高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定化妝品中9種二苯甲酮類紫外吸收劑的含量

魯素雅,邢海艷,劉 洋,吳義春,金 鵬,陳長毅

(淮安市食品藥品檢驗所,淮安 223005)

在化妝品中,防曬類產(chǎn)品因具有保護人體免受紫外線輻射損傷的功能而受廣大消費者的青睞,其中有效成分是防曬劑[1-4]。防曬劑按防曬機制可分為物理防曬劑和化學防曬劑兩大類。物理防曬劑是指能反射或散射紫外輻射的化合物,化學防曬劑是指能吸收有害紫外輻射的有機化合物,通常又稱紫外吸收劑[2]。紫外吸收劑對皮膚有保護作用,但過量使用也會影響皮膚健康,如過敏、泛紅、光敏、發(fā)炎等[5]。

二苯甲酮類(BPs)防曬劑是芳香酮類化合物,由于其吸收波長廣,吸收性好,被廣泛添加于化妝品、紡織品中。同時二苯甲酮類化合物也是環(huán)境激素,會干擾人體內(nèi)分泌,造成精子數(shù)量減少,并導致不孕癥,因此國內(nèi)外對化學防曬劑的使用種類和使用量都有明確的規(guī)定[6-9]。目前,《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)僅提供了二苯酮-2(BP-2)、二苯酮-3(BP-3)、二苯酮-4(BP-4)和二苯酮-5(BP-5)等4種二苯甲酮類化合物的檢測方法,其中BP-5是BP-4的鈉鹽形式,在流動相中多以BP-4的形式存在,但仍有很多化合物并未收納在現(xiàn)行有效的國家標準中,對于防曬劑的監(jiān)管仍欠缺[10]。二苯甲酮類化合物的測定方法主要包括氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[10-17]。其中,液相色譜法和氣相色譜法檢測靈敏度低于質(zhì)譜法,對于非準用化妝品防曬劑的檢測優(yōu)先考慮使用質(zhì)譜法檢測;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法主要適用于低沸點物質(zhì)的檢測,由于化妝品基質(zhì)較復雜,故優(yōu)先考慮使用專屬性、通用性更高的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測二苯酮類化合物。

本工作建立了同時測定9種二苯甲酮類化合物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS),為二苯甲酮類化合物的監(jiān)管與產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了更多的思路。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

AB QTRAP 4500 型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀與AB QQQ 4000＋型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,均配有Turbo-V 離子源、蠕動泵和Analyst1.5.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);Waters Acquity型超高效液相色譜儀;U3000型高效液相色譜儀;XS205D 型電子天平;XP-6 型電子天平;Millipore 型超純水機;KQ-250DV 型超聲清洗儀。

混合標準溶液Ⅰ:1.0 mg·L－1,分別取各對照品適量,加乙腈溶解,稀釋制成各組分質(zhì)量濃度均為1.0 mg·L－1的混合標準溶液Ⅰ。使用時用乙腈稀釋至所需質(zhì)量濃度。

混合標準溶液Ⅱ:分別取各對照品適量,加乙腈溶解,稀釋制成二苯酮-1(BP-1)、BP-3、二苯酮-6(BP-6)、二苯酮-8(BP-8)的質(zhì)量濃度均為0.3 mg·L－1,二苯酮-10(BP-10)、二苯酮-12(BP-12)的質(zhì)量濃度 均為0.15 mg·L－1,BP-2的質(zhì)量濃度為0.4mg·L－1,BP-4的質(zhì)量濃度為6 mg·L－1,二苯酮-7(BP-7)的質(zhì)量濃度為2 mg·L－1的混合標準溶液Ⅱ。

