丙烯酰胺對(duì)小鼠腸道屏障損傷作用

雷艾彤，蘇 丹，聶春超，郭子妍，元同驥，陳 奕

(南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西 南昌 330047)

丙烯酰胺(Acrylamide,AA)是常見的工業(yè)助劑[1]，在化工、紡織、廢水處理、醫(yī)療美容等各行各業(yè)中均有普遍應(yīng)用[2]。研究表明丙烯酰胺具有多種毒性，例如神經(jīng)毒性[3]、遺傳毒性[4]、生殖毒性[5]、致癌性[6]、致畸性[7]等，并且可以在體內(nèi)蓄毒，會(huì)引起急性、亞急性和慢性中毒[8]。自瑞典研究人員于2002年首次在油炸馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺后，各國(guó)食品領(lǐng)域的研究者們陸續(xù)在食品中檢測(cè)到丙烯酰胺的存在，進(jìn)一步證實(shí)了其在飲食中的暴露情況。研究表明，經(jīng)高溫烹調(diào)的淀粉類食品中均含有丙烯酰胺，這主要是天冬門酰胺和還原糖美拉德反應(yīng)的結(jié)果[9-10]。丙烯酰胺的日常暴露給對(duì)人類帶來了潛在的重大風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也是食品安全研究人員亟待解決的重要命題。在1994年，丙烯酰胺被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)列為人類可能致癌物質(zhì)(2A類)[11]。由于各地區(qū)飲食習(xí)慣以及生活環(huán)境差異，不同人群丙烯酰胺暴露情況差異較大[12-13]。我國(guó)在最新膳食研究中得出的丙烯酰胺日均攝入量為0.319 μg/(kg bw·d)[14-15]，顯著低于世界平均水平1 μg/(kg bw·d)[16]。目前大多數(shù)對(duì)于丙烯酰胺腸道屏障損傷的研究停留在體外實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)研究還不夠深入[17-18]，對(duì)于不同劑量暴露下的損傷情況對(duì)比也鮮有報(bào)道。

本研究通過建立不同濃度下丙烯酰胺染毒模型，對(duì)不同暴露量下小鼠機(jī)體情況及腸道損傷程度進(jìn)行對(duì)比。檢測(cè)不同劑量丙烯酰胺在氧化指標(biāo)、組織結(jié)構(gòu)、蛋白表達(dá)等層面對(duì)腸道屏障損傷的程度，評(píng)估丙烯酰胺劑量與腸道屏障損傷情況的關(guān)系。為后續(xù)研究丙烯酰胺的膳食預(yù)防和天然活性物質(zhì)的毒性控制提供理論基礎(chǔ)和研究依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料與試劑

丙烯酰胺(純度>99.9%)購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

雄性KM小鼠，5周齡，20.0±2.0g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按南昌大學(xué)動(dòng)物倫理評(píng)審委員會(huì)批準(zhǔn)的程序和許可(SYKX-2015-0001)進(jìn)行。

Anti-ZO1緊密連接蛋白抗體、Anti-Occludin抗體、Anti-Claudin 1抗體、Anti-MyD88抗體、Anti-TLR4抗體、Anti-NF-kB p65抗體均購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。過氧化氫酶(Catalase，CAT)、微量還原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、D-乳酸試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；BeyoECL Star(特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、BCA蛋白濃度試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物科技有限公司；D-乳酸酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)于武漢博士德公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

3K15高速臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)、3001全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)、A10超純水儀(美國(guó)Millipore公司)、2HWY-2102生化培養(yǎng)箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器公司)、KZ-II組織破碎儀(武漢塞維爾生物科技有限公司)、AL104型電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)、RE-52AA旋蒸儀(上海亞榮生化儀器廠公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型的建立

選用KM小鼠，體重20.0±2.0 g，共計(jì)25只，在溫度25 ℃±2 ℃，濕度%的環(huán)境下，12/12 h晝夜循適應(yīng)性靜養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為正常組(C組)、低劑量組(L組)、中劑量組(M組)、高劑量組(H組)。正常組灌胃等體積生理鹽水；低劑量組灌胃濃度為10 mg·kg-1·bw的丙烯酰胺水溶液、中劑量組灌胃濃度為20 mg·kg-1·bw的丙烯酰胺水溶液、高劑量組灌胃濃度為30 mg·kg-1·bw的丙烯酰胺水溶液。每天灌胃1次，持續(xù)30 d。末次灌胃24 h后對(duì)小鼠進(jìn)行最后1次稱重，摘眼球取血后，頸椎脫臼處死。并立即解剖收集小腸等臟器，置于-80 ℃儲(chǔ)存。分組及模型建立如圖1所示：

