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    Necrostatin-1在高糖環(huán)境下促巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用及機(jī)制

    2021-12-16 13:40:00周婷周雪宋斌
    華西口腔醫(yī)學(xué)雜志 2021年6期
    關(guān)鍵詞:高糖牙周炎氧化應(yīng)激

    周婷 周雪 宋斌

    貴州省人民醫(yī)院口腔科,貴陽(yáng)550002

    牙周炎是發(fā)生在牙周支持組織的慢性炎癥性疾病,是成年人失牙的最主要原因[1]。第四次全國(guó)口腔流行病學(xué)調(diào)查[2]結(jié)果顯示,在35~44 歲的成年人中,缺失牙及全口失牙的比例分別是84.4% 和1.8%。此外,全球范圍內(nèi)患有重癥牙周炎的患者有近8 億,全口失牙的患者為2.67 億[3]。因此,牙周炎已經(jīng)成為威脅人類(lèi)健康的重要口腔疾病。近年來(lái)大量研究[4-5]表明,全身健康狀況對(duì)牙周炎的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用,其中糖尿病已被證實(shí)是牙周炎的重要危險(xiǎn)因素。中國(guó)糖尿病的患病率為14.8%,大約1.1 億成年人患有糖尿病,居世界首位,已成為威脅人民健康的重大慢性疾病[6-8]。因此深入探討糖尿病促牙周炎發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,對(duì)于進(jìn)一步揭示牙周炎的發(fā)病機(jī)制以及對(duì)牙周炎的防治具有重大意義。

    細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬作為目前研究較深入的程序性細(xì)胞死亡方式(programmed cell death,PCD),已被證實(shí)參與糖尿病相關(guān)牙周炎的發(fā)生發(fā)展[9]。課題組的前期文獻(xiàn)綜述[10]發(fā)現(xiàn),程序性細(xì)胞壞死為另一種新的PCD,參與調(diào)控牙周炎的發(fā)生發(fā)展;并有研究[11]表明,程序性細(xì)胞壞死也參與了糖尿病相關(guān)牙周炎的發(fā)生發(fā)展。受體相互作用蛋白1 (receptor interacting protein 1,RIP1) 是調(diào)控程序性細(xì)胞壞死的重要基因之一,能夠調(diào)控細(xì)胞死亡及炎癥反應(yīng)[12-13]。研究表明,RIP1既參與了牙周炎的發(fā)生發(fā)展[14],也能夠調(diào)控糖尿病的發(fā)展進(jìn)程[15]。課題組的前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[16]也證實(shí),高糖環(huán)境能夠促進(jìn)牙周組織中重要細(xì)胞——巨噬細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)。程序性細(xì)胞壞死特異性抑制劑Necrostatin-1 (Nec-1) 能夠通過(guò)下調(diào)RIP1的表達(dá),減輕高糖環(huán)境對(duì)細(xì)胞的促炎作用[17-19]。Nec-1 作為RIP1的特異性抑制劑,除了能夠抑制炎癥反應(yīng)外[20],還能夠抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[21-22]。由于氧化應(yīng)激反應(yīng)是糖尿病相關(guān)牙周炎的一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制[23-25]。而糖尿病能否通過(guò)調(diào)控RIP1 的表達(dá)影響牙周組織的氧化應(yīng)激反應(yīng),目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此本文在前期研究基礎(chǔ)上,繼續(xù)采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn),對(duì)Nec-1能否減輕高糖環(huán)境對(duì)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的促進(jìn)作用及其分子機(jī)制進(jìn)行探討。

    1 材料和方法

    1.1 主要材料

    Nec-1 (MCE 公司,美國(guó)),2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽熒光探針DCFA-DA、丙二醛(malondialdehyde,MDA) 檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),超氧化物歧化酶(superoxide diamutase,SOD) 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(南京建成生物工程研究所);RIP1、β-連環(huán)蛋白(β-catenin) 抗體(CST 公司,美國(guó));培養(yǎng)基、胎牛血清(Invitrogen 公司,美國(guó));互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementary DNA,cDNA) 合成試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR) 試劑盒(GeneCopoeia公司,美國(guó))。

