基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究復(fù)健片治療缺血性腦卒中的作用機(jī)制

朱巍明 劉偉 劉源

摘要 目的：借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺技術(shù)探究復(fù)健片治療缺血性腦卒中（IS）的作用機(jī)制。方法：利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)與分析平臺（TCMSP）、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID）、Batman-TCM數(shù)據(jù)庫篩選出復(fù)健片中何首烏、桑寄生、決明子、淫羊藿、海馬的活性成分及其靶點(diǎn);利用Uniprot數(shù)據(jù)庫對復(fù)健片中靶點(diǎn)信息進(jìn)行校對;運(yùn)用GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取IS的疾病靶點(diǎn)基因;通過Cytoscape 3.7.2軟件及STRING 11.0數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行生物富集分析。結(jié)果：獲取復(fù)健片治療IS的共45個活性成分和144個靶點(diǎn)，關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及IL6、IL1β、TNF、VEGFA、NOS3等;IS相關(guān)靶點(diǎn)1 485個;獲得300條GO生物過程和84條相關(guān)信號通路，涉及PI3K-AKT信號通路、TNF信號通路、cGMP-PKG信號通路、cAMP信號通路、核因子κB信號通路等。結(jié)論：復(fù)健片是通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路相互作用的機(jī)制來達(dá)到治療IS的目的，通過本研究為復(fù)健片面向臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供理論支持，并為未來研究提供思路。

關(guān)鍵詞 中醫(yī)藥;復(fù)健片;缺血性腦卒中;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);蛋白質(zhì);靶點(diǎn);機(jī)制;通路

Abstract Objective：To investigate the mechanism of Fujian Tablets in the treatment of ischemic stroke（IS） with the help of Internet pharmacology platform technology.Methods：TCMSP，TCMID and Batmann-TCM databases were used to screen the active components and their targets of Polygonum multiflorum，sangjis-heng，Cassia obtusifolia，epimedium and hippocampus in Fujian Tablets;the target information in Fujian T-ablets was proofread by UniProt database; the disease target genes of IS were obtained by GeneCard-s database; Cytoscape 3.7.2 software and STRING 11.0 database were used to construct PPI network and conduct bio-enrichment analysis.Results：A total of 45 active components and 144 targets were obtained，including IL6，IL1 β，TNF，VEGFA，NOS3，etc.; 1485 IS related targets; 300 GO biological processes and 84 related signal pathways were obtained，involving PI3K-AKT signaling pathway，TNF signaling pathway，cGMP-PKG signaling pathway，cAMP signaling pathway，NF-κB signaling pathway，etc.Conclusion：Fujian Tablet through the mechanism of multi-component，multi-target，multi-channel interaction can achieve the purpose of treating IS.This research provides theoretical support for the further clinical application of Fujian tablets，and provides ideas for future experimental research.

Keywords Traditional Chinese medicine; Fujian tablet; Ischemic Stroke; Network Pharmacology; Protein; Target; Mechanism; Pathway

中圖分類號：R285文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.19.010

缺血性腦卒中（Ischemic Stroke，IS）具有高發(fā)病率、高致死率、高致殘率和高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，是全球第二大致死類疾病[1]，嚴(yán)重影響患者生命質(zhì)量，帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和社會負(fù)擔(dān)。IS屬于中醫(yī)“中風(fēng)”的范疇，肝腎陰虛是其發(fā)病的基礎(chǔ)且貫穿疾病全過程。復(fù)健片是全國名中醫(yī)王新陸教授多年臨床總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方，以滋補(bǔ)肝腎為主，彌補(bǔ)了祛風(fēng)化痰活血藥物辛溫燥烈之不足，臨床療效顯著。前期基礎(chǔ)研究表明，復(fù)健片可增加局部腦血流量，改善血腦屏障功能，上調(diào)GAP-43的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)軸突生長，從而改善大腦中動脈閉塞（ Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）大鼠運(yùn)動功能[2-3]，但因中藥復(fù)方的復(fù)雜性，其治療IS的潛在機(jī)制尚未完全明確。我們運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)預(yù)測和分析復(fù)健片治療IS的藥效成分和相關(guān)靶點(diǎn)，探討其作用機(jī)制，為復(fù)健片進(jìn)一步開發(fā)利用及基礎(chǔ)研究提供思路。

1 資料與方法

1.1 復(fù)健片化學(xué)成分的收集 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)與分析平臺（TCMSP）、中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine，Batman-TCM）、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID），分別以“桑寄生”“何首烏”“海馬”“決明子”“淫羊藿”為關(guān)鍵詞檢索復(fù)健片中的化合物成分。以藥物動力學(xué)原理為基礎(chǔ)，以口服藥物生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為篩選條件[4]，篩選活性成分。