圖1 動(dòng)物模型建立

1.3.2 小鼠一般行為情況觀察

在實(shí)驗(yàn)期間觀察并記錄小鼠每日精神狀態(tài)、行為表現(xiàn)、毛發(fā)光澤度、進(jìn)食情況，有無(wú)死亡情況等，有明顯行為差異情況拍照記錄。

1.3.3 小鼠體重及肝臟指數(shù)的測(cè)定

靜養(yǎng)1周后，從第8天開始于每日灌胃前對(duì)小鼠進(jìn)行稱重記錄，并將體重?cái)?shù)據(jù)繪制成圖，觀察實(shí)驗(yàn)期間小鼠體重變化情況。

將解剖分離的肝臟經(jīng)生理鹽水漂洗后，用濾紙吸干多余水分并稱重記錄。將肝臟重量(mg)與體重(g)的比值表示肝臟指數(shù)數(shù)值：器官指數(shù)=器官重量/小鼠體重。

1.3.4 小腸病理變化檢查

取小鼠小腸空腸部分約2 cm左右組織，于生理鹽水中輕輕漂洗，祛除表面血跡。放入10%中性福爾馬林溶液中固定。用石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅(hematoxylineosin，HE)染色、馬松(Masson)染色，光鏡下觀察并拍照。

1.3.5 小腸組織氧化指標(biāo)測(cè)定

稱取100 mg左右小腸組織，按照m:v=1:9的比例加入同等體積的生理鹽水，加入鋼珠后于60 Hz條件下破碎6 min，后于8 000 r·min-1，4 ℃條件下離心15 min。吸取組織上清液，參考說明書測(cè)定SOD、CAT、GSH和MDA含量。

SOD酶活力單位定義：在黃嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時(shí)反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個(gè)酶活力單位(unit)。CAT酶活性單位定義：在25 ℃，pH=7.0的條件下，在1 min內(nèi)可以催化分解1 μmol過氧化氫定義為一個(gè)酶活力單位(μnit)。

1.3.6 小腸通透性情況測(cè)定

血樣在室溫下靜置2 h，隨后在4 ℃，6 000 r·min-1條件下離心10 min，獲得血清。參考說明書步驟測(cè)定血清中D-乳酸含量。

1.3.7 緊密連接蛋白Western Blot的檢測(cè)

(1)提取組織樣品蛋白

稱取小腸組織50 mg按比例m:v=1:10加入500 μL IP裂解液，再加入比例為ip:PUSF=100:1的PMSF防止組織蛋白質(zhì)被蛋白酶融解；

將裂解液的腸組織破碎器70 Hz 120 s進(jìn)行破碎，4 ℃，10 000 r·min-1離心4 min。取400 μL上清液加入空白EP管內(nèi)，按比例5:1加入80 μL 6x SDS蛋白上樣緩沖液；

金屬浴95 ℃，6 min后快速預(yù)冷放入-20 ℃冰箱儲(chǔ)存。

(2)制膠

表1 SDS-PAGE制膠配方

(3)上樣與電泳

S1:80 V,25 min; S2:120 V，1 h。

(4)轉(zhuǎn)膜與孵育

采用半干轉(zhuǎn)，將PVDF膜剪好后置甲醇中浸泡活化，按照濾紙PVDF膜-膠-濾紙，形成“三明治”結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)膜后，在1%牛血清蛋白中，室溫封閉40 min。

孵育一抗：將PVDF膜分別孵育在配好的一抗工作液(一抗：TBST=1:1 000)中(或按照說明書要求)，4 ℃過夜(或按說明書要求)。次日回收一抗工作液，加入適量的TBST置搖床上洗膜，10～15 min/次，重復(fù)3次。

