RNA酶Rrp44的結(jié)構(gòu)和功能

劉洪巖，薛暉，張世勇，趙彥華，王明華，邊文冀，陳校輝

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

細(xì)胞內(nèi)核糖核酸（RNA）的合成和降解必須達(dá)到一個(gè)微妙的平衡，破壞這種平衡會(huì)對細(xì)胞功能產(chǎn)生重大影響[1]，在這一平衡中，基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后降解起到同樣重要的作用。RNA降解涉及許多復(fù)雜且相互關(guān)聯(lián)的途徑，其中RNA酶起到了重要作用。除了作為一種基因調(diào)控手段，RNA酶還可以清除異常信使核糖核酸（mRNA），以防止有毒蛋白質(zhì)產(chǎn)品的積累。此外，大多數(shù)初級轉(zhuǎn)錄本都經(jīng)過RNA酶的剪切，才能產(chǎn)生具有多種功能的成熟RNA。

Rrp44是一種高度保守的3’到5’外切RNA酶，是RNA外切酶復(fù)合體的催化亞基[2]。Rrp44在RNA代謝中具有多種功能，包括mRNA質(zhì)量控制[3]、基因表達(dá)調(diào)控[4]和小RNA加工[5]，同時(shí)，Rrp44在生物體水平上與染色體分離[6]，B細(xì)胞中抗體的多樣化相關(guān)?，F(xiàn)簡述Rrp44的結(jié)構(gòu)及分子和生物學(xué)功能。

1 Rrp44的結(jié)構(gòu)、功能以及亞細(xì)胞定位

Rrp44同源物屬于核糖核酸酶Ⅱ（RNase II）超家族，該家族成員具有很高的序列保守性和功能保守性[5]。Rrp44由一個(gè)具有外切酶活性RNB結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)CSDS結(jié)構(gòu)域、一個(gè)S1結(jié)構(gòu)域、一個(gè)具有內(nèi)切酶活性PIN結(jié)構(gòu)域以及N端含有三個(gè)半胱氨酸殘基的CR3結(jié)構(gòu)域[6]組成。

Rrp44是一種高效的RNA酶，從3’到5’端水解單鏈RNA，一次釋放一個(gè)核苷酸。Rrp44外切酶的活性主要依賴RNB催化中心的4個(gè)保守的天冬氨酸殘基以及與其相互作用的兩個(gè)鎂離子[7]，該位點(diǎn)埋在狹窄通道的底部，只有含有7個(gè)以上核苷酸的單鏈RNA才能通過該結(jié)構(gòu)域；同時(shí)，RNB活性位點(diǎn)可以識(shí)別具有分子內(nèi)或分子間二級結(jié)構(gòu)的底物，只要在RNA的5’端有4～5 nt的未配對核苷酸，Rrp44就可以進(jìn)行降解。催化結(jié)構(gòu)PIN的活性位點(diǎn)由四種酸性氨基酸組成，它們與兩種二價(jià)金屬陽離子結(jié)合。PIN結(jié)構(gòu)域不能降解雙鏈RNA，但是環(huán)狀和線性單鏈RNA都是它的底物[8]。

核酸酶的亞細(xì)胞定位是RNA表達(dá)后調(diào)控的重要機(jī)制。一般認(rèn)為Rrp44位于核內(nèi)，但是在細(xì)胞質(zhì)中也發(fā)現(xiàn)少量的Rrp44。然而不同種類的細(xì)胞，Rrp44的亞細(xì)胞定位不同，在一些果蠅S2細(xì)胞中，Rrp44存在于細(xì)胞質(zhì)中，在HEK-293細(xì)胞系Rrp44僅在細(xì)胞核中表達(dá)。同時(shí)，Rrp44還可以根據(jù)細(xì)胞周期進(jìn)程或生長條件的變化改變其亞細(xì)胞定位。Rrp44的細(xì)胞核定位是由C端兩個(gè)核定位信號控制的。N端結(jié)構(gòu)域似乎也有助于Rrp44亞細(xì)胞定位，但是N端不存在核定位序列[9]。目前認(rèn)為，N端結(jié)構(gòu)域可能包含一個(gè)額外的調(diào)控序列，可能通過穩(wěn)定蛋白的三級結(jié)構(gòu)，從而使C端核定位信號發(fā)揮作用。

