基于內(nèi)源性磷脂-乳清分離蛋白交互作用的磷蝦油乳液穩(wěn)定性研究

趙電波，秦曉鵬，詹海杰，段子強(qiáng)，禹 曉，鄧乾春，相啟森，朱瑩瑩

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450001；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，油料脂質(zhì)化學(xué)與營養(yǎng)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430062）

全球飲食報(bào)告顯示，2017年全球約有1/5人口的過早死亡是由飲食結(jié)構(gòu)問題所導(dǎo)致。其中，長鏈n-3多不飽和脂肪酸（long chain n-3 polyunsaturated fatty acids，LC n-3PUFAs）攝入不足幾乎波及全球195個(gè)國家和地區(qū)。我國現(xiàn)狀尤為嚴(yán)峻，每日二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）攝入量約 50 mg，僅為推薦標(biāo)準(zhǔn)的20%，這尤為不利于n-3 PUFAs通過強(qiáng)化營養(yǎng)、調(diào)節(jié)代謝紊亂干預(yù)多種慢性疾病的發(fā)生發(fā)展[1]。

與植物來源的α-亞麻酸相比，海產(chǎn)品來源的EPA和DHA營養(yǎng)和健康功效更為顯著[2]。與富含甘油三酯型EPA和DHA的魚油相比，南極磷蝦油來源的磷脂型EPA和DHA更容易富集在機(jī)體組織中，從而表現(xiàn)出更高的生物活性[3-4]。因內(nèi)源性磷脂和蝦青素的存在，南極磷蝦油的氧化穩(wěn)定性相對優(yōu)于魚油。然而，即使是商業(yè)南極磷蝦油，仍含有2%～13%游離脂肪酸，主要來源于磷脂型EPA和DHA的脂解反應(yīng)，從而加劇甘油三酯的脂質(zhì)過氧化，降低南極磷蝦油的生物活性[5]。目前市售南極磷蝦油主要是純油體系或軟膠囊，攝入形式較為單一。因此，通過改變南極磷蝦油的攝入形式，并進(jìn)一步強(qiáng)化其生物利用率，增加其健康食品體系中的應(yīng)用范圍，將是有效重構(gòu)我國居民膳食脂肪攝入平衡的關(guān)鍵。納米乳液載運(yùn)體系能夠一定程度上實(shí)現(xiàn)負(fù)載的活性脂質(zhì)的靶向消化、吸收和代謝轉(zhuǎn)化軌跡，正逐步用于提高亞麻籽油、魚油中n-3PUFAs的生物利用率[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，胃液低pH及較高含量的血紅素鐵、H2O2、活性氮等物質(zhì)構(gòu)成了促EPA和DHA氧化的微環(huán)境，小腸段由脂解反應(yīng)介導(dǎo)的游離脂肪酸的釋放、界面解吸附和膠束化過程中可能加劇EPA和DHA氧化[9-10]。對于磷蝦油而言，引入特定蛋白類乳化劑，利用其形成致密的粘彈性界面膜，構(gòu)建具有較強(qiáng)物理穩(wěn)定性的乳液體系，將是最大限度改善磷蝦油氧化易感性和掩蓋不良風(fēng)味的關(guān)鍵[11]。

乳清分離蛋白（WPI）主要包括β-乳球蛋白（67.6%～74.8%）、α-乳白蛋白（8.3%～17.5%）、牛血清白蛋白（7.2%～10.9%）和免疫球蛋白（5.9%～7.5%）。因富含半胱氨酸等含巰基氨基酸，WPI具有一定的抗氧化活性[12]。此外，WPI本身具有較好的乳化活性和乳化穩(wěn)定性，且能夠與殼聚糖、亞麻籽膠多糖等基于非共價(jià)或共價(jià)交互作用負(fù)載亞麻籽油、百里香油、花青素等活性組分[13-15]。已有研究表明，葵花籽油磷脂與WPI復(fù)合，能夠影響乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)疏水位點(diǎn)暴露，進(jìn)一步提高乳清蛋白的乳化活性[16]。在磷蝦油中，內(nèi)源性甘油三酯和磷脂共存，將如何與WPI交互作用影響乳液穩(wěn)定性，仍待進(jìn)一步研究?；诖?，本研究擬利用磷蝦油內(nèi)源性磷脂的自乳化潛力，并引入WPI，探究內(nèi)源性磷脂-WPI交互作用對磷蝦油乳液理化特性、微觀結(jié)構(gòu)、物理穩(wěn)定性、環(huán)境脅迫響應(yīng)性的影響規(guī)律和作用機(jī)理，旨在構(gòu)建具有較強(qiáng)物理穩(wěn)定性的磷蝦油乳液體系，以應(yīng)用到乳飲料、調(diào)味醬、肉糜等流體、半流體和固體食品體系中。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦油 青島南極維康生物科技有限公司；WPI Davisco Food 公司；溴化鉀（光譜純） 上海國藥試劑集團(tuán)；ANS（8-苯胺-1萘磺酸） 索萊寶生物科技有限公司；無水乙醇、正己烷 分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