孵育二抗：將PVDF膜分別孵育在配好的二抗工作液(二抗：TBST=1:10 000)中，(注意不同的一抗對(duì)應(yīng)的二抗)室溫?fù)u床40 min(或1 h，看說明書具體要求)。加入適量的TBST，置搖床上洗膜，15 min/次，重復(fù)3次。

(5)顯影

將BeyoECL Star (特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)顯影A液：B液=1：1的比例配制ECL工作液，均勻加到PVDF膜上，置于BioRad凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件分析，并重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示；采用Graph Pad Prism 6軟件作圖；采用單因素方差分析和Tukey’s多因素t檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠一般表觀情況觀察及死亡率

在丙烯酰胺造模期間，高劑量組于第28天、第30天分別出現(xiàn)一只中毒死亡的小鼠，其余各組均無(wú)小鼠死亡。L組的小鼠在實(shí)驗(yàn)全過程中并未出現(xiàn)明顯的異常行為；M組自染毒第22天、高劑量自染毒第15天起，出現(xiàn)聚團(tuán)取暖、嗜睡怕冷、后肢乏力、尿量增多、暴躁易怒、毛發(fā)凌亂無(wú)光澤等現(xiàn)象。在造模后期，M、H組內(nèi)癱瘓情況普遍，小鼠失去正常行動(dòng)能力。這表明丙烯酰胺的蓄積毒性開始體現(xiàn)。有專家學(xué)者基于生理學(xué)毒性代謝動(dòng)力學(xué)模型及非線性計(jì)量反應(yīng)法神經(jīng)毒性邊際劑量為40 μg/(kg bw·d)[19-20]，本實(shí)驗(yàn)得出小鼠在20 mg·kg-1·bw劑量下持續(xù)染毒22 d、30 mg·kg-1·bw劑量下持續(xù)染毒15 d即出現(xiàn)明顯神經(jīng)毒性癥狀。

2.2 不同濃度AA致小鼠體重變化及肝臟指數(shù)變化

如圖2所示，在實(shí)驗(yàn)造模前所有小鼠經(jīng)過7天靜養(yǎng)后，體重均為(31.0±2.0) g。在灌胃造模最初13 d內(nèi)，所有組別的小鼠體重正常上升。在(13～20) d，3個(gè)丙烯酰胺組的體重上升趨勢(shì)較正常組稍有放緩。在20 d后，H組體重持續(xù)下降，在30 d時(shí)體重較正常組下降16.7%；L組和M組體重上升趨勢(shì)變化不明顯。表明在10 mg·kg-1.bw劑量下，30 d的實(shí)驗(yàn)期間丙烯酰胺在小鼠體內(nèi)的蓄積毒性在體重減少上體現(xiàn)并不明顯。在20和30 mg·kg-1·bw

天數(shù)/d圖2 不同劑量丙烯酰胺致小鼠體重變化情況

劑量下，分別于20和15 d有影響體重增長(zhǎng)的情況出現(xiàn)，尤其在高劑量組小鼠的體重較正常生長(zhǎng)趨勢(shì)下降十分顯著(P<0.05)。

肝臟是體內(nèi)的重要解毒器官，因此肝臟也是丙烯酰胺重要的靶器官。前期研究也表明，丙烯酰胺會(huì)導(dǎo)致肝臟損傷，肝功能受損[21]。因此本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了小鼠的肝臟指數(shù)，結(jié)果如圖3所示。正常組小鼠的肝臟指數(shù)為51.3 mg·g-1，高于3個(gè)模型組，肝臟指數(shù)也隨著丙烯酰胺的濃度上升而下降，并且高劑量組肝臟指數(shù)較正常組顯著下降(P<0.05)，且觀察到肝臟組織顏色較正常組明顯加深、表面顆粒狀組織明顯。與前期研究觀察到丙烯酰胺致肝臟損傷的表觀情況一致[31]。表明10～30 mg·kg-1.bw的丙烯酰胺連續(xù)造模30 d均會(huì)造成肝臟損傷，不同程度的影響肝臟的組織結(jié)構(gòu)。