BP-1(純度100%,規(guī)格500 mg)、BP-2(純度99.5%,規(guī) 格250 mg)、BP-3(純 度99.8%,規(guī) 格100 mg)、BP-4(純度94.7%,規(guī)格100 mg)、BP-6(純度100%,規(guī)格100 mg)、BP-7(純度100%,規(guī)格100 mg)、BP-8(純度100%,規(guī)格100 mg)、BP-10(純度100%,規(guī)格50 mg)、BP-12(純度100%,規(guī)格250 mg);乙腈、四氫呋喃為色譜純;高氯酸為優(yōu)級純;試驗用水為一級水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Waters ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);柱溫30 ℃;流量0.3 mL·min－1;進樣量2μL;流動相A為0.1%(體積分數(shù))甲酸溶液,B 為乙腈;梯度洗脫程序:0～4.0 min時,A 為40%;4.0～4.5 min時,A由40%降至5%,保持5.5 min;10.0～10.1 min時,A 由5%跳轉(zhuǎn)至40%,保持1.9 min。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子(ESI)源;正離子掃描模式;多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式;碰撞氣壓力68.95kPa,氣簾氣壓力206.85kPa,霧化氣壓力379.225 k Pa,輔助氣壓力379.225 k Pa;毛細管電壓4500 V;霧化溫度500 ℃。監(jiān)測離子對及相關(guān)參數(shù)設(shè)定見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS Parameters

1.3 試驗方法

稱取樣品0.1 g置于50 mL 具塞試管中,加乙腈30 mL,超聲提取30 min,冷卻至室溫,稀釋至50 mL,靜置,過濾,取續(xù)濾液用于HPLC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理中提取劑的選擇

參考《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)“5.1”“5.2”中防曬劑檢測的提取溶劑[10],試驗選取乙腈、四氫呋喃、體積比250∶450∶300∶0.2的甲醇-四氫呋喃-水-高氯酸混合溶劑等作為提取劑,比較了使用3種不同提取劑時各組分的回收率,結(jié)果見表2。

表2 使用不同提取劑時各組分的回收率Tab.2 Recovery of each component with different extractants %

由表2可知,以四氫呋喃和混合溶劑提取時,基質(zhì)干擾嚴重,其中BP-4的回收率較低,BP-12的回收率偏高。從試劑配制簡便性、試劑毒性大小、回收率結(jié)果等方面綜合考慮,試驗選擇的提取劑為乙腈。

2.2 取樣量的影響

試驗比較了在0.1,0.2,0.4 g等不同取樣量條件下各組分的回收率,結(jié)果見表3。

表3 在不同取樣量下各組分的回收率Tab.3 Recovery of each component with different sampling amounts %

由表3可知,不同取樣量下各組分的回收率差異不明顯。同時用IBM SPSS Statistics 22統(tǒng)計軟件對檢測結(jié)果進行組間配對樣本t檢驗,檢驗結(jié)果P值均大于0.05,說明不同的取樣量對樣品各組分回收率的影響無統(tǒng)計學差異。從化妝品中防曬劑添加量角度考慮,多為常量檢測,因此取樣量設(shè)定為0.1 g,如遇不同樣品時可適當調(diào)整取樣量或稀釋樣品。

2.3 耐用性試驗

在HPLC-MS/MS 分析時,試驗分別采用Waters ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)、費羅門Kinetex?C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、Waters ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(50mm×2.1 mm,1.7μm)等不同的色譜柱,調(diào)整流動相比例,并分別使用AB QTRAP 4500型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀與AB QQQ 4000＋型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀等不同的儀器進樣,記錄色譜圖。結(jié)果表明,采用不同色譜柱和不同儀器分析時,9種組分分離效果均較好,響應(yīng)值較高,說明方法耐用性較好,對色譜柱、儀器等要求較低。在1.2節(jié)儀器工作條件下,所得色譜圖見圖1。

圖1 各組分在HPLC-MS/MS分析時的色譜圖Fig.1 Chromatogram of each component analyzed by HPLC-MS/MS