2 Rrp44的分子功能

RNA的不斷合成和降解是細(xì)胞功能正常的代謝變化，該過程與外切酶復(fù)合體相關(guān)。Rrp44在mRNA質(zhì)量控制、基因表達(dá)調(diào)控和小RNA加工中發(fā)揮作用。

2.1 Rrp44在mRNA降解中的作用

真核生物的mRNA降解涉及許多復(fù)雜而相互關(guān)聯(lián)的途徑，它們都匯聚在三種共同的機(jī)制上。mRNA降解首先必須消除二級結(jié)構(gòu)，變成單鏈的RNA，再通過脫腺苷化作用刪除polyA尾巴，從而被Rrp44從3’端開始降解；脫去5’端的帽子結(jié)構(gòu)，被核糖核酸外切酶從5’端開始降解。最后，轉(zhuǎn)錄本可以通過核內(nèi)裂解產(chǎn)生兩個(gè)片段，這兩個(gè)片段容易被Rrp44或RNA酶XRN1降解。在mRNA降解途徑的上游，還存在著許多其他途徑，以便靶向底物至特定的途徑，從而進(jìn)行降解[3]。這些上游途徑可分為質(zhì)量控制和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控兩條路徑。

（1）Rrp44在RNA質(zhì)量控制通路中的作用。細(xì)胞必須檢測異常和錯(cuò)誤的轉(zhuǎn)錄本，以防止產(chǎn)生潛在的有毒蛋白質(zhì)。監(jiān)視機(jī)制存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，以檢測mRNA產(chǎn)生和成熟的所有階段的錯(cuò)誤。在細(xì)胞核中，由于轉(zhuǎn)錄、加工或輸出錯(cuò)誤會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的mRNA，這些錯(cuò)誤的mRNA都會(huì)被降解。3’—5’和5’—3’途徑都參與核mRNA降解，但具體使用哪一種途徑取決于底物特異性。目前研究結(jié)果表明，外切酶復(fù)合體可特異性降解未剪接的mRNA前體[3]和轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤的mRNA。

細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生的mRNA監(jiān)視途徑則依賴于翻譯，包括無義介導(dǎo)的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay,NMD）、無終止降解（non-stop decay,NSD）和停滯降解（no-go decay,NGD）。NMD降解是由包含一個(gè)提前終止密碼子（PTC）的轉(zhuǎn)錄本觸發(fā)的，隨后，相關(guān)蛋白結(jié)合到被降解的轉(zhuǎn)錄本，導(dǎo)致mRNA通過5’—3’或3’—5’途徑降解[10]。NSD降解以缺乏終止密碼子的mRNA為目標(biāo)，這類mRNA翻譯時(shí)，核糖體會(huì)沿著polyA尾巴繼續(xù)翻譯。在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，mRNA3’端的核糖體被GDP結(jié)合蛋白Ski7檢測到，接下來Ski7會(huì)招募Ski復(fù)合體和外切酶復(fù)合體并降解轉(zhuǎn)錄本[11]。NGD降解則阻止了具有強(qiáng)二級結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄本的翻譯。當(dāng)核糖體被mRNA的強(qiáng)二級結(jié)構(gòu)中止后，mRNA在核內(nèi)被裂解。這一過程中相關(guān)的內(nèi)切酶尚未確定，目前認(rèn)為真核翻譯釋放因子eRF1和eRF3相關(guān)蛋白Dom34和HSB1[4]參與其中。一旦轉(zhuǎn)錄本被分裂成兩個(gè)片段，它會(huì)被外切酶復(fù)合體或RNA酶XRN1降解。