1.2 復(fù)健片靶點(diǎn)篩選及“藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在TCMSP中檢索并篩選復(fù)健片活性成分及其相對應(yīng)的靶點(diǎn)，借助Uniprot數(shù)據(jù)庫（Universal Protein）對靶點(diǎn)的基因名稱進(jìn)行校正[5]。將靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)筑“藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析。

1.3 復(fù)健片治療缺血性腦卒中的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測 在人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards）中以“Ischemic Stroke”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，對疾病相關(guān)的基因進(jìn)行篩選，將其與1.2項(xiàng)下篩選得到的復(fù)方靶點(diǎn)相互映射，獲得IS疾病的潛在靶點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將1.3項(xiàng)下篩選得出復(fù)健片可能具有治療IS作用的潛在作用靶點(diǎn)輸入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，規(guī)定種屬為“Homo Sapiens”（人類），得到PPI關(guān)系并將數(shù)據(jù)保存為TSV格式文件。將所得文件導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2 軟件中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并分析篩選核心靶點(diǎn)。

1.5 靶點(diǎn)富集分析 為深入了解上述篩選出的復(fù)健片治療IS的潛在作用靶點(diǎn)基因的功能以及在信號通路中的作用，利用ClueGO插件進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析，DAVID數(shù)據(jù)庫（Database for Annotation，Visualization，and Integrated Discovery，DAVID）進(jìn)行京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，設(shè)置P<0.05，將物種定義為“Homo Sapiens”。按照其富集的靶點(diǎn)數(shù)目進(jìn)行排序，選取KEGG通路前20個條目進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)健片中活性成分的篩選 通過TCMSP、Batman-TCM、TCMID數(shù)據(jù)庫得到復(fù)健片中化合物共271個，其中18個來自何首烏（Batman-TCM數(shù)據(jù)庫獲?。?30個來自淫羊藿，9個來自海馬（TCMID數(shù)據(jù)庫中獲取），46個來自桑寄生，68個來自決明子。根據(jù)OB≥30%且DL≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)，篩選得出復(fù)健片的活性化合物共45個，其中5個來自何首烏，23個來自淫羊藿，1個來自海馬，2個來自桑寄生，14個來自決明子。見表1。

2.2 “藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析 分析網(wǎng)絡(luò)中包含188個節(jié)點(diǎn)（其中藥物節(jié)點(diǎn)5個，活性化合物節(jié)點(diǎn)45個，有6個未涉及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，以及144個靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）及802條邊。網(wǎng)絡(luò)中菱形代表復(fù)健片中的藥物，三角形代表復(fù)方活性化合物，靶基因用方形表示。在網(wǎng)絡(luò)中，每條邊表示節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的互作關(guān)系。度值表示節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的連接數(shù)目，運(yùn)用“Network analyze”插件進(jìn)行分析。根據(jù)活性化合物的等級值和中心度值篩選可知，排名前5位的分別為MOL000098-槲皮素、MOL000422-山柰酚、MOL000449-豆甾醇、MOL000006-木犀草素、MOL000471-蘆薈大黃素，可與89、56、44、42、33個靶基因相互作用。在靶點(diǎn)中，取排名前5位的靶點(diǎn)，分別是ESR1、AR、PTGS2、NCOA2、DPP4，分別能與31、30、29、24、24個活性化合物相互作用。見圖1。

2.3 復(fù)健片治療缺血性腦卒中核心靶點(diǎn)預(yù)測及篩選 運(yùn)用GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索的靶點(diǎn)共篩選得到1 485個IS的潛在靶點(diǎn)，運(yùn)用Venny 2.1在線工具繪制復(fù)健片活性成分靶點(diǎn)和IS靶點(diǎn)的韋恩圖，得到交集靶點(diǎn)共92個，即為預(yù)測復(fù)健片治療IS的潛在靶點(diǎn)。見圖2。

2.4 復(fù)健片治療缺血性腦卒中的核心靶點(diǎn)預(yù)測及分析 將篩選得到的92個潛在靶點(diǎn)輸入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫中，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。借助Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。見圖3。其中共包含90個節(jié)點(diǎn)，971條邊。按照度值高低降序排列，取排名前10位的靶點(diǎn)。見表2。

