植物多肽的制備及在食品中應(yīng)用的研究進展

劉婉月，呂沛宣，楊雅夢，胥健萍，周曉宏

（北京理工大學化學與化工學院，北京 100081）

蛋白質(zhì)是生物體的重要組成部分，也是生命體重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。植物多肽是從植物來源的蛋白質(zhì)通過物理、化學或生物加工后形成的肽鏈片斷，含有營養(yǎng)豐富且均衡的必需氨基酸，蛋白質(zhì)的許多生理性質(zhì)與功能特性均通過其降解后形成的多肽發(fā)揮作用[1-3]。大量研究表明，植物多肽具有廣泛的理化特性和生理活性，如良好的溶解性、吸水性、乳化性等物理性質(zhì)，以及抗氧化、降血壓、抗癌等功能特性[4-6]。

植物多肽可通過植物蛋白經(jīng)酸、堿、酶水解或微生物發(fā)酵生產(chǎn)，在食品領(lǐng)域中，因酸堿水解法具有腐蝕性和產(chǎn)生有毒物質(zhì)而越來越少使用。相比之下，酶水解法專一性強、生產(chǎn)條件溫和、便于控制、不產(chǎn)生毒副產(chǎn)品、安全性高而成為多肽制備的方向，研究日益收到重視[7]。由于植物蛋白的來源不同以及加工工藝的不同，植物多肽具有不同的功能特性，其中抗氧化、降血壓、降血脂等功能研究已經(jīng)有較多報道，但國內(nèi)外對天然植物多肽營養(yǎng)、呈味及乳化功能，尤其是呈味與乳化在食品中的應(yīng)用介紹較少。

本文沿著多肽的制備、脫苦、應(yīng)用、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展這一線路，重點對植物多肽的制備及制備原理、植物蛋白的預(yù)處理方法來改善多肽的功能特性、植物蛋白酶解過程中苦味產(chǎn)生的原理和不同的脫苦技術(shù)、植物多肽的功能特性如營養(yǎng)、呈味、乳化，在食品中的應(yīng)用及原理進行了綜述，并展望了植物多肽在食品領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)化前景。

1 植物功能多肽的制備

植物蛋白除部分具有乳化作用外，本身無功能、無生理活性，只有被消化或加工形成多肽、氨基酸后才具有各種功能和生理活性，例如溶解性、乳化性、起泡性、親水親油能力以及膠凝性[8]。植物功能多肽的制備可分為化學法、酶法和微生物發(fā)酵法三類[9]，其中酶法不僅反應(yīng)條件易于控制等，水解產(chǎn)物只有短肽和氨基酸，符合食品衛(wèi)生的要求，是改造蛋白質(zhì)、實現(xiàn)蛋白質(zhì)功能多元化、提高蛋白質(zhì)價值的最有效途徑之一，從而成為主要的植物功能多肽制備方法。

1.1 化學法

酸或堿水解植物蛋白是常用的多肽化學制備方法，水解后將酸或堿去除[10]。酸或堿類型的選擇決定了植物蛋白肽鍵斷裂速率，常用的酸是鹽酸（HCl）[11]，硫酸（H2SO4）次之，因為即使在6 mol/L的相同濃度下，鹽酸裂解肽鍵的速度也更快[12]。常用的堿為氫氧化鈉（NaOH）和氫氧化鉀（KOH），這些強堿不僅用于將蛋白質(zhì)分解為氨基酸，還用于將其他大分子分解，如碳水化合物和脂質(zhì)，分別分解為糖和肥皂[12]，或水解后形成低分子量肽或游離氨基酸的鈉鹽或鉀鹽[13]。酸和堿水解蛋白在工業(yè)應(yīng)用中，操作簡單，成本和時間效益高，但會改變水解產(chǎn)物的外觀、溶解性、風味和安全性。如植物蛋白鹽酸水解過程中形成的3-氯-1,2-丙二醇（MCPD）和 1,3-二氯-2-丙醇（DCP）[14]、堿水解過程中產(chǎn)生的賴丙氨酸[15]都是致癌物質(zhì)。因此，酸、堿水解法正在被更安全、更溫和的酶解法替代。

1.2 酶解法

酶催化蛋白質(zhì)的水解，通過裂解兩個氨基酸之間的肽鍵，每個肽鍵的裂解需要消耗一分子水，如公式（1）：

肽鍵的連續(xù)裂解將蛋白質(zhì)分解為小分子量的氨基酸、肽或蛋白質(zhì)。酶解法能保留水解產(chǎn)物的營養(yǎng)和功能成分[7]，適當?shù)拿负蛯γ附鈼l件（如pH、溫度、酶與蛋白比例、酶解時間）的良好控制是生產(chǎn)具有所需功能特性蛋白水解物的關(guān)鍵[16]。