XHF-D高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；P901酸度計(jì)測定儀 上海佑科儀器儀表有限公司；Nano-ZS90激光粒度儀 英國馬爾文儀器公司；Discovery型旋轉(zhuǎn)流變儀 美國TA公司；Turbiscan多重光散射儀 法國Formulaction公司；Quorum PP3010T冷凍傳輸裝置 英國Quorum公司；Regulus 8100電鏡 日本日立（Hitachi）公司；Vertex70傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克公司；自動(dòng)界面張力儀K100 德國Kruss儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 磷蝦油乳液制備

1.2.1.1 自乳化型磷蝦油乳液的制備 參考Uluata等[17]的方法，稍加修改，將磷蝦油與0.05 mol/L，pH=6.8的磷酸鹽緩沖液（PBS）分別以質(zhì)量比5:95、10:90、15:85、20:80和 25:75混合后置于 50 mL離心管中，用高速分散器以10000 r/min均質(zhì)3 min，借助內(nèi)源性磷脂的乳化特性，獲得南極磷蝦油自乳化型O/W乳液。

1.2.1.2 內(nèi)源性磷脂-WPI穩(wěn)定的磷蝦油乳液制備在1.2.1.1基礎(chǔ)上，將磷蝦油與不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的WPI溶液（0、0.25%、0.5%、0.75%和1.0%）分別以質(zhì)量比25:75混合后置于50 mL離心管中，用高速分散器以10000 r/min均質(zhì)3 min，獲得內(nèi)源性磷脂和WPI穩(wěn)定的磷蝦油乳液。

1.2.2 磷蝦油乳液的理化穩(wěn)定性分析

1.2.2.1 平均粒徑和Zeta電位測定 將磷蝦油乳液用0.05 mol/L PBS稀釋100倍后，在室溫下用激光粒度儀測定平均粒徑與Zeta電位。

1.2.2.2 形貌觀察 參考Dapueto等[18]的方法，稍加修改，利用冷場掃描電鏡（Cryo-SEM）觀察磷蝦油乳液微觀形態(tài)，測試條件為：升華溫度，-90 ℃；升華時(shí)間，10 min；噴金，5 mA，60 s；拍攝電壓為 3 kV。

1.2.2.3 物理穩(wěn)定性 采用多重光散射儀測定磷蝦油乳液的物理穩(wěn)定性。具體測試條件為：上樣量18 mL；掃描頻率，1 次/25 s；掃描時(shí)間，30 min。

1.2.2.4 剪切流變特性分析 參考Tang等[19]的方法，稍加修改，采用旋轉(zhuǎn)流變儀對磷蝦油乳液進(jìn)行表觀粘度測定，測試條件為：夾具直徑，40 mm；夾縫間隙，0.5 mm；測試溫度，25 ℃；剪切速率，0.01～100 s-1。

1.2.2.5 模擬巴氏殺菌和pH遷移處理 模擬巴氏殺菌條件：65 ℃，30 min 和 85 ℃，15 s，并以未處理樣品作為對照。具體測定過程為，在水浴鍋到達(dá)指定溫度后，放置磷蝦油乳液，用溫度計(jì)測量乳液中心溫度，達(dá)到條件溫度后計(jì)時(shí)，溫度處理結(jié)束后測量其物理穩(wěn)定性。

pH遷移：用0.5 mol/L的NaOH溶液和0.5 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH，與磷蝦油混合均質(zhì)后，測定不同pH條件下磷蝦油乳液的物理穩(wěn)定性。

1.2.3 內(nèi)源性磷脂-WPI交互作用評價(jià)

