多汁乳菇多糖對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用

王秋艷，丁慧敏，朱亞男，黃馨閱，陶明煊

（南京師范大學食品與制藥工程學院, 江蘇南京 210046）

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是常見的肝臟疾病。近年來隨著人們飲酒習慣的改變和飲酒人數(shù)的增加，發(fā)病率正在逐年上升。長期過量飲酒會導致酒精性肝臟中毒，進而逐步引起肝臟炎癥、纖維化或硬化的發(fā)生，不加控制還會惡化成癌癥，嚴重危害人體健康[1-3]。ALD早期病癥表現(xiàn)為急性的酒精性損傷，主要是短期內(nèi)大量酒精及其代謝產(chǎn)物本身對肝臟具有一定毒性，且體內(nèi)酒精代謝過程中還會出現(xiàn)氧化應激和脂質(zhì)過氧化反應，都會對肝臟組織造成一定的損傷[4-6]。

食用菌多糖作為一種具有極高抗氧化活性的天然產(chǎn)物，毒性小、安全性高，可以通過提高機體內(nèi)抗氧化酶的活性和抑制代謝過程中的脂質(zhì)過氧化反應來減弱酒精造成的肝臟組織中毒損傷[7-9]。目前國內(nèi)外對多汁乳菇多糖（Refined polysaccharide fromLactarius volemusFr）的研究主要集中在分離鑒定、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等方面[10-12]，而其在酒精作用下對肝臟的保護狀況尚未有報道，因此，本實驗通過研究多汁乳菇精多糖（RPLV）對酒精性肝損傷的保護作用，擬為天然藥物和保健品開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ICR 雄性小鼠（8周齡） 55只，體重 32±2 g，動物試驗在南京師范大學動物飼養(yǎng)中心進行，動物飼養(yǎng)許可證號（SYXK（蘇）2015-0028），飼養(yǎng)溫度保持在23±2 ℃，濕度保持在 50%±5%，每天照明 12 h，晝夜交替；多汁乳菇精多糖 采用水提醇沉法并通過Sevage法除蛋白后得到的純度為66.44%；丙二醛（malondialdehyde，MAD）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate amino transferase，AST）、甘油三酯（triglyceride，TG）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，ALT）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；聯(lián)苯雙酯滴丸 浙江醫(yī)藥有限公司新昌制藥廠；甲醛、戊二醛 南京化學試劑有限公司；四氧化鋨中國上海試劑三廠。

754紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；YD-6L型全自動生物組織包埋機 浙江金華益迪醫(yī)療設備廠；HMIAS-2000彩色醫(yī)學圖文分析系武漢千屏影像技術有限公司；CKX41組織培養(yǎng)用顯微鏡 日本OLYMPUS公司；H-7650日立透射電鏡（TEM） 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酒精誘導急性肝損傷動物模型的建立 55只小鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，隨機分為空白對照組、模型組、陽性對照組（聯(lián)苯雙酯150 mg/kg·BW）、RPLV低、高劑量組（100、400 mg/kg·BW），每組 11 只。每日同一時間段進行灌胃，連續(xù)30 d，實驗期間不限制飲食飲水，并每天對小鼠進行稱重，以調(diào)整受試樣品的劑量。實驗31 d，所有小鼠禁食12 h，空白組以外的各組均灌予50%的乙醇溶液（12 mL/kg），建立動物模型。12 h后，每組取8只小鼠，取血后處死小鼠，快速解剖并取出肝臟，沖洗稱重冷藏備用。

1.2.2 血液指標測定 取眼球血于抗凝管中，12 h內(nèi)用全血細胞分析儀測定外周白細胞、紅細胞和血小板含量。取血并分離血清，參照試劑盒要求測定小鼠血清中的 SOD、CAT、GSH-Px、ALT、AST活力和MDA、GSH以及TG含量。

1.2.3 肝臟組織指標測定 取處死小鼠肝臟，漂洗并吸干水分，稱重計算肝臟指數(shù)（肝臟指數(shù)（mg/g）=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量）。10%肝臟勻漿液低溫離心10 min（10000 r/min），取澄清液參照試劑盒要求測定小鼠肝臟中的SOD、CAT、GSH-Px、ALT、AST活力和MDA、GSH以及TG含量。取小塊肝臟組織，經(jīng)過24 h以上的4%多聚甲醛溶液固定，洗滌脫水，浸蠟包埋，切片展開等步驟，最后將其染色（蘇木精-伊紅，Hematoxylin-eosin，HE），置于普通顯微鏡下觀察，即得到清晰的肝臟組織結(jié)構。取1 mm3肝臟左葉中部組織，經(jīng)2 h的2.5%戊二醛和2～3 h的1%鋨酸固定，再經(jīng)洗滌脫水，丙酮包埋劑浸透，固化等步驟制成切片，染色（3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛）后用透射電鏡觀察肝臟超微結(jié)構。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計系統(tǒng)對實驗數(shù)據(jù)進行處理，通過單因素方差分析對各組數(shù)據(jù)間是否存在顯著性進行分析驗證，結(jié)果以平均值±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPLV對小鼠體重增長的影響