1.2.1 蛋白酶的選擇 在酶解過程中，所使用的酶的專一性尤為重要，因為其可通過影響肽的大小、數(shù)量、氨基酸組成和氨基酸序列，進而影響水解產(chǎn)物的生物活性和功能特性[17]。酶的來源有三種：動物、植物、微生物[18]，在最佳溫度和pH條件下，蛋白酶通常是特異性和非特異性的，按照肽鍵切割位點不同，被分為內(nèi)切酶和外切酶。其中內(nèi)切酶通過隨機水解肽鍵來降解蛋白質(zhì)分子，外切酶則在肽鍵末端斷開肽鍵，釋放N側(cè)或C側(cè)的氨基酸，在水解過程中，外切酶經(jīng)內(nèi)切酶的部分消化后，將蛋白質(zhì)完全分解[19]。不同的蛋白酶可以從相同的蛋白質(zhì)底物中產(chǎn)生不同類型的肽，表1顯示了不同來源的蛋白酶分類以及優(yōu)先切割[20]。當?shù)鞍踪|(zhì)被不同的酶處理時，會產(chǎn)生特異性廣泛的生物活性肽，然后通過純化將特異性的生物活性肽分離。如大豆蛋白具有特定的中性催化位點，可將其分解成多肽，但胰蛋白酶具有更高的特異性，因為其催化位點嚴格針對賴氨酸或精氨酸的羧基形成的鍵[21]。

表1 不同來源蛋白水解酶的優(yōu)先裂解Table 1 Preferential cleavage of proteolytic enzymes from different sources

1.2.2 蛋白原料的預(yù)處理 傳統(tǒng)的酶解法多肽產(chǎn)率低、酶利用率低[27]，這主要是因為均勻攪拌下酶與底物接觸頻率低，以及長期酶解過程中蛋白的聚集和沉積[28]。對PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中雞的肌動蛋白與大豆球蛋白三維結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，動物蛋白中α-螺旋含量高，結(jié)構(gòu)更為疏松和柔性，所以更易酶解，而植物蛋白中β-片層含量高，結(jié)構(gòu)更為緊密和剛性，因而更難酶解。并且，研究發(fā)現(xiàn)大豆蛋白具有緊密的保護肽鍵的四級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，對酶促水解具有抗性[29-30]。為了提高植物蛋白的酶解速度與效率，可在酶解之前對蛋白原料進行預(yù)處理，通常包括超高壓預(yù)處理[31]、微波預(yù)處理[32]和超聲預(yù)處理[33]，其中超聲預(yù)處理最常用。超聲預(yù)處理引起機械、熱、空化效應(yīng)導(dǎo)致植物蛋白表面疏水性、疏水性蛋白含量[34]、熒光強度、二硫鍵等參數(shù)的變化[35]，促進植物蛋白結(jié)構(gòu)的展開從而有利于酶對肽鍵的作用[33]，提高了酶解反應(yīng)速率[36]。超聲頻率是影響空化率的重要參數(shù)[37]，與單頻超聲（Single frequency ultrasound，SFU）相比，雙頻超聲（Dual frequency ultrasound，DFU）可提高空化作用[38]。Mokhtar等[39]研究了雙頻超聲在不同操作模式（同步模式和順序模式）下對葵花籽粕蛋白水解度 (Degree of hydrolysis，DH)和轉(zhuǎn)化率（Conversion rate，CR）的影響，兩種模式下，DH分別增加了7.73%和11.22%，CR增加了26.23%和26.98%（P＜0.05），同步模式的最大酶活力為64.46%，比對照組高32.52%。Zhang等[40]在最佳逆流超聲預(yù)處理條件下酶解小麥面筋蛋白（Wheat gluten protein，WGP），WGP濃度為10～50 g/L時，預(yù)處理使初始反應(yīng)速率提高 9.58%～20.27%，KA提高 2.90%。Liu等[41]研究了酸輔助超聲波處理對大豆分離蛋白（Soy protein isolate，SPI）結(jié)構(gòu)、聚合和乳化性能的影響，超聲處理提高了可溶性SPI的含量，可溶性團聚體的粒徑隨超聲處理時間減小，超聲時間較短的SPI中α-螺旋較低，超聲時間較長的SPI中α-螺旋較高。

