miR-3607在胃癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性研究

張乙川,李 玲,楊成俊,王 飛,劉珂良

(1.攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院消化疾病中心微創(chuàng)內(nèi)鏡中心,四川 攀枝花 617000；2.攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院消化疾病中心消化內(nèi)科,四川 攀枝花 617000)

胃癌是常見的惡性腫瘤之一,多數(shù)患者在初次就診時已為中晚期,導(dǎo)致其生存率較低[1-2]。因此有必要進(jìn)一步闡明胃癌發(fā)生和發(fā)展的分子生物學(xué)機制,尋找有效的分子標(biāo)記物,這將有助于胃癌的早期診斷,從而提高患者生存率,改善不良預(yù)后[3]。microRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA,主要由單鏈RNA前體加工產(chǎn)生,長度一般為19～24 nt[4-5]。miRNA可影響細(xì)胞的增殖、分化、遷移、侵襲和凋亡,并參與各種疾病和腫瘤的生物學(xué)過程,探索miRNA的表達(dá)和相應(yīng)的信號通路將為腫瘤的治療提供新的藥物靶點[6]。近年來,越來越多的學(xué)者致力于研究miR-3607的表達(dá)與腫瘤的關(guān)系,Liu等[7]使用miRCURY array LNA miRNA芯片評估在胃癌組織和正常組織之間的異常miRNA表達(dá)譜,其中miR-3607在胃癌組織中為異常低表達(dá),故miR-3607在胃癌中可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展,但其在胃癌中的臨床和功能性作用鮮有報道。因此,深入了解miR-3607在胃癌中的臨床意義和潛在作用機制對于尋找新的胃癌生物標(biāo)志物及潛在治療靶點具有重要的價值。本研究通過檢測miR-3607在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平,初步探討了miR-3607在胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用,分析了其在胃癌預(yù)后評估中的價值,旨在為臨床胃癌患者的治療提供新的分子靶點和治療策略。

1 材料與方法

1.1 患者和組織樣本

選取2013～2015年在攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院進(jìn)行胃癌切除術(shù)的117例患者。經(jīng)手術(shù)切除分別獲得直徑為0.5 cm的胃癌組織和4 cm的相鄰正常組織(癌旁組織)樣本。新鮮樣本立即于液氮中冷凍,于-80 ℃保存?zhèn)溆?。所有胃癌樣本均?jīng)病理確診。參與試驗的所有患者術(shù)前均簽署知情同意書。本研究獲得攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(201311001)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

胃癌細(xì)胞系(HGC-27、NCI-N87、AGS、MKN45)和正常上皮細(xì)胞系(GES-1)均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(中國上海)。所有細(xì)胞均在37 ℃、5% CO2環(huán)境下,含10%胎牛血清(FBS,GIBCO)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone)中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長到50%～80%時,按照Lipofectamine 3000試劑說明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,美國),將miR-3607 mimic、miR-3607 inhibitor、mimic NC、inhibitor NC轉(zhuǎn)染至HGC-27和MKN45細(xì)胞內(nèi)(未處理細(xì)胞為Control)用于后續(xù)實驗。

1.3 總RNA提取和實時定量PCR(qRT-PCR)分析

采用Trizol法提取總RNA(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,Waltham,美國)。NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Fisher Scientific,Waltham,美國)用來定量RNA。嚴(yán)格按照PrimeScript RT試劑盒(Takara,Otsu,Japan)說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在ABI 7500 PCR系統(tǒng)上,按照SYBR-Green I Master混合試劑盒的說明書進(jìn)行qRT-PCR(Thermo Fisher Scientific,Waltham,美國)分析。反應(yīng)條件：94 ℃變性10 min,接著35個循環(huán)94 ℃,30 s；58 ℃,30 s；72 ℃,30 s。PCR引物序列：miR-3607 上游5’-GGGACTGTAAACGCTT-3’，下游5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；U6上游5’-GCT-TCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游 5’-CGCTT-CACGAATTTGCGTGTCAT-3’。采用2-ΔΔCt方法計算miR-3607的相對表達(dá)水平并將其歸一到內(nèi)參基因U6。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力

在96孔板上進(jìn)行細(xì)胞增殖實驗,每孔2×103個細(xì)胞?？字屑尤?0 μL CCK-8溶液(Dojindo,Kumamoto,日本),于37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)2 h,450 nm處測量其吸光度,實驗平行重復(fù)3次。

1.5 Transwell法檢測細(xì)胞遷移及侵襲能力

利用Transwell實驗檢測細(xì)胞的侵襲和遷移能力。在進(jìn)行細(xì)胞侵襲實驗之前，基質(zhì)被預(yù)涂到Transwell的上腔室中，然后在上腔室加入100 μL無血清培養(yǎng)基配制細(xì)胞懸浮液,下室加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h后,固定30 min并用0.1%結(jié)晶紫染色20 min。在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)并計數(shù)。遷移實驗Transwell上腔室不需要預(yù)涂基質(zhì),其他步驟與侵襲實驗相同。

1.6 胃癌患者臨床病歷資料收集和預(yù)后分析

根據(jù)電子病歷收集并記錄所有患者的臨床資料,主要包括年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期。根據(jù)胃癌患者組織中miR-3607的平均表達(dá)值,將患者分為低表達(dá)組和高表達(dá)組。術(shù)后2年內(nèi)每3個月隨訪1次,隨后每6個月隨訪1次,最后1年隨訪1次,收集患者5年總生存隨訪記錄。結(jié)合miR-3607在組織中的表達(dá)水平和總生存率,使用Kaplan-Meier和多因素Cox回歸分析評估m(xù)iR-3607在胃癌中的預(yù)后價值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。2組間均數(shù)比較采用t檢驗,多組間比較采用one-wayANOVA分析。采用Kaplan-Meier繪制患者的總體生存曲線，Cox比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行多因素分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中miR-3607表達(dá)水平