實驗期間，每天對小鼠稱重一次并記錄，小鼠體重增長情況如表1所示：第30 d，RPLV高、低劑量組小鼠平均體重分別增長13.69%、11.36%，且與空白組、模型組相比差異不明顯。實驗過程中，5組小鼠的攝食、飲水、毛色光澤度、精神狀態(tài)、活躍程度等方面表現(xiàn)均相似，健康無死亡情況，可初步判斷RPLV對小鼠無毒性作用。

表1 RPLV對小鼠體重增長的影響（g, n=8）Table 1 Effect of RPLV on body weight increase of mice(g, n=8)

2.2 RPLV對小鼠造血能力的影響

過量飲酒會對體內(nèi)細胞產(chǎn)生毒性，會使血液濃稠，流動性變差，進而導致血栓；同時酒精也會干擾細胞結(jié)構，使血液細胞膜溶解，導致細胞破裂，進而產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。因此，過量飲酒會對體內(nèi)血液細胞產(chǎn)生干擾，引起血液中紅細胞、白細胞等的變化，導致疾病[13-14]。

由表2可知，模型組小鼠血液中紅細胞、白細胞及血小板含量相較于空白組顯著降低（P＜0.01），說明造模成功。小鼠灌胃受試多糖后，劑量越高，WBC、RBC、PLT越高，兩者呈一定的量效關系。RPLV高劑量組所測三個指標與陽性對照組水平接近，且相較于模型組，WBC增長了85.77%；RBC增長了63.58%；血小板增長了28.66%。表明RPLV可有效減輕酒精肝損傷，可明顯恢復和改善肝損傷小鼠骨髓造血功能。

表2 RPLV對小鼠外周血白細胞、紅細胞和血小板數(shù)量的影響（n=8）Table 2 Effect of RPLV on the number of peripheral white blood cell (WBC), red blood cell (RBC) and blood platelet (PLT) in mice(n=8)

2.3 RPLV對小鼠血液中SOD、MDA、CAT、GSHPx和GSH水平的影響

短時間內(nèi)攝入過量酒精，導致機體酒精代謝過程中產(chǎn)生了大量性質(zhì)活潑的超氧陰離子等活性氧成分，會加速體內(nèi)細胞老化，導致機體產(chǎn)生過氧化的損傷。因此，可以通過測定抗氧化系統(tǒng)里SOD、CAT、GSH-Px、GSH指標的變化分析機體抗氧化能力的大小[15-16]。同時酒精在代謝過程中，也會誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應，進而使體內(nèi)細胞損傷并產(chǎn)生脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物（MDA）。因此也可通過測定反映機體脂質(zhì)過氧化水平的MDA含量，間接反映出機體因過氧化造成的損傷情況[17]。

由表3可知，模型組血液中SOD、CAT、GSHPx活力和MDA、GSH含量與空白組有顯著性差異（P＜0.01），說明造模成功。小鼠灌胃受試樣品后，SOD、CAT、GSH-Px活力與GSH含量隨著受試樣品濃度的增加不斷增大，而MDA含量則不斷降低，都呈現(xiàn)一定的量效關系。RPLV高劑量組所測結(jié)果與陽性組水平接近，且相較于模型組，SOD活力增長了29.26%；MDA含量降低了43.70%；CAT活力增長了48.95%；GSH-Px活力增長了14.53%；GSH含量增長了64.29%。表明RPLV可有效提高抗氧化酶或抗氧化因子的活性，清除酒精代謝過程中產(chǎn)生過多自由基，抑制體內(nèi)有害反應，增強肝臟代謝脂質(zhì)的能力，從而減輕肝臟損害程度。

表3 RPLV對小鼠血液中SOD、MDA、CAT、GSH-Px和GSH水平的影響（n=8）Table 3 Effect of RPLV on the SOD, MDA, CAT, GSH-Px and GSH level in blood of mice(n=8)

2.4 RPLV對小鼠血清中TG、ALT和AST水平的影響

由表4可知，實驗第31 d，模型組血清中ALT、AST活力和TG含量相較于空白組顯著升高（P＜0.01）。楊夢等[18]研究表明：酒精建模后，模型組小鼠血清ALT、AST、TG 水平顯著高于空白組（P＜0.01），這與本實驗結(jié)果一致，說明造模成功。RPLV各劑量組小鼠血清中AST活力和TG含量相較于模型組顯著性降低（P＜0.05或P＜0.01）；且血清中 ALT、AST、TG水平隨著樣品劑量的增加不斷降低，呈一定的量效關系；RPLV高劑量組小鼠血清AST、ALT水平與陽性對照組接近，且血清中TG減少量高于陽性組。由此可見RPLV能有效減輕因酒精作用導致的ALT、AST、TG水平異常升高，對酒精性肝損傷有一定的保護效果。