1.2.3 酶解工藝

1.2.3.1 酶解苦味肽的產(chǎn)生 眾所周知，在蛋白質(zhì)酶促水解過程中會產(chǎn)生苦味肽[42]，最早關(guān)于蛋白質(zhì)酶解過程中苦味形成的研究是由Murray和Baker報道的[43]，1952年，他們發(fā)現(xiàn)明膠和酪蛋白的水解物會產(chǎn)生一種苦味，且酪蛋白水解物可以通過活性炭處理來改善苦味。完整的蛋白質(zhì)，疏水基團通常位于分子內(nèi)部，不能與味蕾直接接觸，所以感覺不到苦味；當?shù)鞍踪|(zhì)分解為小分子的肽后，疏水基團暴露，從而呈現(xiàn)出苦味[44]。苦味來源于多肽中的疏水氨基酸，如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等。一些肽的氨基酸序列表明N端和C端具有亮氨酸殘基時具有苦味[45]。

由于大豆肽在生理特別是在預(yù)防慢性疾病方面具有重要作用，引起了人們極大興趣[46]。多年前，Masao等[47]和Kukman等[48]就從大豆分離蛋白水解物（Soybean protein hydrolysate，SPH）中分離出了苦味肽。之后，Kim等[49-50]使用凝膠滲透高效液相色譜和反相高效液相色譜（Reversed-phase liquid chromatography, RP-HPLC）從11S大豆球蛋白的苦味水解產(chǎn)物和原大豆球蛋白的苦味水解產(chǎn)物中分離出了28個肽段。Arai等[51]發(fā)現(xiàn)從SPH中分離出的幾個苦味肽在C端均有一個亮氨酸殘基，使用羧肽酶降解C端結(jié)構(gòu)，可顯著降低苦味。

通過對SPH中苦味物質(zhì)系統(tǒng)而深入的研究，認為苦味肽的苦味強弱與其相對分子量和疏水性有關(guān)。最早，Ney等[52]假設(shè)疏水度是肽苦味最重要的預(yù)測因子，并建立了Q規(guī)則，即Q=∑△f/n，其中，Q值是氨基酸側(cè)鏈從乙醇轉(zhuǎn)移到水中的平均自由能，△f是氨基酸側(cè)鏈的轉(zhuǎn)移自由能，n是多肽中氨基酸的數(shù)目。接著，Tanford[53]應(yīng)用這些自由能值評估氨基酸、肽和蛋白質(zhì)的相對疏水性。Ney發(fā)現(xiàn)所有苦味肽的Q值均＞1400 cal/mol，而所有非苦味肽的Q值均＜1300 cal/mol。如果Q值在1300和1400 cal/mol之間，則不能說明是否有苦味存在。這個規(guī)則適用于分子量小于6000 Da的分子，而分子量大于6000 Da的分子，盡管Q ＞1400 cal/mol也沒有苦味。

1.2.3.2 多肽呈鮮原理 動物蛋白加熱降解產(chǎn)物，即肉湯，具有大量的生物活性物質(zhì)[54]，這些生物活性物質(zhì)不僅味道鮮美，還具有很高的營養(yǎng)含量[55]。利用DIONEX UltiMate 3000 RSLC液相色譜系統(tǒng)與LTQOrbitrap mass spectrometer質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)對1000多條雞湯多肽序列進行了分析，發(fā)現(xiàn)了雞湯中的鮮味物質(zhì)主要是親水性多肽，這些多肽的分子量大部分在3 kDa以下，序列中疏水性的氨基酸比例較低，親水性的氨基酸比例較高。