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

試驗選取防曬噴霧類、防曬霜類、隔離霜類、粉底液類等4種典型的空白基質(zhì)樣品,按照試驗方法分別制備空白基質(zhì)溶液。用空白基質(zhì)溶液配制基質(zhì)匹配的混合標準溶液系列,按儀器工作條件測定,并繪制工作曲線。將4種典型基質(zhì)匹配的工作曲線的斜率(k1)與用乙腈配制的混合標準溶液系列制作的標準曲線的斜率(k2)進行比較,斜率的比值見表4。斜率比值越接近1,說明基質(zhì)效應(yīng)越小。

表4 基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果Tab.4 Results of matrix effect

由表4可知,采用HPLC-MS/MS測定時,兩種曲線的斜率比值為0.808～1.118,說明該方法的基質(zhì)效應(yīng)較小,可不予考慮。試驗直接采用不含基質(zhì)的混合標準溶液進行定量分析。

2.5 標準曲線、檢出限和測定下限

分 別 取0.01,0.02,0.05,0.1,0.2,0.5,1,2,5 mL混合標準溶液Ⅰ置于10 mL 容量瓶中,用乙腈稀釋,制成混合標準溶液系列。按儀器工作條件測定,以各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標,其對應(yīng)的響應(yīng)值為縱坐標繪制標準曲線。各組分的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表5。

參考《中華人民共和國藥典》(2015年版)四部中檢出限與測定下限常用的基于響應(yīng)值標準偏差和標準曲線斜率法,分別取0.1 g樣品加入5μL 混合標準溶液Ⅱ,按試驗方法處理后,取2μL進樣,溶液連續(xù)進樣11次,計算各組分響應(yīng)值的標準偏差(s)。按3倍的標準偏差與標準曲線斜率(k)的比值計算檢出限(3s/k),按10倍的標準偏差與標準曲線斜率的比值計算測定下限(10s/k),結(jié)果見表5。

表5 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.5 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.6 穩(wěn)定性試驗

取100μg·L－1混合標準溶液,按儀器工作條件連續(xù)進樣6次,計算各組分測定值的相對標準偏差(RSD),以驗證儀器的穩(wěn)定性。結(jié)果表明,BP-1、BP-2、BP-3、BP-4、BP-6、BP-7、BP-8、BP-10、BP-12測定值的RSD依次為2.0%,1.9%,3.3%,3.0%,4.0%,2.8%,4.9%,1.8%,2.5%,RSD均小于5.0%,說明儀器性能穩(wěn)定,檢測方法可行。

取100μg·L－1混合標準溶液,室溫放置0,2,4,6,8,12,24,36,48,72 h 后,按儀器工作條件進樣,記錄各組分的響應(yīng)值,觀察溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明,測定時各組分的響應(yīng)值無明顯變化,說明溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.7 精密度和回收試驗

按照試驗方法對空白樣品進行3個濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平平行測定6次,計算回收率和測定值的RSD,結(jié)果見表6。

由表6可知,各組分的回收率為70.9%～116%,RSD 為1.8%～12%,說明該方法適用于9種二苯甲酮類化合物的測定。

表6 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.6 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.8 樣品分析

按試驗方法對防曬霜類、粉底液類、隔離霜類、防曬噴霧類等4種不同基質(zhì)的15批樣品進行測定,其中2批檢出BP-3,檢出量分別為1.53%和4.67%,1批檢出BP-10,檢出量為0.00126%。典型樣品的色譜圖如圖2所示,在15批樣品檢測過程中未發(fā)現(xiàn)有干擾目標物測定的雜質(zhì)峰,采用HPLC-MS/MS測定時可減小假陽性、假陰性出現(xiàn)的概率。

圖2 防曬霜類樣品的色譜圖Fig.2 Chromatogram of the sunscreen sample

本工作建立了HPLC-MS/MS同時測定化妝品中9種二苯甲酮類紫外吸收劑含量的方法,以乙腈為溶劑,超聲提取溶解,以C18色譜柱分離目標物,采用ESI源,正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式進行檢測。該方法流動相配制簡便,分析快速,基質(zhì)干擾小,準確度高,分離效果好,可滿足含此類防曬劑化妝品的分析要求。