1.2.3.1 磷蝦油磷脂分離 參考趙鑫鵬[20]的方法，采用正己烷/乙醇/水三相溶劑提取分離工藝，多次正己烷提取乙醇相萃取液，直至正己烷相接近無色，最后將乙醇相萃取液脫溶后獲得橙黃色膏狀物，即為磷蝦油磷脂。

1.2.3.2 磷蝦油磷脂-WPI分散液制備 將0.5 g WPI溶于40 mL去離子水，配成WPI溶液，再按乳清蛋白與磷蝦油磷脂質(zhì)量比 1:0.1，1:0.2，1:0.5，1:1加入磷蝦油磷脂，25 ℃、500 r/min磁力攪拌過夜，配制磷蝦油磷脂-WPI分散液。

1.2.3.3 磷蝦油磷脂對WPI內(nèi)源性熒光特性的影響參考Chen等[16]的方法，采用熒光分光光度計(jì)分析磷蝦油磷脂對WPI內(nèi)源性熒光特性的影響。將制得的分散液稀釋100倍，與 0.008 mol/L的 ANSPBS溶液按50:1混合，室溫下漩渦，孵育30 min。測試條件為，激發(fā)波長350 nm，掃描波長380～600 nm，縫寬為2.5 nm。

1.2.3.4 磷蝦油磷脂對WPI二級結(jié)構(gòu)的影響 圓二色譜分析：將不同質(zhì)量比的磷蝦油磷脂-WPI分散液注入1 mm石英小杯，設(shè)置遠(yuǎn)紫外光譜范圍為180～260 nm，測試溫度為25 ℃，掃描速度為120 nm/min，響應(yīng)時(shí)間為0.5 s，分辨率為0.5 mm，帶寬為1 nm。

紅外光譜分析：將磷蝦油磷脂-WPI分散液冷凍干燥后，取2 mg粉末樣品與溴化鉀（1:100）在瑪瑙研缽里充分研磨混合均勻后壓片，利用傅里葉變換紅外光譜儀在4000～400 cm-1區(qū)內(nèi)進(jìn)行掃描分析，分辨率為4 cm-1。

1.2.3.5 磷蝦油磷脂對WPI界面活性的影響 參考O'Sullivan等[21]的方法，稍加修改。將裝有14 g分散液的玻璃皿放入儀器中，調(diào)整鉑金板浸入液面3 mm深度，緩慢加入40 g亞麻籽油，使其在分散液與油相之間形成界面，并設(shè)置WPI和磷蝦油磷脂對照組。測試條件為：測定溫度，25 ℃；測定頻率：1次/60 s；測定時(shí)間：3600 s。

1.3 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=3）。采用Origin9.5軟件繪圖，SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，樣品間差異性通過Duncan法比較（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 載油量對磷蝦油乳液平均粒徑、Zeta電位和物理穩(wěn)定性的影響

圖1為載油量對磷蝦油乳液平均粒徑和Zeta電位的影響。由圖1A可知，在5%載油量條件下，磷蝦油乳液平均粒徑為166 nm；隨著載油量增加至25%時(shí)，磷蝦油乳液的平均粒徑降低78.97%（P＜0.05）。這主要?dú)w因于磷蝦油中除了含有12%～30%甘油三酯外，還含有具有表面活性的磷脂（19%～81%）以及少量甘油二酯、游離脂肪酸等[22]。因此，在不添加任何乳化劑情況下，磷蝦油能夠借助高速剪切形成分散性較好的乳液體系[23]。如圖1B所示，在5%載油量條件下，磷蝦油乳液的初始Zeta電位值為-46.6 mV，表明依賴內(nèi)源性磷脂形成的脂滴之間具有較強(qiáng)的靜電斥力。隨著載油量逐漸增加至25%，磷蝦油乳液體Zeta電位絕對值呈現(xiàn)先逐步降低后趨于穩(wěn)定的趨勢，最低值為27.23。磷蝦油中除了含有磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺外，還含有少量的溶血磷脂酰絲氨酸等[24]。因此，在中性pH條件下，磷蝦油乳液的Zeta電位值主要依賴于溶血磷脂酰絲氨酸等在脂滴表面的吸附量。