1.2.3.3 酶解脫苦技術(shù) 苦味的形成導(dǎo)致產(chǎn)品風味的缺陷，限制了蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的應(yīng)用。因此，減弱或去除蛋白質(zhì)水解物的苦味成為多肽應(yīng)用的重要前提條件。a.蛋白酶的篩選：蛋白酶具有很強的專一性，不同種類的蛋白酶對底物酶切位點都不一樣，這就決定了多肽組成不同，對酶解產(chǎn)物的風味有很大影響。蛋白酶根據(jù)酶切方式不同可分為內(nèi)切酶和外切酶，篩選蛋白酶時既要考慮酶活力的高低，又要考慮酶解后多肽的苦味程度要小，鮮味要強。根據(jù)多肽的苦味與鮮味形成機理，選擇靶向酶解親水性肽鍵的內(nèi)切酶，使酶解后形成的多肽具有較高的親水性，從而減少苦味。而外切酶要選擇可去除肽鏈末端疏水性氨基酸殘基的氨肽酶、羧肽酶，減少多肽中疏水性氨基酸的含量。通過內(nèi)切酶與外切酶共同作用，最大限度地減少了多肽中疏水性氨基酸的比例，達到脫苦的目的。早在1970年，Arai等[56]就發(fā)現(xiàn)用黑曲霉羧肽酶處理大豆蛋白水解物，多肽的苦味明顯減弱。其他研究證實，HAP低溫高堿堿性蛋白酶[57]、1398中性蛋白酶、Flavourzyme復(fù)合風味蛋白酶[58]、氨肽酶[59]都已被證實應(yīng)用于大豆蛋白水解物中具有良好的脫苦效果。b.酶解底物的選擇：并不是所有的蛋白質(zhì)酶解后都能產(chǎn)生苦味，不同的酶解產(chǎn)物苦味強度也不一致，蛋白質(zhì)來源對于苦味的控制有重要作用。c.水解度的控制：通過控制反應(yīng)條件如溫度、pH、酶解時間從而控制植物蛋白的水解度，水解度較低時，多肽的濃度比較低，肽鏈相對較長，許多疏水性氨基殘基被包埋起來，此時苦味并不明顯。隨著水解度的增加，疏水性氨基酸殘基的暴露程度越來越大，苦味也越來越強；當水解度非常高時，苦味肽被水解成分子量很小的肽或氨基酸，這時苦味就會減弱或消失。Ney[52]用凝膠色譜法分析了酪蛋白、土豆蛋白、大豆蛋白和小麥蛋白水解物的分子量與苦味的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)只有當水解物中含有相當量的分子量低于6000的多肽時才有苦味。因此在實驗過程中可以通過控制水解度來控制苦味的程度。

1.2.3.4 其他脫苦方法 a.選擇分離法：選擇分離法脫苦的原理是利用蛋白水解物中不同肽組分的疏水性不同，采用樹脂[57]、活性炭[60]和疏水色譜柱吸附[61]、有機溶劑沉淀[62]、萃取分離、膜過濾等技術(shù)將水解物中呈苦味的多肽分離。b.掩蓋法：掩蓋法脫苦的原理是利用水解物與苦味抑制劑混合，從而達到苦味去除的目的，因其不會造成功能性成分的流失而被廣泛應(yīng)用，如有機酸、酸性氨基酸、β-環(huán)糊精[63]以及酸糖按一定比例配合使用有較好的脫苦效果。此外，多聚谷氨酸也可以作為各種食物的苦味掩蓋劑，且作為健康飲食的組成成分而被廣泛應(yīng)用。

1.3 微生物發(fā)酵法

除了化學水解和蛋白酶水解，某些分泌蛋白酶的微生物菌株也可用于水解蛋白質(zhì)底物，釋放的肽具有高水平的生物活性，具有與健康相關(guān)的益處和更好的功能特性[64-66]。

微生物發(fā)酵法制備多肽的水解程度主要取決于所用發(fā)酵劑的類型、蛋白質(zhì)來源和發(fā)酵時間[67]。微生物發(fā)酵主要在亞洲國家用于發(fā)酵大豆食品，包括味噌、豆豉、納豆和醬油等[68]，發(fā)酵對口感和風味的形成至關(guān)重要[69]。微生物優(yōu)先選擇蛋白質(zhì)作為其氮源，從而改變蛋白質(zhì)底物的氨基酸譜，使其具有獨特的口感、生理功能和營養(yǎng)品質(zhì)[70]。通過發(fā)酵產(chǎn)生的多肽生物活性比原料中的原蛋白要高，除了肽的大小和序列外，氨基酸組成也發(fā)生了變化。Xu[71]等報道，大豆發(fā)酵后，必需氨基酸的含量大大增加。Kleekayai等[72]從發(fā)酵蝦醬中鑒定了兩種ACE抑制肽SV和IF（Ser-Val和 Lle-Phe）和一種抗氧化肽 WP（Trp-Pro）。他們提出，肽的氨基酸組成是發(fā)酵多肽生物活性的重要原因。

