)象。在本研究中,細(xì)胞計(jì)數(shù)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示Msi1過表達(dá)增強(qiáng)了宮頸癌細(xì)胞的體外增殖能力;體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明Msi1過表達(dá)增強(qiáng)了宮頸癌細(xì)胞體內(nèi)腫瘤形成能力。通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn),本研究進(jìn)一步證實(shí)了Msi1促進(jìn)腫瘤增殖的作用,與既往研究結(jié)果一致[9]。

有研究表明,Msi1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌中促進(jìn)了腫瘤的干細(xì)胞樣特征[11,12]。本研究中原代培養(yǎng)的腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)中過表達(dá)Msi1的SiHa、HeLa細(xì)胞表現(xiàn)出了較強(qiáng)的腫瘤球形成能力,隨著傳代次數(shù)的增加,腫瘤形成的能力明顯增強(qiáng),說明Msi1對(duì)宮頸癌細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性維持具有促進(jìn)作用,亦進(jìn)一步驗(yàn)證了Msi1在惡性腫瘤中對(duì)腫瘤干細(xì)胞樣特性的影響。有研究表明,ALDH為宮頸癌干細(xì)胞標(biāo)記,Sox2表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞表現(xiàn)出了干細(xì)胞樣特性[13,14]。Oct4、Klf4是干細(xì)胞相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子,這些因子的表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展[15,16]。在本研究中,過表達(dá)Msi1的SiHa、HeLa細(xì)胞內(nèi)干細(xì)胞相關(guān)基因Sox2、Oct4、Aldh的RNA水平明顯增加,提示Msi1過表達(dá)促進(jìn)這些干細(xì)胞相關(guān)因子的激活,提示Msi1過表達(dá)可能通過活化了干細(xì)胞相關(guān)因子而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性。亦有研究顯示,Msi1表達(dá)減低,能夠降低CD133、Bmi1、Sox2、Oct4等腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物[17],與本研究結(jié)果相似。

以往研究顯示Msi1通過Wnt通路促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生存能力、侵襲及遷移能力、腫瘤干細(xì)胞的增殖能力[18,19]。本研究對(duì)Msi1過表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞中Wnt通路活性的作用進(jìn)行了驗(yàn)證,TOP-Flash/FOP-Flash實(shí)驗(yàn)提示經(jīng)典Wnt通路在Msi1過表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞中活性增加。β-catenin和SOX2作為Wnt通路的下游,同樣反映了Wnt通路的活性[20,21]。本研究中Western blot結(jié)果顯示β-catenin和SOX2蛋白表達(dá)上調(diào),說明Msi1的表達(dá)可能激活了經(jīng)典Wnt通路,從而促進(jìn)了宮頸癌細(xì)胞的增殖及干細(xì)胞樣特性。然而,Msi1通過調(diào)控何種靶基因發(fā)揮對(duì)Wnt通路的活性的激活作用仍有待進(jìn)一步探索。

綜上所述,本研究揭示了在宮頸癌細(xì)胞中Msi1過表達(dá)可能通過激活Wnt/β-catenin/Sox2通路促進(jìn)了宮頸癌細(xì)胞的增殖和干細(xì)胞樣特性,從而促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展,為探討Msi1能否作為宮頸腫癌診斷和治療的靶基因提供了一個(gè)更為穩(wěn)固的科研基礎(chǔ)。