圖1 載油量對磷蝦油乳液平均粒徑（A）和Zeta電位（B）的影響Fig.1 Effect of oil loading on the mean particle size（A）and Zeta potential（B）of krill oil emulsion

通過Tubiscan-easysoft軟件計(jì)算乳液的穩(wěn)定性動(dòng)力學(xué)指數(shù)（Turbiscan stability index，TSI）。TSI值越小，表明該乳液體系越趨于穩(wěn)定。圖2為載油量對磷蝦油乳液物理穩(wěn)定性的影響。如圖2A所示，當(dāng)載油量為5%時(shí)，磷蝦油乳液的TSI值最小；當(dāng)載油量逐步增加至20%時(shí)，磷蝦油乳液的TSI值以及其增長速率均呈現(xiàn)逐步增加的趨勢；當(dāng)載油量進(jìn)一步增加至25%時(shí)，磷蝦油乳液TSI值和增長速率的增加幅度最為明顯，體系趨于不穩(wěn)定。圖2B為載油量為5%和25%時(shí)，磷蝦油乳液的背射光圖譜。其中，當(dāng)載油量為5%時(shí)，乳液的背射光圖譜整體平穩(wěn)，表現(xiàn)出較好的物理穩(wěn)定性；載油量增加到25%時(shí)，曲線右側(cè)發(fā)生上移，表明乳液中脂滴上浮，穩(wěn)定性變差。上述研究表明，高載油量能夠提供更多的內(nèi)源性磷脂用于分散和乳化磷蝦油，但同時(shí)也增加了脂滴之間碰撞頻率與聚結(jié)速率，這與姜如雪等[25]的研究結(jié)果基本一致，乳液體系中較高的載油量會(huì)引起油滴碰撞使得乳液趨于形成多重乳液，并在貯存過程中破裂，這兩種現(xiàn)象可能導(dǎo)致乳液失穩(wěn)。因此，在較高載油量條件下，無法單純依賴內(nèi)源性磷脂獲得兼具乳化活性和穩(wěn)定性較強(qiáng)的磷蝦油乳液。

圖2 載油量對南極磷蝦油乳液物理穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of oil loading on the physical stability of krill oil emulsion

2.2 WPI含量對磷蝦油乳液平均粒徑、Zeta電位和物理穩(wěn)定性的影響

圖3為WPI含量對25%載油量的磷蝦油乳液平均粒徑、Zeta電位和物理穩(wěn)定性的影響。由圖3A可知，低含量WPI（0%～0.25%）添加對磷蝦油乳液平均粒徑無明顯影響，為29.29～30.61 nm；進(jìn)一步增加WPI添加量（0.5%～1.0%），磷蝦油乳液平均粒徑增加38.5%～84.0%（P＜0.05），但與蛋白含量非正相關(guān)關(guān)系。在WPI添加量為0.5%時(shí)，達(dá)到最大值53.89 nm。由于磷蝦油中內(nèi)源性磷脂含量較高，且載油量高達(dá)25%，因此發(fā)揮乳化作用時(shí)小分子的磷脂占主導(dǎo)作用。在形成界面膜時(shí)，小分子磷脂會(huì)優(yōu)先吸附到油水界面，而大分子乳化劑乳清蛋白通過疏水作用基團(tuán)與小分子磷脂交互作用，并隨著WPI含量的增加，與磷脂之間的界面競爭性吸附增強(qiáng)[16]，并可能同時(shí)參與多個(gè)小分子內(nèi)源性磷脂穩(wěn)定的脂滴界面的形成，從而使磷蝦油乳液粒徑增大[26-27]。

由圖3B可知，隨著WPI含量的增加（0～1.0%），磷蝦油乳液Zeta電位絕對值先逐漸增加后趨于穩(wěn)定。在WPI添加量為0.5%時(shí)，zeta電位絕對值增加 31.40%（P＜0.05），達(dá)到最大值 19.25，表明中性pH條件下，脂滴之間靜電斥力因WPI的添加而逐步增強(qiáng)。由圖3C～圖3D可知，低濃度WPI（0～0.5%）能夠明顯的降低磷蝦油乳液的TSI值，且隨著WPI含量的增加降低程度增大，這使得背射光圖譜中部曲線更平坦，脂滴上浮和絮凝現(xiàn)象得到明顯改善。進(jìn)一步增加WPI濃度（0.75%～1.0%），磷蝦油乳液TSI值增長速率無明顯變化，表明添加量在0.5%時(shí)，WPI穩(wěn)定磷蝦油乳液的潛力達(dá)到最大值。