乳酸桿菌很早就作為發(fā)酵菌株，它們可以水解蛋白質(zhì)以改善胃腸道吸收，刺激免疫系統(tǒng)并控制血壓[73]。多年來，一些乳酸菌已被用作食品發(fā)酵工業(yè)中的功能發(fā)酵劑。例如，由瑞士乳酸桿菌發(fā)酵的酸奶中含有ACE抑制肽IPP和VPP（Lle-Pro-Pro和Val-Pro-Pro），可降低輕度高血壓受試者的血壓[74]。Amadou等[75]對植物乳桿菌發(fā)酵大豆蛋白粕水解物進行了分餾，發(fā)現(xiàn)部分分餾物具有較好的抗氧化活性。Yan等[76]比較了用乳酸菌和酵母菌發(fā)酵甘藍型油菜花粉的營養(yǎng)成分差異，在發(fā)酵過程中，破壁花粉在養(yǎng)分轉(zhuǎn)化方面顯示出更多的優(yōu)勢，游離氨基酸至少增加了11%，產(chǎn)生大量低分子量肽。利用其他發(fā)酵菌屬也可對蛋白質(zhì)資源進行發(fā)酵。Meinlschmidt等[77]研究了芽孢桿菌、根霉、酵母菌和乳酸菌對大豆分離蛋白的發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)所有發(fā)酵產(chǎn)物都比非發(fā)酵分離蛋白可溶性更強，臭味更少。Liu等[78]利用曲霉芽孢桿菌NJNPD41通過固態(tài)發(fā)酵菜籽粕（RSM）生產(chǎn)游離氨基酸和短肽，與未接種的對照相比，固態(tài)發(fā)酵后，菌株NJNPD41的接種顯著提高了總游離氨基酸和短肽的產(chǎn)率達115%。Ruan等[79]研究了超聲輔助液態(tài)發(fā)酵對枯草芽孢桿菌發(fā)酵大豆粉的肽含量和肽生物活性的影響，超聲參數(shù)顯示出枯草芽孢桿菌發(fā)酵在不同程度上對體外ACE抑制活性，肽含量和生物量具有很大推進作用。

2 植物多肽的應(yīng)用

2.1 營養(yǎng)功能

植物功能活性肽是從植物來源產(chǎn)生的，具有生物活性。在全球范圍內(nèi)，植物貢獻了人類所需能量的一半以上。近年來，功能活性肽營養(yǎng)保健品已經(jīng)逐漸成為社會生活討論的熱點。自20世紀90年代開始，活性多肽及其相關(guān)營養(yǎng)產(chǎn)品的開發(fā)研究備受關(guān)注。

大豆蛋白及其消化性水解產(chǎn)物包含所有必需氨基酸，具有乳化、持水和持油能力以及具有許多生物活性的營養(yǎng)成分[80]，酪蛋白、雞蛋和大豆蛋白的蛋白質(zhì)消化率校正氨基酸評分（Protein Digestibility Corrected Amino Acid Score，PDCAAS：一種蛋白質(zhì)質(zhì)量的評價指標，通過衡量蛋白質(zhì)的消化率以及其是否能夠滿足人體氨基酸需求而對不同的蛋白質(zhì)進行評分[81]）相同[82]，所以其營養(yǎng)價值與動物蛋白相媲美。

大豆蛋白水解物是人體營養(yǎng)和生理功能的極佳蛋白質(zhì)來源，具有食品和治療應(yīng)用[83]。它們很容易在胃腸道中吸收，并且與蛋白質(zhì)或氨基酸相比，大豆多肽具有更低的滲透壓，因此會降低胃腸的不適感和電解質(zhì)不平衡等癥狀的發(fā)生率。大豆二肽和三肽的消化和代謝比天然蛋白質(zhì)更有效，因此更適合應(yīng)用于生產(chǎn)老年人、嬰兒和患者的食物。有或沒有蛋氨酸富集的大豆蛋白的消化性水解產(chǎn)物據(jù)報道具有低變應(yīng)原性功能[84]，為嬰兒和成人提供氨基酸需求，因此適合強化可溶配方食品，并且是特殊醫(yī)療飲食中唯一的蛋白質(zhì)來源。

Lopes-da-Silva和Monteiro[85]在可控酶解條件下研究了食品配方中大豆多肽與其他化合物的相互作用，發(fā)現(xiàn)當將多肽應(yīng)用于中性多糖時具有凝膠性，從而應(yīng)用于對凝膠性要求較高的食品中，例如魔芋豆腐、凝膠丸子、薯糕等。有研究證明，水解后的產(chǎn)物比未水解前具有更強的凝膠性[86]。大豆蛋白具有較好的持水（WHC）持脂（FHC）能力，這兩個特性可用于改善營養(yǎng)健康食品蛋白產(chǎn)品的汁水含量、口感和嫩度[87]，可替代肉類蛋白質(zhì)。有研究證明，酶解后水解產(chǎn)物的WHC增強[88]。