    1.2 巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)及分組處理

    THP-1人單核細(xì)胞株(購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)),培養(yǎng)于含10% 胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS) 的杜氏改良細(xì)胞培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)中,培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2、飽和濕度,采用課題組前期研究[19]的方法,給予終濃度50 ng·mL-1的佛波酯(PMA) 誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞,每2 d 換液1次,將其誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞,巨噬細(xì)胞的分組處理如下。

    1.2.1 高糖對(duì)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 將用佛波酯誘導(dǎo)分化成功的巨噬細(xì)胞分為兩組:對(duì)照組與高糖組分別給予含葡萄糖濃度5.5 mmol·L-1與25 mmol·L-1的培養(yǎng)基培養(yǎng),兩組細(xì)胞均培養(yǎng)72 h后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS 含量,試劑盒檢測(cè)MDA與SOD水平。

    1.2.2 Nec-1 在高糖環(huán)境下對(duì)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響及RIP1 表達(dá)的影響 分為3 組:正常葡萄糖濃度(5.5 mmol·L-1)培養(yǎng)的對(duì)照組、高糖組(25 mmol·L-1葡萄糖)、 高糖+Nec-1 (5 μmol·L-1)組。3組細(xì)胞均培養(yǎng)72 h后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS 含量,MDA 與SOD 的生化試劑盒分別檢測(cè)MDA與SOD水平。

    1.2.3 RIP1 在高糖環(huán)境下對(duì)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 采用課題組前期研究[19]的方法構(gòu)建基因缺陷型細(xì)胞,即設(shè)計(jì)并合成3 條靶向RIP1 mRNA的干擾片段與陰性對(duì)照片段,將干擾片段分別轉(zhuǎn)染進(jìn)巨噬細(xì)胞中,經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量(quantitative real-time,qRT)-PCR 檢測(cè),確定干擾成功后使用最佳干擾效率的一條做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。巨噬細(xì)胞分組如下:高糖+si-NC組、高糖+si-RIP1組。巨噬細(xì)胞在高糖環(huán)境處理下,給予干擾片段處理,72 h 后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS 含量,試劑盒檢測(cè)MDA與SOD水平。

    1.3 ROS含量的檢測(cè)

    采用DCFA-DA 熒光探針檢測(cè)巨噬細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species,ROS) 水平:巨噬細(xì)胞分組處理結(jié)束后,加入10 μmol·L-1的DCFA-DA 熒光探針繼續(xù)培養(yǎng)30 min,無(wú)血清DMEM 洗滌細(xì)胞2~3次,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS含量。

    1.4 MDA及SOD活性的檢測(cè)

    巨噬細(xì)胞經(jīng)上述1.2 中各個(gè)分組(對(duì)照組;高糖組;高糖+Nec-1 組;高糖+si-NC 組;高糖+si-RIP1 組) 處理后,使用MDA 及SOD 活性試劑盒檢測(cè)每組細(xì)胞MDA及SOD活性,實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

    1.5 qRT-PCR檢測(cè)RIP1的基因表達(dá)

    給予分組處理后的巨噬細(xì)胞,按照試劑盒的要求用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA,按照常規(guī)qRTPCR 方法,對(duì)RIP1 的基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH) 為內(nèi)參基因。

    1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)RIP1的蛋白表達(dá)

    巨噬細(xì)胞分組處理后,棄去上清液,加入100 μL的裂解液,離心15 min,收集上清液,蛋白質(zhì)印跡法對(duì)RIP1進(jìn)行半定量檢測(cè)。

    1.7 統(tǒng)計(jì)方法

    采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)量數(shù)據(jù)按均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多于兩組的組間比較用單因素方差分析,P<0.05即認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 高糖環(huán)境對(duì)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