2.3 WPI含量對磷蝦油乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖4為WPI含量對磷蝦油乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響。由圖4可知，磷蝦油中內(nèi)源性磷脂，作為小分子乳化劑直接參與了脂滴的形成，平均粒徑在納米級范圍內(nèi)，進(jìn)一步證實(shí)了圖3A的結(jié)果。為考慮到超高壓均質(zhì)或微射流對WPI結(jié)構(gòu)和乳化特性的影響[28]，本研究采用高速剪切方式制備乳液。作為大分子乳化劑，WPI并沒有直接參與單個(gè)脂滴界面膜的形成。相反地，由單純內(nèi)源性磷脂穩(wěn)定的脂滴被束縛在WPI與部分內(nèi)源性磷脂交互作用形成框架結(jié)構(gòu)中。隨著WPI含量的增加，WPI與內(nèi)源性磷脂交互作用增強(qiáng)，被束縛在框架中的脂滴數(shù)量明顯增加，同時(shí)游離在空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)外的脂滴數(shù)量逐步減少。

圖3 WPI含量對磷蝦油乳液平均粒徑（A）、Zeta電位（B）和物理穩(wěn)定性（C～D）的影響Fig.3 Effect of WPI on the mean particle size（A）, Zeta potential（B）and physical stability（C～D） of krill oil emulsion

圖4 WPI含量對磷蝦油乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of WPI on the microstructure of krill oil emulsion

2.4 WPI穩(wěn)定磷蝦油乳液的作用機(jī)理

2.4.1 WPI對磷蝦油乳液剪切流變特性的影響以及磷蝦油磷脂-WPI分散液的界面活性 圖5為WPI對磷蝦油乳液剪切流變特性的影響。由圖5可知，WPI主要影響磷蝦油乳液在低剪切速率（0.01～10 s-1）條件下的表觀粘度值。其中，未添加WPI的磷蝦油乳液表觀粘度值較低，剪切變稀；隨著WPI含量增加至1.0%，磷蝦油乳液的表觀粘度值在剪切速率0.01～1 s-1范圍內(nèi)逐步增加，也表現(xiàn)出剪切變稀的趨勢。圖6為磷蝦油磷脂-WPI分散液的界面活性。由圖6可知，磷蝦油磷脂-WPI分散液的初始界面壓力值明顯低于單一內(nèi)源性磷脂和WPI，表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。當(dāng)分散液中磷蝦油磷脂與WPI質(zhì)量比從0.1:1增加至0.25:1時(shí)，分散液的界面張力值無明顯降低，這一現(xiàn)象可能是由于小分子磷脂加入雖然降低了界面張力，但是由于競爭吸附存在，使得油水界面表面負(fù)荷的蛋白減少，從而部分抵消了兩者的協(xié)同效應(yīng)[27]；當(dāng)磷蝦油磷脂與WPI質(zhì)量比分別增加至0.5:1和1:1時(shí)，分散液的界面張力值明顯降低，且表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。值得注意的是，磷蝦油磷脂并未明顯改變分散體系中WPI的界面吸附動(dòng)力學(xué)規(guī)律。上述研究表明，WPI對磷蝦油乳液穩(wěn)定性的正向調(diào)控效應(yīng)，與增加乳液體系粘度、限制脂滴在連續(xù)相的運(yùn)動(dòng)有關(guān)[29]。同時(shí)，磷蝦油磷脂與WPI交互作用進(jìn)一步強(qiáng)化了分散相參與脂滴界面形成的能力。

圖5 WPI對磷蝦油乳液剪切流變特性的影響Fig.5 Effect of WPI on the shear rheological properties of krill oil emulsions

圖6 磷蝦油磷脂對WPI界面活性的影響Fig.6 Effect of krill oil phospholipids on the interfacial activity of WPI