礦物質(zhì)是除碳、氫、氧、氮等元素以外其他元素的統(tǒng)稱[89]，也稱無機鹽。礦物質(zhì)多肽即礦物質(zhì)元素與多肽形成的螯合物?；谛‰囊孜盏奶匦?，礦物質(zhì)多肽受到廣泛關(guān)注，研究主要集中于鈣螯合肽、鐵螯合肽及鋅螯合肽。鈣是人體必須的礦物質(zhì)，鈣攝入或吸收不足會產(chǎn)生多種疾病，包括骨質(zhì)疏松癥、高血壓、結(jié)腸癌、肥胖癥和腎結(jié)石[90]。Wang等[91]水解小麥胚芽蛋白并分離得到鈣結(jié)合能力為89.94%的多肽 FVDVT（Phe-Val-Asp-Val-Thr）。利用紫外可見光吸收光譜，傅里葉變換紅外光譜及X射線衍射研究鈣肽結(jié)合機制，提出羧基的氧原子和酰胺基的氮原子是鈣的主要結(jié)合位點。另外，天冬氨酸和蘇氨酸通過給電子對顯示出較強的鈣結(jié)合能力。食物中無機鐵含量較多，但較難被人體吸收，缺鐵容易引起貧血，而鐵肽螯合物易被吸收，因此受到廣泛關(guān)注。植物鐵肽螯合物主要以大豆多肽為研究對象，Lin等[92]篩選鐵源發(fā)現(xiàn)氯化亞鐵與大豆肽制得的鐵肽螯合物螯合率較高，為56.81%。響應(yīng)面優(yōu)化法確定螯合工藝，鐵肽質(zhì)量比為1:4，pH5，反應(yīng)溫度為40 ℃。通過紅外和紫外分析發(fā)現(xiàn)大豆肽螯合鐵形成了絡(luò)合物，該項研究為鐵肽螯合物的研究奠定了基礎(chǔ)。

2.2 呈味功能

味道和香氣是消費者購買食物時的關(guān)鍵因素。人的五種味覺分別是：酸、甜、苦、咸、鮮，鮮味物質(zhì)能激活味覺器官使人感覺到愉悅，可增加食物的適口性和食欲。過去十年，調(diào)味化學品受到越來越多的關(guān)注[93]，但消費者更愿意選擇天然成分的化合物而不是人造化合物[94]。從1967年嘌呤5'-核糖核苷酸作為鮮味增強劑開始，到現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多有效的天然調(diào)味劑，例如酵母提取物中的5'-GMP衍生物[95]，抹茶中的茶堿、L-茶氨酸和琥珀酸[96]，馬鈴薯中的紅寶石胺、茜草胺及L-和D-焦谷氨酸鈉[97-99]等。關(guān)于多肽作為鮮味劑，有研究突出了小麥面筋水解產(chǎn)物中的焦谷氨酰肽（pE-X），例如 pEP（pGlu-Pro，焦谷氨酰基-脯氨酸），pEPS（pGlu-Pro-Ser，焦谷氨?；?脯氨酸-絲氨酸）和 pEPE（pGlu-Pro-Glu，焦谷氨?；?脯氨酸-谷氨酸），以及作為鮮味增強劑的醬油中的pEG（pGlu-Gly，焦谷氨?；?甘氨酸）和 pEQ（pGlu-Gln，焦谷氨酰基-谷氨酰胺）[100-101]，而最早的報道之一是從大豆蛋白水解物中發(fā)現(xiàn)了幾種具有鮮味的1-谷氨酰寡肽，之后合成了一系列鮮味肽類似物[102-103]。風味肽具有不同的結(jié)構(gòu)和長度，具有獨特的甜味、苦味、鮮味、酸味和咸味。多肽的一級結(jié)構(gòu)和氨基酸序列決定其口感特性。據(jù)報道，AHSVRFY（Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe-Tyr）、DD（Asp-Asp）和 ED（Glu-Asp）分別貢獻了帕爾馬火腿、奶酪和大豆的鮮味。這些肽對于未加工食品和加工食品的風味都很重要。復(fù)合口味是由風味肽中的極性、氨基和羧基組成，這些基團具有緩沖能力。風味肽還可以參與和影響某些食物的氣味和味道的進化。研究表明，多肽序列中含有谷氨酸或者天冬氨酸的二肽及三肽具有鮮味[104]。Selamassakul等[105]發(fā)現(xiàn)用菠蘿蛋白酶酶解糙米蛋白，酶解產(chǎn)物中的鮮味并不是來源于游離的谷氨酸等氨基酸，而是風味多肽。Zhang等[106]使用乙醇沉淀和凝膠色譜法從花生分離蛋白水解物（PPIH）分離出6種新肽，并通過高效液相色譜-電噴霧/四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-ESI-Q-TOFMS/MS）鑒定為 DQR（Asp-Gln-Arg）、NNP（Asn-Asn-Pro）、EGF（Glu-Gly-Phe）、EDG（Glu-Asp-Gly）、TESSSE（Thr-Glu-Ser-Ser-Ser-Glu）和 RGENESEEEGAIVT（Arg-Gly-Glu-Asn-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu-Gly-Ala-Lle-Val-Thr）。根據(jù)感官結(jié)果，閾值范圍為0.39至1.11 mmol/L，所有肽均被感知為鮮味，閾值范圍為0.33至0.82 mmol/L，同時具有鮮味增強能力。鮮味多肽可用于咸味食品的加工，目前含有多肽的酶解物經(jīng)過調(diào)味后被應(yīng)用于醬油、魚露、耗油和肉味香精等調(diào)味品的生產(chǎn)。Chen等[107]以小麥粉為原料，通過發(fā)酵劑的發(fā)酵，谷氨酰胺酶的添加等步驟獲得新穎的增香肽產(chǎn)物，增香肽的氨基酸序列是GGGPG（Gly-Gly-Gly-Pro-Gly）。Liu 等[108]通過建立感官評價組，運用定量描述等方法對大豆風味肽在醬油中的作用進行測試和分析。結(jié)果表明，0.5%的大豆風味肽可增加醬油的整體平衡風味，大豆風味肽的結(jié)合對醬油的品質(zhì)有很大的改善。作者在研究蛋白酶解形成鮮味與苦味的原理時，發(fā)現(xiàn)親水性氨基酸比例高的多肽易于形成鮮味，疏水性氨基酸比例高的多肽易于形成苦味[109]，根據(jù)此原理，開發(fā)出了動植物蛋白靶向酶解生產(chǎn)鮮味多肽技術(shù)，所生產(chǎn)的鮮味多肽產(chǎn)品的鮮美度達到甚至優(yōu)于天然雞湯和發(fā)酵醬油。該技術(shù)為植物功能多肽在食品中的大規(guī)模應(yīng)用提供了可能。