表4 RPLV對小鼠血清中ALT、AST、TG水平的影響（n=8）Table 4 Effect of RPLV on ALT、AST level in serum of mice(n=8)

2.5 RPLV對小鼠肝臟指數(shù)的影響

肝臟遭受酒精損傷時，會呈現(xiàn)細胞腫大情況，同時在脂肪代謝過程中，還易出現(xiàn)代謝紊亂現(xiàn)象，使脂肪堆積在肝細胞中，造成肝臟整體質(zhì)量和體積的增加，肝臟指數(shù)異常升高。因此，肝臟指數(shù)可用于反映肝臟受損情況。由表5可知，模型組肝臟指數(shù)相較于空白組顯著升高（P＜0.05），說明模型組小鼠肝臟受到了一定損傷。RPLV高、低劑量組相較于模型組肝臟指數(shù)降低，且高劑量組相較于模型組顯著（P＜0.05）降低。表明RPLV對酒精作用下的肝臟有一定的保護效果。

表5 RPLV對小鼠體重和肝臟指數(shù)的影響（n=8）Table 5 Effect of RPLV on body weight and liver index of mice(n=8)

2.6 RPLV對小鼠肝臟中SOD、MDA、CAT、GSHPx和GSH水平的影響

由表6可知，模型組小鼠肝臟中SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA、GSH含量與空白組有極顯著性差異（P＜0.01），說明造模成功。小鼠灌胃RPLV后，SOD、CAT、GSH-Px活力與GSH含量隨著樣品濃度的增加不斷增大，而MDA含量隨著濃度的變大不斷降低，兩者都呈現(xiàn)一定的量效關系。RPLV高劑量組所測結(jié)果與陽性對照組水平相近，且相較于模型組，SOD活力增長20.40%；MDA含量降低39.95%；CAT活力增長46.69%；GSH-Px活力增長63.32%；GSH含量增長119.49%。表明RPLV具有一定的抗氧化作用，可有效提高小鼠肝臟的抗氧化酶或抗氧化因子的活性，減小代謝酒精過程中產(chǎn)生的氧化應激和脂質(zhì)過氧化反應，對急性酒精性肝損傷有一定的保護作用。

表6 RPLV對小鼠肝臟中SOD、MDA、CAT、GSH-Px和GSH水平的影響（n=8）Table 6 Effect of RPLV on the SOD, MDA, CAT, GSH-Px and GSH level in liver of mice(n=8)

2.7 RPLV對小鼠肝臟中TG、ALT和AST水平的影響

由表7可知，酒精造模后，模型組小鼠肝臟中ALT、AST、TG水平與空白對照組有顯著性差異，即其酶活和含量遠高于空白組水平（P＜0.01）。RPLV高、低劑量組小鼠肝臟ALT、AST、TG水平隨著劑量的增加而不斷地降低，兩者呈一定的量效關系；RPLV高劑量組小鼠肝臟ALT、AST活力與陽性對照組接近，且RPLV高劑量組相比于陽性對照組更能降低小鼠TG含量。表明RPLV能有效降低酒精性肝損傷組織中的ALT、AST、TG水平，對急性酒精性肝損傷有一定的改善作用。

表7 RPLV對小鼠肝臟中ALT、AST、TG活力的影響（n=8）Table 7 Effect of RPLV on ALT, AST, TG activity in liver of mice(n=8)

2.8 RPLV對小鼠肝組織病理變化的影響

如圖1所示，空白對照組小鼠肝細胞結(jié)構正常，形態(tài)規(guī)整，細胞核呈圓形，整體細胞染色均勻，間隔清晰，未見變性壞死細胞和炎細胞浸潤現(xiàn)象。模型組小鼠肝組織出現(xiàn)嚴重病變，組織結(jié)構紊亂，中央靜脈顯著擴大且嚴重變形，肝細胞腫脹甚至發(fā)生崩解，出現(xiàn)成片壞死現(xiàn)象，細胞核碎裂、溶解嚴重，胞漿稀松，細胞間間隙模糊，可見小泡性脂變，且炎癥細胞浸潤現(xiàn)象嚴重。陽性對照組和RPLV各劑量組小鼠肝細胞組織損傷得到明顯改善，細胞核破裂現(xiàn)象減少、肝細胞腫脹崩解程度減輕，炎性浸潤和空泡變性等情況都有所減輕；且RPLV高劑量組肝組織受損情況遠小于低劑量組，只出現(xiàn)輕微損傷，整體肝細胞完整，細胞核形狀規(guī)則，胞漿豐富，中央靜脈輕微腫脹，無細胞壞死及脂變現(xiàn)象。表明RPLV可有效改善急性酒精性肝損傷，且劑量越高，效果越佳。