AA/(mg·kg-1)#P<0.05,##P<0.01，下同。圖3 不同劑量丙烯酰胺致小鼠肝臟指數(shù)變化情況

2.3 不同濃度AA致小鼠小腸組織病理變化情況

小腸是機(jī)體中最重要的吸收器官之一，絨毛-隱窩軸作為腸黏膜的基本功能單位，腸絨毛的高度決定了小腸與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積。本實(shí)驗(yàn)通過HE染色法觀察小鼠小腸組織結(jié)構(gòu)形態(tài)，如圖4A所示，正常組的小腸絨毛排布整齊有序，規(guī)則清晰。而隨著丙烯酰胺濃度上升，各模型組小腸絨毛長(zhǎng)度呈顯著下降。小腸絨毛排布混亂，且高劑量組上皮細(xì)胞邊界模糊，腸道機(jī)械屏障明顯受損。以上結(jié)果表明丙烯酰胺會(huì)對(duì)小腸上皮造成損傷，降低絨毛高度、加寬隱窩寬度，影響腸道正常組織結(jié)構(gòu)，且呈劑量依賴性。通過Masson染色法觀察小鼠小腸組織的纖維化情況，結(jié)果由圖4B所示，但小腸組織纖維化并不明顯。以上結(jié)果表明，丙烯酰胺會(huì)明顯損傷腸黏膜組織結(jié)構(gòu)，破壞小腸黏膜機(jī)械屏障，尚未觀察到明顯的纖維化病變。

2.4 不同濃度AA致小鼠小腸氧化損傷

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)屬

(A)組織形態(tài)觀察(200×)

(B)纖維化情況觀察(200×)圖4 不同濃度丙烯酰胺對(duì)小腸組織結(jié)構(gòu)和纖維化影響

于內(nèi)源性抗氧化酶，可以保護(hù)機(jī)體免受自由基的侵害，并且在對(duì)抗脂質(zhì)過氧化和過氧化氫的有害生理效應(yīng)中發(fā)揮重要作用[22]。還原型谷胱甘肽(GSH)是機(jī)體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化物，同時(shí)也是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的底物。SOD將ROS轉(zhuǎn)化為過氧化氫，然后CAT和GSH-Px將其降解為水和氧[23]。丙二醛(MDA)是一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，也是反映生物體內(nèi)氧化應(yīng)激情況的重要生物標(biāo)志物[24]。

如圖5所示，與正常組相比，各丙烯酰胺組中MDA含量均顯著(P<0.05)升高，高劑量組極顯著升高(P<0.01)。且經(jīng)丙烯酰胺造模后，小腸組織中抗氧化酶CAT和SOD含量顯著降低(P<0.01)，抗氧化物GSH的含量也有不同程度降低，且高劑量組明顯低于另外兩個(gè)劑量組。這些結(jié)果表明，丙烯酰胺會(huì)造成小鼠小腸組織脂質(zhì)過氧化，降低抗氧化酶活性，破壞正常體內(nèi)的氧化還原系統(tǒng)，從而造成小鼠小腸氧化損傷。并且也有研究顯示丙烯酰胺會(huì)造成小鼠體內(nèi)脂肪消化吸收相關(guān)通路標(biāo)志蛋白的差異性表達(dá)，這與MDA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，證明脂肪的代謝可能是丙烯酰胺造成小腸損傷的作用途徑之一[25]。

AA/(mg·kg-1)

AA/(mg·kg-1)

AA/(mg·kg-1)

AA/(mg·kg-1)

2.5 不同濃度AA致小鼠腸道通透性變化

作為腸道中普遍的細(xì)菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物，D-乳酸可由腸道中多種細(xì)菌形成[26-27]。在日常食物攝取后較少被吸收，且體內(nèi)無(wú)法將其快速降解。腸道中的D-乳酸會(huì)在腸黏膜受損導(dǎo)致腸道通透性增加時(shí)進(jìn)入血液，使血漿中D-乳酸水平升高[28]。因此，血液中的D-乳酸水平可以作為監(jiān)測(cè)腸黏膜損害程度和通透性的指標(biāo)。如圖6所示，丙烯酰胺造模后的各組血清中D-乳酸的含量較正常組均有上升，其中低劑量組上升差異性最為明顯。表明丙烯酰胺會(huì)增加腸黏膜的通透性，破壞小腸機(jī)械物理屏障功能，導(dǎo)致腸道內(nèi)的細(xì)菌代謝產(chǎn)物透過腸黏膜進(jìn)入血液中，造成血清內(nèi)抗原含量上升，打破機(jī)體內(nèi)原有的免疫平衡。而低劑量血清中D-乳酸水平高于中、高劑量組，猜測(cè)可能是由于丙烯酰胺改變了腸道中的腸道菌群組成，從而影響細(xì)菌產(chǎn)物，造成D-乳酸的生成量下降。