2.3 乳化功能

植物蛋白水解產(chǎn)物多肽的乳化性能與其表面性能直接相關(guān)，并受到水解程度和酶處理的影響[110]。這是由于分子大小、親水性和疏水性部分的電荷和分布的變化造成的。水解物由于其親水性和疏水性官能團具有表面活性，可以吸附在界面上，起到乳化劑的作用。乳劑由兩個不相溶的相組成。在食品中（如蛋黃醬、冰淇淋、酸奶），通常是油和水。油包水乳劑是最常見的乳劑。像泡沫一樣，乳劑在熱力學上也不穩(wěn)定。聚結(jié)和乳化是油上升到乳化體系頂部的趨勢，是重要的不穩(wěn)定因素。與泡沫相比，乳狀液通常不太容易通過發(fā)生歧化反應(yīng)而失穩(wěn)，由于油滴之間通過液體層擴散的傾向很低。而表面活性劑得作用就是通過減緩聚結(jié)和乳化來穩(wěn)定乳劑。多肽作為表面活性劑，擴散到油水界面、吸附、重新排列、相互作用并在界面上形成彈性蛋白膜，同時，其兩親性降低了膜界面的表面張力[111-112]，通過降低表面張力和形成彈性蛋白膜來增強乳化液滴的穩(wěn)定性。此外，多肽上的電荷可以促進油/水滴的靜電穩(wěn)定。

乳化活性指數(shù)（Emulsifying activity index，EAI），乳化能力（Emulsifying capacity，EC）和乳化穩(wěn)定性（Emulsification stability，ES）是確定蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物乳化性能的評估標準。EAI是由Pearce和Kinsella首次提出的[113]，定義為乳化液中給定蛋白質(zhì)（g）能乳化油的總界面面積（m2），通常通過濁度法測量，計算公式為：

式中：A500為均質(zhì)乳化后的稀釋乳液在500 nm處的吸光度；N為乳液用0.1%SDS溶液稀釋的稀釋倍數(shù)；C為乳液中蛋白濃度，g/mL；φ為乳液中油相體積分數(shù)。