    流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS 的結(jié)果顯示,高糖組細(xì)胞內(nèi)的ROS 含量(圖1) 顯著高于對(duì)照組(P<0.000 1)。MDA 與SOD 試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示MDA活性(圖2A) 也較對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.000 1),SOD活性(圖2) 較對(duì)照組顯著降低(P<0.000 1)。這些結(jié)果表明,高糖環(huán)境誘發(fā)巨噬細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。

    圖1 高糖環(huán)境對(duì)THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞ROS的影響Fig 1 The effects of high glucose on ROS of THP-1 derived macrophages

    圖2 高糖環(huán)境對(duì)THP-1 來(lái)源的巨噬細(xì)胞MDA 及SOD 活性的影響Fig 2 The effects of hig glucose on MDA and SOD levels of THP-1 derived macrophages

    2.2 Nec-1 在高糖環(huán)境下對(duì)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的影響

    流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS 的結(jié)果如圖3 所示,高糖+Nec-1 組中細(xì)胞ROS 含量顯著低于高糖組(P<0.000 1)。MDA 與SOD 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示(圖4),與高糖組相比,在高糖+Nec-1 組MDA 活性顯著下調(diào)(P<0.000 1),SOD 活性(圖4) 顯著上升(P<0.01)。表明Nec-1 緩解高糖對(duì)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的促進(jìn)作用。

    圖3 Nec-1在高糖促細(xì)胞ROS上升中的作用Fig 3 The effects of Nec-1 on high glucose-induced ROS

    圖4 Nec-1在高糖致細(xì)胞MDA、SOD表達(dá)改變中的作用Fig 4 The effects of Nec-1 on high glucose-induced MDA and SOD

    2.3 Nec-1 對(duì)高糖環(huán)境下巨噬細(xì)胞中RIP1 表達(dá)的影響

    巨噬細(xì)胞在高糖環(huán)境下給予Nec-1 過(guò)表達(dá)后,qRT-PCR及WB檢測(cè)RIP1的表達(dá)。qRT-PCR與WB結(jié)果如圖5 示,高糖組RIP1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(分別為P<0.001、P<0.000 1);高糖+Nec-1 組RIP1 基因及蛋白表達(dá)卻顯著低于高糖組(P<0.000 1),這提示RIP1 參與高糖環(huán)境促巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

    圖5 Nec-1對(duì)高糖環(huán)境下巨噬細(xì)胞中RIP1表達(dá)的影響Fig 5 Effect of Nec-1 on the expression of RIP1 in macrophages under high glucose

    2.4 RIP1 對(duì)高糖環(huán)境下誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

    qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:RIP1 基因表達(dá)得到有效沉默(P<0.001)(圖6A)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS的結(jié)果顯示:與高糖+si-NC 組相比,高糖+si-RIP1 組的ROS 含量顯著降低(圖6B~D)。MDA與SOD 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示(圖6E、F):高糖+si-RIP1 組的MDA 活性顯著低于高糖+si-NC 組(P<0.001);高糖+si-RIP1 組的SOD 活性顯著高于高糖+si-NC組(P<0.000 1)。綜上,氧化應(yīng)激指標(biāo)的結(jié)果表明,沉默巨噬細(xì)胞內(nèi)RIP1 的表達(dá),能夠緩解高糖環(huán)境誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

    圖6 RIP1在高糖促細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用Fig 6 The role of RIP1 on high glucose-induced oxidative stress