2.4.2 磷蝦油磷脂對WPI表面疏水特性和二級結(jié)構(gòu)的影響 圖7為磷蝦油磷脂對WPI表面疏水特性和二級結(jié)構(gòu)的影響。由圖7A可知，當(dāng)磷蝦油磷脂和WPI質(zhì)量比增加至0～0.2:1時(shí)，WPI的最大熒光強(qiáng)度（FImax）明顯增加；當(dāng)質(zhì)量比達(dá)到0.2～0.5:1時(shí)，WPI的最大熒光強(qiáng)度（FImax）值無明顯變化；當(dāng)質(zhì)量比進(jìn)一步增加至1:1時(shí)，WPI的FImax值明顯增強(qiáng)。事實(shí)上，WPI的熒光強(qiáng)度與暴露于極性環(huán)境中的苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）及色氨酸（Trp）殘基有關(guān)[30]。上述研究表明，分散體系中適宜濃度磷蝦油磷脂的存在能夠明顯增加WPI增加疏水位點(diǎn)的暴露，即誘導(dǎo)位于疏水核心中Phe、Tyr和Trp轉(zhuǎn)移到極性外環(huán)境中，提高其穩(wěn)定磷蝦油乳液的潛力。

磷蝦油磷脂對WPI疏水特性的影響可能伴隨著二級結(jié)構(gòu)的改變。由圖7B可知，WPI在3400～3200 cm-1內(nèi)存在N-H或O-H的特征吸收峰；酰胺I譜帶（1700～1600 cm-1）與肽基的C=O伸縮振動(dòng)有關(guān)，酰胺Ⅱ譜帶（1600～1500 cm-1）與 N-H 鍵彎曲和C-N鍵伸縮振動(dòng)有關(guān)。隨著分散體系中磷蝦油磷脂與WPI比例從0:1增加至1:1，WPI酰胺Ⅰ帶（1649.1～1651.0 cm-1）和酰胺Ⅱ帶（1537.0～1545.0 cm-1）波段均向較大波長移動(dòng)，表明磷蝦油磷脂能夠使WPI氫鍵減弱，從而影響其疏水特性。

圖7 磷蝦油磷脂對WPI熒光特性（A）和紅外光譜特性（B）的影響Fig.7 Effect of krill oil phospholipids on the fluorescence properties（A） and infrared spectrum （B） of WPI

表1為通過圓二色譜分析磷蝦油磷脂對WPI二級結(jié)構(gòu)的影響。由表1可知，單一WPI體系中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量分別為20.27%、30.23%、17.17%和32.33%，而磷蝦油磷脂的添加能夠不同程度地影響WPI二級結(jié)構(gòu)。其中，當(dāng)磷蝦油磷脂與WPI質(zhì)量比為0.1:1時(shí)，WPI中α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)含量無明顯變化；當(dāng)質(zhì)量比增加至 0.2:1 時(shí)，WPI中α-螺旋增加了 1.47%（P＜0.05），β-折疊結(jié)構(gòu)含量增加了 0.88%（P＜0.05）；當(dāng)質(zhì)量比進(jìn)一步增加至0.25～1:1時(shí)，WPI的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量則降低了 1.60%（P＜0.05），而β-折疊結(jié)構(gòu)含量則呈現(xiàn)先增加后降低趨勢。α-螺旋結(jié)構(gòu)含量與WPI疏水特性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，磷蝦油磷脂與WPI質(zhì)量比在0.1～0.2:1范圍時(shí)，WPI有序性增強(qiáng)，分散體系親水性提升。然而，從整體來看，分散體系中WPI的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低而β-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量增加則說明了WPI無序性增加，結(jié)構(gòu)更加松散，疏水性增強(qiáng)[31]。有研究表明[32]，這一現(xiàn)象是由于液晶狀態(tài)下的陰離子磷脂，通過其疏水作用可以改變?nèi)榍宓鞍椎亩壗Y(jié)構(gòu)。

表1 磷蝦油磷脂對WPI二級結(jié)構(gòu)的影響Table 1 Effect of krill oil phospholipids on the secondary structure of WPI