EC是指乳狀液相轉(zhuǎn)變前（從水包油乳狀液轉(zhuǎn)變成油包水乳狀液）每克蛋白質(zhì)所能乳化油的體積（m3）。ES反映了乳液的抗失穩(wěn)能力，評價ES的簡單方法包括監(jiān)測濁度或乳液層中油量隨時間的變化，ES在很大程度上取決于通過肽相互作用形成的蛋白膜的穩(wěn)定性。這些分子過程之間的平衡有助于確定乳化性能[114]。在SPI的天然狀態(tài)下，大豆蛋白的主要成分是貯藏蛋白，包括7S和11S球蛋白，占總蛋白的65%～80%，并始終形成球狀結(jié)構(gòu)，這與較低的分子彈性、較差的界面和乳化性能有關(guān)[115]。

許多研究表明大豆蛋白經(jīng)水解后得到的大豆多肽乳化性有明顯提高，主要原因是構(gòu)象靈活性增加以及暴露了更多疏水鍵有利于在水油界面上的吸附[116-117]，因此水解反應(yīng)在提高大豆多肽乳化劑的EAI和ES中起著至關(guān)重要的作用。多肽親疏水性結(jié)構(gòu)的比例影響其乳化性，在20種常見氨基酸中異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸有疏水側(cè)鏈，并且蛋白水解物的疏水選擇性受蛋白酶組合和水解程度的影響[118]。Chen等[119]證明大豆蛋白水解物SPH由于其界面成膜性而具有良好的乳化性能和乳液穩(wěn)定性。Lopes-da-Silva等[85]將SPH與中性多糖混合使用，二者相互作用以建立更好的乳化特性。多肽穩(wěn)定的水包油乳液液滴可以看作是由油核和肽殼組成的顆粒，如圖1所示，在相位角偏移的AFM圖像中油滴中心無明顯亮區(qū)，說明由于肽的存在，膜更加堅硬和完整[120]。因此，多肽區(qū)別于其他乳化劑的最大特征是能夠維持油水界面膜的堅固性，從而在乳化穩(wěn)定性方面具有很好效果。

圖1 多肽乳液顯微圖像[120]Fig.1 Microscopic image of polypeptide stabled emulsion[120]

3 結(jié)語

作為食品的三大組分，以淀粉為主要原料的糖類加工產(chǎn)品的開發(fā)已經(jīng)相當成熟，而以蛋白為主要原料的肽類加工產(chǎn)品的開發(fā)明顯不足。美國和日本分別在20世紀70和80年代推出了大豆多肽產(chǎn)品，國內(nèi)上世紀九十年代起陸續(xù)有幾家生物高科技企業(yè)進入這一領(lǐng)域[121]。我國政府對植物功能多肽的產(chǎn)業(yè)發(fā)展已高度重視，國家發(fā)改委在關(guān)于促進食品工業(yè)健康發(fā)展的指導(dǎo)意見中提出，在“十三五”期間要加快發(fā)展功能性蛋白和生物活性肽等保健和健康食品。在我國多肽產(chǎn)業(yè)20多年的發(fā)展過程中，以抗氧化、降血壓等生理活性功能為特征的功能食品市場已經(jīng)達到了平穩(wěn)期，但市場價格已經(jīng)明顯下降，多數(shù)產(chǎn)品已降至200元/公斤以下；另一方面，以營養(yǎng)、呈味、乳化等功能為特征的食品配料市場正在形成。植物多肽作為食品配料的市場容量遠大于功能食品，但前者對風味的要求遠遠大于后者，消費者能承受的價格上限也要比后者低得多。鑒于此，植物多肽食品配料的研究開發(fā)可望在以下幾個方面取得進展：a.對植物蛋白進行預(yù)處理，破壞蛋白緊密結(jié)構(gòu)，提高蛋白的降解率；b.進一步篩選和改造蛋白酶，提高蛋白酶的酶活性，尋找能夠作用于親水性肽鍵的蛋白內(nèi)切酶和外切酶，增強植物蛋白酶解的靶向性，提高植物蛋白的降解速率，改善植物多肽的風味；c.對植物蛋白酶解物進行分離提純，基于多肽的分子量、親疏水性及酸堿性等，采用膜過濾、大孔吸附樹脂、活性炭吸附色譜和反相高效液相色譜，以及離子交換色譜、電滲析等方法對水解產(chǎn)物進行分離純化，得到功能性更明確的多肽；d.基于多肽的營養(yǎng)、呈味、乳化其中的一種或多種功能，加強多肽在各種食品中的應(yīng)用研究，以增強應(yīng)用食品的功能品質(zhì)。植物多肽產(chǎn)業(yè)蓄勢待發(fā)，前景光明。