圖1 RPLV對小鼠肝組織病理切片的影響（100×）Fig.1 Effects of RPLV on pathological section in liver of mice(100×)

2.9 小鼠肝臟超微結(jié)構分析

由圖2可知，空白組中肝細胞形態(tài)結(jié)構清晰完整。而模型組受損肝細胞可明顯看出細胞核嚴重變形，核膜、核仁皺縮，形狀不規(guī)則，染色質(zhì)異常分布；且線粒體出現(xiàn)畸形，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變形，核糖體脫落消失，細胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡。相較于模型組，陽性組及RPLV高、低劑量組細胞受損情況改善明顯；其中低劑量組還會出現(xiàn)細胞核形狀不規(guī)則，核糖體脫落，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂等情況，但相比于模型組，線粒體形狀相對規(guī)則，脂滴數(shù)目有所減少，細胞內(nèi)空泡數(shù)量也有所減少；各高劑量組中，細胞核已近似圓形，核膜較完整細胞質(zhì)均勻，只出現(xiàn)輕微內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹及核糖體脫落現(xiàn)象，視野內(nèi)也未見脂滴。由小鼠肝臟細胞的超微結(jié)構再次驗證，在急性酒精性損傷下的，RPLV能保護肝臟細胞，且保護效果與劑量呈正相關。

圖2 RPLV對急性酒精肝損傷小鼠肝組織超微結(jié)構的影響Fig.2 Effects of RPLV on ultrastructure in liver of mice

3 結(jié)論與討論

酒精性肝病作為全球最常見的慢性肝病，目前已經(jīng)與吸煙、高血壓并稱為人體三大致死原因[19]。ALD的發(fā)病率隨著飲酒人數(shù)的增加呈逐年上升趨勢，臨床藥物如美他多辛、糖皮質(zhì)激素等，雖有一定改善效果，但不適合長期服用，治療效果有限。由于尚不明確ALD的發(fā)病機理，且有效的臨床治療方案也不明晰，因此，尋找天然、安全性高的藥物治療酒精性肝病具有廣闊的發(fā)展前景[20-21]。

短期攝入大量酒精，由于機體無法及時清除代謝產(chǎn)生的過量自由基，就會擾亂機體抗氧化水平的平衡，從而導致主要抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性及抗氧化劑GSH含量出現(xiàn)異常；同時酒精代謝過程中發(fā)生的脂質(zhì)過氧化，也會引起終產(chǎn)物MDA的變化[22-24]。過量飲酒還會導致肝臟無法及時分解酒精，主要存在于肝細胞中的轉(zhuǎn)氨酶（ALT和AST）在肝受損后會因細胞膜和線粒體結(jié)構破壞，通透性改變，從細胞中逸出，再進入血液，此時血清中ALT、AST活力會顯著升高[25-26]。因此，ALT、AST常用于評價肝組織的受損情況。血液和肝臟中TG含量的升高也是由于肝臟無法及時代謝酒精引起的脂肪代謝紊亂造成的[27-29]。

多糖作為毒副作用較小的天然產(chǎn)物，具有良好的抗氧化活性和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝能力，能夠保護肝臟免受損害，是重要的抗酒精性損傷保健成分[30-31]。本實驗選用多汁乳菇精多糖（RPLV）作為實驗材料，建立酒精誘導急性臟器損傷小鼠模型，從體內(nèi)生化指標、肝臟組織病理切片及細胞超微結(jié)構分析多汁乳菇精多糖對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用。結(jié)果表明：造模后，模型組小鼠肝臟及血液中的各項生理生化指標與空白對照組差異顯著（P＜0.01），表明小鼠灌胃酒精后，發(fā)生急性酒精性肝損傷，且肝臟組織產(chǎn)生明顯的氧化應激，造模成功。與模型組相比，RPLV各劑量組小鼠肝臟和血液中的SOD、CAT、GSHPx活力和 GSH含量顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），說明多汁乳菇精多糖可以在急性酒精性肝損傷下有效維持體內(nèi)的氧化平衡，抑制酒精代謝過程中的脂質(zhì)過氧化；同時相對于模型組，各劑量組小鼠肝臟和血清中的AST活力及TG含量顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），表明RPLV可改善肝臟細胞的通透性，改善酒精代謝過程中的脂肪堆積，促使酒精快速代謝。觀察病理組織切片和超微結(jié)構，受試樣品RPLV可明顯改善肝臟受損情況。因此，多汁乳菇多糖可有效保護酒精性肝損傷，且相較于其他人工合成的藥物，具有較高的安全性，未來在保健食品以及醫(yī)藥領域具有廣闊的發(fā)展前景。