2.5 模擬巴氏殺菌處理和pH遷移對磷蝦油乳液流變特性和穩(wěn)定性的影響

圖8為模擬巴氏殺菌和pH遷移對磷蝦油乳液流變特性和穩(wěn)定性的影響。由圖8A可知，與未處理組相比，磷蝦油乳液分別經(jīng)65 ℃處理30 min和85 ℃處理15 s后均表現(xiàn)出表觀粘度值增加的趨勢。由圖8C所示，與對照組相比，65 ℃處理30 min和85 ℃處理15 s同樣增加了磷蝦油乳液的物理穩(wěn)定性，而后者的正向調(diào)控作用最為明顯。圖8E中，與未處理的磷蝦油乳液相比，處理組的背射光圖譜曲線變化更小，說明乳液內(nèi)部更為穩(wěn)定。已有研究表明，這主要?dú)w因于磷蝦油乳液被加熱到70～90 ℃過程中，作為乳化劑的WPI可能經(jīng)歷了天然蛋白分子結(jié)構(gòu)伸展變性、部分變性蛋白凝聚和弱凝膠形成，一定程度上限制了脂滴運(yùn)動(dòng)，表現(xiàn)出增強(qiáng)的磷蝦油乳液穩(wěn)定性[30]。

如圖8B所示，在pH=4時(shí)，磷蝦油乳液在低剪切速率0.01～0.1 s-1范圍內(nèi)，表觀粘度值為41.80 Pa.s，當(dāng)pH向強(qiáng)酸性遷移時(shí)磷蝦油乳液表觀粘度值顯著減少，在向弱酸性、中性弱堿性遷移時(shí)磷蝦油乳液的表觀粘度值明顯增加之后趨于穩(wěn)定；當(dāng)pH進(jìn)一步增加至9時(shí)，磷蝦油乳液的表觀粘度值則呈現(xiàn)先顯著增加后趨于穩(wěn)定的趨勢。由圖8D可知，在pH4時(shí)，磷蝦油乳液穩(wěn)定性最差，可能是因?yàn)榻咏赪PI等電點(diǎn)，導(dǎo)致其乳化活性降低。當(dāng)pH向強(qiáng)酸性、尤其是向弱酸性、中性和弱堿性遷移時(shí)，磷蝦油乳液穩(wěn)定性依次增強(qiáng)。圖8F為磷蝦油乳液pH為2、6、9時(shí)的背射光圖譜，三者曲線整體都較為平坦，表現(xiàn)出較高的物理穩(wěn)定性，pH2時(shí)，曲線中部有部分波動(dòng)可能是由于強(qiáng)酸性條件下磷蝦油乳液中的靜電作用使乳液中部發(fā)生了輕微的聚合。上述結(jié)果顯示，基于內(nèi)源性磷脂-WPI交互作用構(gòu)建的磷蝦油乳液在胃消化階段的酸性pH條件下具有相對穩(wěn)定性，可以最大限度地改善磷蝦油在該階段的氧化易感性，并可能實(shí)現(xiàn)磷蝦油經(jīng)小腸段消化吸收的靶向性。

圖8 模擬巴氏殺菌和pH遷移對磷蝦油乳液流變特性（A，B）和穩(wěn)定性（C，E，D，F(xiàn)）的影響Fig.8 Effects of pH migration on the rheological properties（A, B） and physical stability（C, E, D, F） of krill oil emulsions

3 結(jié)論

本研究在構(gòu)建磷蝦油乳液基礎(chǔ)上，探究了內(nèi)源性磷脂-WPI交互作用對磷蝦油乳液物理穩(wěn)定性的影響規(guī)律和作用機(jī)理，研究發(fā)現(xiàn)，隨著載油量從5%增加至25%，磷蝦油乳液平均粒徑逐漸減小，然而Zeta電位絕對值逐漸降低，TSI值增大，乳液趨于不穩(wěn)定。WPI使磷蝦油乳液平均粒徑增加4.5%～84.0%，Zeta電位絕對值增加10.6%～31.4%，TSI降低26.2%～70.3%，乳液穩(wěn)定性增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，WPI能夠通過增加磷蝦油乳液的表觀粘度，并基于與內(nèi)源性磷脂交互作用改變WPI自身的二級結(jié)構(gòu)、界面活性和表面疏水特性，從而對磷蝦油乳液穩(wěn)定性實(shí)現(xiàn)了正向調(diào)控。環(huán)境脅迫穩(wěn)定性分析表明，模擬巴氏殺菌熱處理提高了磷蝦油乳液的物理穩(wěn)定性，且向弱堿性pH遷移過程中（pH6～9）表現(xiàn)出較強(qiáng)的物理穩(wěn)定性乳液。綜上所述，內(nèi)源性磷脂-WPI交互作用對構(gòu)建高物理穩(wěn)定性磷蝦油乳液和拓寬其在健康食品體系中的應(yīng)用提供了可能。