    3 討論

    本研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)上,采用高糖環(huán)境(25 mmol·L-1的葡萄糖) 刺激THP-1 來(lái)源的巨噬細(xì)胞作為細(xì)胞模型,來(lái)探討糖尿病對(duì)牙周組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響及分子機(jī)制。有研究報(bào)道,糖基化終末產(chǎn)物能夠通過(guò)上調(diào)牙周膜干細(xì)胞的ROS 含量,激活了JNK 信號(hào)通路,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[26];此外,高糖環(huán)境能夠通過(guò)上調(diào)ROS 含量及MDA 活性、降低SOD 活性,抑制牙周膜干細(xì)胞的成骨分化能力[27];高糖環(huán)境還能通過(guò)上調(diào)細(xì)胞ROS 含量,抑制牙齦成纖維細(xì)胞的增殖和遷移[28],同時(shí)誘發(fā)牙齦上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[29]。上述研究提示,氧化應(yīng)激反應(yīng)在糖尿病促牙周炎發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,高糖環(huán)境所誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng),能夠影響牙周細(xì)胞的生物學(xué)功能,并能導(dǎo)致牙周細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)。本研究同樣證實(shí)了高糖環(huán)境能夠誘導(dǎo)牙周組織的重要細(xì)胞——巨噬細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)(圖1、2),與上述研究具有一致性。那么高糖環(huán)境促進(jìn)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制是什么?

    課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn),RIP1 的特異性抑制劑Nec-1能夠抑制高糖環(huán)境對(duì)巨噬細(xì)胞的促炎作用,但其能否抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。研究表明,Nec-1 能夠抑制氯化鈷所誘發(fā)的骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)[30],還能抑制神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[31]。Nec-1 能夠通過(guò)對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的有效抑制,減輕中暑導(dǎo)致的腸道損傷[32]、減輕腎臟缺血再灌注損傷[21],以及減輕順鉑導(dǎo)致的腎毒性[33]。上述研究表明,Nec-1 除了具有抗炎作用,還具有抗氧化應(yīng)激的作用,并能通過(guò)其抗氧化應(yīng)激的特性,減輕氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的其他病理改變。因此本研究對(duì)Nec-1在高糖環(huán)境促巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用也進(jìn)行了探討,如圖3和圖4 所示,Nec-1 能夠抑制高糖環(huán)境對(duì)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的促進(jìn)作用,與上述結(jié)果保持一致性。鑒于RIP1 是Nec-1 的主要作用靶點(diǎn),課題組檢測(cè)了RIP1 的表達(dá)量,結(jié)果顯示Nec-1 能夠抑制高糖環(huán)境對(duì)細(xì)胞RIP1 表達(dá)的促進(jìn)作用,提示RIP1 可能參與了氧化應(yīng)激反應(yīng)。研究表明,RIP1 能夠?qū)е戮€(xiàn)粒體功能紊亂從而促進(jìn)ROS 含量的上調(diào)[34],還能通過(guò)誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)而促進(jìn)壓迫環(huán)境下髓核細(xì)胞的凋亡[35],但RIP1 在糖尿病促牙周炎發(fā)生發(fā)展中的作用尚不明了。課題組采用小干擾RNA 技術(shù)有效沉默巨噬細(xì)胞的RIP1 表達(dá),進(jìn)一步探討RIP1 在高糖環(huán)境促巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用。轉(zhuǎn)染了si-RIP1 及si-NC 的巨噬細(xì)胞在高糖環(huán)境中培養(yǎng)后,課題組再次檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的改變,結(jié)果顯示,沉默RIP1 后,能夠抑制高糖環(huán)境對(duì)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的促進(jìn)作用,該結(jié)果也與上述研究的結(jié)論相一致。但RIP1 通過(guò)何種機(jī)制調(diào)控高糖環(huán)境促巨噬細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),將在今后的研究中進(jìn)一步去探討。

    綜上所述,本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了高糖環(huán)境通過(guò)上調(diào)RIP1的表達(dá),從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。通過(guò)本研究,能夠進(jìn)一步豐富糖尿病促牙周炎發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,同時(shí)為牙周炎的防治提供理論依據(jù)。

    利益沖突聲明:作者聲明本文無(wú)利益沖突。

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