2.5 富集分析 通過ClueGO插件分析得到409個GO富集條目（P<0.05），其中包括44類細(xì)胞組分（Cell Component，CC）、65種細(xì)胞功能（Molecular Function，MF）和300個生物過程（Biological Processes，BP）。其中BP方面主要涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、積極調(diào)控細(xì)胞增殖、對缺氧的反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、氧化還原過程、老化、血管生成、化學(xué)突觸傳遞、MAPK活性的激活、蛋白水解凋亡等過程。MF方面，在蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)均二聚活性、酶結(jié)合、鋅離子結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、受體結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合、鈣離子結(jié)合、藥物結(jié)合等富集較為顯著。見圖4。

通過DAVID數(shù)據(jù)庫共篩選得到KEGG通路84條（P<0.05），主要涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用、PI3K-AKT信號通路、TNF信號通路、cGMP-PKG信號通路、cAMP信號通路、HIF-1信號通路、鞘脂信號通路、多巴胺能突觸、Rap1信號通路、MAPK信號通路、FoxO信號通路、VEGF信號通路、核因子κB信號通路等。富集基因數(shù)排名前20的通路利用氣泡圖進(jìn)行可視化。見圖5～6。

3 討論

缺血性腦卒中發(fā)病原因、病理過程及相關(guān)機(jī)制復(fù)雜多樣，長期以來缺乏有效的治療措施。中藥復(fù)方具有多靶點(diǎn)、多成分、多功效等優(yōu)勢，可針對卒中發(fā)生、發(fā)展的不同過程發(fā)揮療效[6-7]。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)健片可促進(jìn)下丘腦分泌和釋放多巴胺和去甲腎上腺素，通過神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)改善IS患者神經(jīng)功能缺損狀態(tài)[8]，同時研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)健片可促進(jìn)皮質(zhì)脊髓束的重塑，改善患者運(yùn)動功能[9]。基礎(chǔ)研究證明，復(fù)健片可促進(jìn)MCAO大鼠受損腦組織的局部血流量改善，上調(diào)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的表達(dá)，增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性[10]，同時證明復(fù)健片可抑制MCAO大鼠大腦皮質(zhì)及頸髓Nogo-A的表達(dá)，上調(diào)GAP-43的表達(dá)，誘導(dǎo)神經(jīng)元軸突再生，促進(jìn)皮質(zhì)脊髓束重建[2]。

為了進(jìn)一步研究復(fù)健片治療缺血性腦卒中的藥效基礎(chǔ)及潛在的生物學(xué)機(jī)制，我們利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺技術(shù)，篩選網(wǎng)絡(luò)中等級值和中心度值較為顯著的節(jié)點(diǎn)，所得節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中可能起到關(guān)鍵作用[4]。因此這種在活性化合物與靶點(diǎn)之間的多重對應(yīng)關(guān)系體現(xiàn)了中藥復(fù)方的復(fù)雜性，同時各成分與靶點(diǎn)之間相互作用可能是中藥復(fù)方發(fā)揮整體性治療的體現(xiàn)。通過篩選復(fù)健片271個化合物，獲得45個活性成分，篩選藥效靶點(diǎn)，獲得92個疾病與藥物交集靶點(diǎn)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，基因靶點(diǎn)富集分析及通路預(yù)測等手段，得到4個相關(guān)重要成分，分別是槲皮素、山柰酚、豆甾醇、木犀草素。其中槲皮素可與89個靶點(diǎn)蛋白發(fā)生作用，可見其是治療缺血性腦卒中關(guān)鍵成分。槲皮素具有神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、抗炎的作用，廣泛應(yīng)用于腦及脊髓損傷的動物模型中[11-13]，并得到不錯的療效。易波和戴宜武[14]認(rèn)為槲皮素可以通過保護(hù)神經(jīng)元及線粒體功能來減輕腦卒中后帶來的繼發(fā)性損害。槲皮素神經(jīng)保護(hù)功能已得到廣泛應(yīng)用，但槲皮素的藥理機(jī)制研究仍在深入，其臨床使用價值還在不斷進(jìn)行探索。而山柰酚同樣也具有抗炎、抗氧化的作用，且可顯著降低缺血再灌注腦組織局部氧自由基水平，減少細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)腦組織[15]。豆甾醇屬植物甾醇的一種，其在抗炎、抗氧化及中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)方面都發(fā)揮作用[16];有研究表明，植物甾醇亦在調(diào)節(jié)血脂，降低膽固醇等方面發(fā)揮重要作用[17]。木犀草素具有抗氧化、抗炎及抗過敏活性等作用[18-19]。喬會敏等[20]通過動物實(shí)驗(yàn)證明木犀草素可改善MCAO大鼠神經(jīng)功能缺失，減輕腦水腫，減小腦梗死的體積。