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,miR-3607在胃癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖1a。與正常上皮細(xì)胞系GES-1相比,胃癌細(xì)胞系HGC-27、NCI-N87、AGS、MKN45中miR-3607的表達(dá)水平較低(P<0.001),見圖1b。

a：胃癌組織和癌旁組織中miR-3607的表達(dá)；b：胃癌細(xì)胞系中miR-3607的表達(dá) *：與癌旁組織比較,P<0.05；#：與GES-1比較,P<0.001

2.2 miR-3607下調(diào)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

qRT-PCR結(jié)果顯示,與Control相比,miR-3607 mimic中miR-3607的表達(dá)顯著增加,而miR-3607inhibitor中miR-3607的表達(dá)降低(P<0.001),見圖2a。CCK-8法檢測結(jié)果顯示,與Control相比,miR-3607的低表達(dá)可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖,而高表達(dá)的miR-3607可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖(P<0.05),見圖2b。Transwell法檢測HGC-27和MKN45細(xì)胞的遷移和侵襲能力,結(jié)果顯示,與Control相比,miR-3607的低表達(dá)顯著增強了胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力(P<0.05),見圖3。

a:qRT-PCR檢測miR-3607在HGC-27和MKN45細(xì)胞中的表達(dá)水平；b:CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 #：與Control比較,P<0.001；*：與Control比較,P<0.05

a：細(xì)胞遷移能力；b：細(xì)胞侵襲能力 #：與Control比較,P<0.001；*：與Control比較,P<0.05

2.3 胃癌患者臨床特征與miR-3607表達(dá)的關(guān)系

根據(jù)miR-3607表達(dá)的平均值將患者分為低表達(dá)組(n=60)和高表達(dá)組(n=57)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),miR-3607的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.037)和TNM分期(P=0.032)相關(guān),而與患者的年齡、性別、腫瘤大小和分化程度無關(guān)(P>0.05)，見表1。

表1 miR-3607表達(dá)與胃癌患者臨床特征的相關(guān)性(例)

2.4 miR-3607表達(dá)下調(diào)與胃癌患者預(yù)后不良的相關(guān)性

3 討論

胃癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤,近年來引起了人們的廣泛關(guān)注[8-9]。胃癌的發(fā)病機制復(fù)雜多樣,涉及許多生物遺傳和表觀遺傳學(xué)變化[10-11]。目前,越來越多的證據(jù)表明，miRNAs在多種人類癌癥的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用[12-14]。這些小的非編碼RNA具有調(diào)控基因表達(dá)的能力,通常參與多種生物過程中的關(guān)鍵過程,如癌變。有證據(jù)表明,miRNA可以影響胃癌細(xì)胞的增殖、分化、凋亡,并參與胃癌的病理過程[15-16]。因此,miRNA在胃癌的診斷及預(yù)后評估等方面具有重要的作用。

miR-3607的異常表達(dá)與多種癌癥的進(jìn)展密切相關(guān)。有研究顯示,miR-3607通過靶向TGFBR1和CCNE2抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移,其在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)下調(diào),并與患者預(yù)后相關(guān),可以作為非小細(xì)胞肺癌的潛在非侵入性生物標(biāo)志物[17]。然而miR-3607的表達(dá)在胃癌中發(fā)揮的作用尚不清楚。本研究結(jié)果顯示,miR-3607在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織,且在胃癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)；此外,miR-3607低表達(dá)的患者多數(shù)表現(xiàn)為TNM晚期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。且有研究表明,miR-3607在肝癌和結(jié)直腸癌中同樣表現(xiàn)為低表達(dá)并參與腫瘤進(jìn)展[18-19]。說明miR-3607的下調(diào)同樣可能參與了胃癌的進(jìn)展。

圖4 胃癌患者生存時間的Kaplan-Meier曲線

表2 多因素Cox回歸分析

由于miR-3607在胃癌組織和高侵襲細(xì)胞系中低表達(dá),我們推測miR-3607可能在胃癌中發(fā)揮抑癌的作用。為了驗證這一點,本研究評估了miR-3607對胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,結(jié)果顯示,miR-3607低表達(dá)顯著提高了胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,而miR-3607高表達(dá)則降低了細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,這提示miR-3607高表達(dá)可能在胃癌中發(fā)揮抑制作用。有研究顯示,miR-3607在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)降低提示不良預(yù)后,而其在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)會抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,這為肝癌的治療和預(yù)后提供了新的方向[18]。本研究進(jìn)一步研究了miR-3607在胃癌中的預(yù)后意義,結(jié)果顯示,miR-3607低表達(dá)的患者預(yù)后較差且是獨立預(yù)后風(fēng)險因子，表明miR-3607可能作為胃癌患者預(yù)后不良的潛在預(yù)測因子。然而miR-3607在胃癌中的具體作用機制尚未闡明,其在胃癌中的臨床預(yù)后價值還需進(jìn)一步確認(rèn),在以后的工作中,我們會對此進(jìn)行深入研究。

綜上所述,miR-3607在胃癌組織和細(xì)胞系中顯著下調(diào),并且與患者生存期短有關(guān),是影響胃癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素,其可能成為預(yù)測胃癌患者預(yù)后不良的生物標(biāo)志物。此外,miR-3607高表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,表明miR-3607有望成為胃癌的潛在治療靶點。