AA/(mg·kg-1)圖6 不同濃度丙烯酰胺致小鼠血清中D-乳酸含量的影響

2.6 不同濃度AA對(duì)小鼠腸道緊密連接蛋白的影響

緊密連接(Tight junction)蛋白是小腸細(xì)胞表達(dá)的一類與腸道通透性和機(jī)械屏障密不可分的蛋白，他們能夠通過建立固有層來有效抵御腸道內(nèi)的毒素和微生物病原體等等[29]，這也是腸道保護(hù)中最重要的防御屏障。腸上皮細(xì)胞間主要通過緊密連接蛋白相連。因此緊密連接蛋白的表達(dá)情況能夠切實(shí)的表明腸道受損程度和通透性情況，當(dāng)緊密連接蛋白的表達(dá)下降時(shí)，腸上皮細(xì)胞間的間隙會(huì)增大，腸道通透性會(huì)上升，此時(shí)表明腸黏膜受到破壞。因此其是評(píng)價(jià)腸道健康程度的重要指標(biāo)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。緊密連接蛋白存在于上皮細(xì)胞的頂端，由跨膜蛋白和外周蛋白間相互作用而成，受多種機(jī)制共同調(diào)控。其中ZO家族是最主要的緊密連接蛋白家族[30]，而ZO-1是家族中維持細(xì)胞形態(tài)的重要組成部分，它可以與Occludin相結(jié)合確保腸上皮細(xì)胞的完整性和封閉性。

通過western blot手段對(duì)各組間Claudin、Occludin及ZO-1緊密連接蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。可以通過圖7看到，丙烯酰胺誘導(dǎo)后，各組中3種緊密連接蛋白的表達(dá)都有顯著下降，并且下降程度和丙烯酰胺濃度呈正相關(guān)。這表明丙烯酰胺濃度越高，給小鼠小腸造成的損傷越嚴(yán)重，這與3.3中小腸組織切片結(jié)果一致。表明丙烯酰胺產(chǎn)生的體內(nèi)毒性會(huì)降低小腸組織中緊密連接蛋白的表達(dá)，通過影響緊密連接蛋白的方式增大上皮細(xì)胞間間隙，造成腸道通透性升高，損傷小腸機(jī)械屏障。后續(xù)可能會(huì)造成腸道內(nèi)的病原體進(jìn)入體液循壞，打破體內(nèi)免疫平衡。

AA/(mg·kg-1)

AA/(mg·kg-1)

AA/(mg·kg-1)

AA/(mg·kg-1)圖7 不同濃度丙烯酰胺致小鼠腸組織緊密連接蛋白的影響

3 結(jié)論

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)10～30 mg·kg-1·bw劑量范圍內(nèi)丙烯酰胺連續(xù)灌胃30 d均會(huì)對(duì)小鼠小腸造成不同程度的損傷。當(dāng)日劑量達(dá)到30 mg·kg-1·bw時(shí)，連續(xù)灌胃30 d，會(huì)造成小鼠體重明顯下降，全部出現(xiàn)后肢癱瘓等癥狀，甚至有死亡情況。此外，丙烯酰胺會(huì)破壞機(jī)體內(nèi)抗氧化平衡，丙烯酰胺染毒后小腸組織出現(xiàn)明顯病理?yè)p傷，絨毛長(zhǎng)度變短、排列雜亂，但尚未造成明顯腸道纖維化病變。并且會(huì)通過降低緊密連接蛋白的表達(dá)造成腸黏膜上皮細(xì)胞間隙變大，增加腸道通透性，造成腸道機(jī)械屏障損傷。還會(huì)導(dǎo)致腸道內(nèi)微生物產(chǎn)物進(jìn)入體液循環(huán)中，破壞體內(nèi)免疫平衡。以上研究表明高于10 mg·kg-1·bw劑量單位的丙烯酰胺持續(xù)攝入30 d后均會(huì)造成小鼠小腸屏障損傷。