根據(jù)復(fù)健片治療缺血性腦卒中的PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果分析得出90個靶點(diǎn)，通過分析發(fā)現(xiàn)IL6、IL1β、VEGFA、TNF、NOS3等靶點(diǎn)可能是復(fù)健片治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。白細(xì)胞介素-6（IL-6）主要由活化的單核細(xì)胞產(chǎn)生，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時，單核細(xì)胞最早活化并產(chǎn)生IL-6，其是多功能性的，具有促進(jìn)炎癥發(fā)生及抗炎的雙重作用，在顱腦損傷及感染等情況發(fā)生時，IL-6表達(dá)水平上升，加重炎癥反應(yīng)，而在生理狀態(tài)下，IL-6可維持和調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生長[21-22]。白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）也屬于白細(xì)胞介素一種，有研究表明，下調(diào)其表達(dá)可抑制炎癥反應(yīng)，改善缺血性再灌注后的腦損傷[23]。腫瘤壞死因子（TNF）亦具有雙向調(diào)節(jié)，在腦缺血發(fā)生后水平顯著上升，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腦水腫、腦梗死等病變，而其也可增加腦組織對缺血的耐受程度[24]，其機(jī)制復(fù)雜尚待進(jìn)一步探索。在血管發(fā)成與形成過程中，血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）發(fā)揮著重要作用，楊冀萍和劉新峰[25]認(rèn)為血管內(nèi)皮生長因子在腦缺血損害時具有神經(jīng)保護(hù)作用，降低缺血性損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，其應(yīng)用可促進(jìn)血管芽生，實(shí)現(xiàn)缺血區(qū)的再灌注。動物實(shí)驗(yàn)也表明，血管內(nèi)皮生長因子可誘導(dǎo)缺血動物模型缺血區(qū)血管生成，趨化室管膜下區(qū)新生神經(jīng)元向缺血區(qū)遷移[26]。此外，一氧化氮合酶（NOS）與腦卒中的研究目前較少，NOS3屬NOS的一種，又稱為內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶（eNOS），有研究表明，其與腦缺血的發(fā)生相關(guān)[27]，仍須進(jìn)一步研究。環(huán)氧合酶2（COX2）在MCAO大鼠模型中的表達(dá)相比假手術(shù)組顯著升高，而且COX2的表達(dá)升高，可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，參與腦缺血的損傷，而COX2表達(dá)的減少有助于MCAO大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)[28-29]。

通過復(fù)健片治療缺血性腦卒中的靶點(diǎn)GO富集分析得出，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、氧化還原過程、血管生成、蛋白水解凋亡等生物過程可能發(fā)揮主要作用，在復(fù)健片抗缺血性腦卒中的治療中這些過程顯得較為重要。KEGG富集通路分析得出，復(fù)健片治療缺血性腦卒中的潛在靶點(diǎn)主要涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用、PI3K-AKT信號通路、TNF信號通路、cGMP-PKG信號通路、cAMP信號通路、核因子κB信號通路等。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，復(fù)健片治療缺血性腦卒的療效是否來源于與腦缺血關(guān)聯(lián)較為密切的PI3K-AKT信號通路、cGMP-PKG信號通路、核因子κB信號通路，仍須進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。其中，PI3K-AKT信號通路通過分析發(fā)現(xiàn)其應(yīng)用廣泛，且通路較為復(fù)雜。目前研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT信號通路與腦缺血發(fā)生后細(xì)胞的凋亡有密切關(guān)系，多種神經(jīng)營養(yǎng)因子、缺血后處理及中藥通過激活PI3K/AKT信號通路抑制細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)神經(jīng)的營養(yǎng)及保護(hù)作用[30-31]。而核因子κB信號通路的激活與靶點(diǎn)基因IL6及TNF合成與釋放有著直接的聯(lián)系。此外，有研究表明，cGMP-PKG信號通路參與調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生及細(xì)胞增殖過程并發(fā)生重要作用[32]，同時激活cGMP-PKG信號通路可促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，改善缺血后小鼠的神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能[33]。

綜上所述，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法證明復(fù)健片治療缺血性腦卒中具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，并從多個角度探討復(fù)健片治療缺血性腦卒中的潛在作用機(jī)制及靶點(diǎn)，并為復(fù)健片的臨床應(yīng)用提供理論支持，同時為復(fù)健片的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供思路。但本研究仍有一定的局限性，由于數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)及相關(guān)文獻(xiàn)有限，所預(yù)測得出復(fù)健片治療靶點(diǎn)所展示的相關(guān)通路，其機(jī)制研究仍需進(jìn)一步深入研究。

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（2020-08-20收稿 責(zé)任編輯：張雄杰）