（2）Rrp44在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中的作用。mRNA降解是一種基因表達(dá)調(diào)控的方式。這種調(diào)控方式可以通過3’非翻譯區(qū)中不穩(wěn)定的順式元件RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）誘導(dǎo)發(fā)生。目前發(fā)現(xiàn)兩種不穩(wěn)定的順式元件：富含AU的順式作用元件（AU-rich elements,ARE）和富含GU的順式作用元件（GUrich elements,GRE），它們大多存在于mRNA的3’非編碼區(qū)中。ARE存在于介導(dǎo)細(xì)胞調(diào)節(jié)反應(yīng)的短壽命mRNA中，如編碼炎癥因子的mRNA。ARE通過招募轉(zhuǎn)錄因子來影響轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)。這些ARE結(jié)合蛋白與CCR4-NOT復(fù)合物結(jié)合，隨后被Rrp44和外切酶體復(fù)合物降解[4]。GRE與ARE調(diào)節(jié)不同的基因庫，并對mRNA的穩(wěn)定性有更溫和的影響[12]。

2.2 Rrp44在小RNA成熟和降解中的作用

隨著對RNA降解的深入了解，已經(jīng)有研究證實(shí)，并非所有RNA降解的目的都是將RNA底物完全降解。Rrp44和外切酶體復(fù)合物能夠參與小RNA的加工。核糖體RNA（ribosomal RNA,rRNA）、小核仁RNA（small nucleolar RNA,snoRNA）、小核RNA（small nuclear RNA,snRNA）和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA,tRNA）均被轉(zhuǎn)錄為前體RNA，這些前體RNA必須經(jīng)過剪切、修飾才能產(chǎn)生有功能的小RNA[13]。在這一過程中，外切酶復(fù)合體通過將前體RNA3’端降解，使其成為成熟的、穩(wěn)定的RNA。

例如，酵母中的rRNA合成始于核仁中35S前體rRNA的合成。前體rRNA在細(xì)胞核內(nèi)部經(jīng)過一系列步驟被降解，產(chǎn)生一些更小的片段，包括7S中間體。外切酶體復(fù)合物對7S中間體進(jìn)行加工，使其成為成熟的5.8SrRNA[14]。此外，Rrp44在酵母中特異性降解轉(zhuǎn)移核糖核酸（tRNA）。在酵母中，甲硫氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNAiMet）58位的丙氨酸甲基化，對于其正確二級結(jié)構(gòu)的形成至關(guān)重要，Rrp44能夠特異性識(shí)別該位點(diǎn)，并在TRAMP（ir2/Mtr4 polyadenylation,TRAMP）復(fù)合物的幫助下對A58沒有甲基化的tRNAiMet進(jìn)行降解[15]。

miRNA介導(dǎo)的mRNA降解是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要手段。miRNA能夠結(jié)合到目的RNA片段上面，最終導(dǎo)致目的RNA被降解。因此，miRNA的產(chǎn)生受到多個(gè)水平的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體和Rrp44特異性地參與了某些miRNA的成熟過程，包括果蠅羽翼成熟需要的miR-252-5p，miR-982-5p。同樣在果蠅中，一個(gè)miRNA家族被發(fā)現(xiàn)編碼在內(nèi)含子中，它們在外切酶復(fù)合體中被加工而不是通過正常的RNA酶Drosha裂解。此外，Rrp44還參與了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中前體miRNA的降解和前體miRNAs的質(zhì)量控制[16]。

3 Rrp44的生物學(xué)功能

在Rrp44突變體中可以觀察到其生物學(xué)功能，此類研究大多在酵母和果蠅中進(jìn)行的。由于Rrp44在真核生物中明顯保守，這意味著對低等生物的研究可能會(huì)對了解其在高等生物中的功能有所幫助。

3.1 Rrp44在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用

Rrp44在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中起作用。Rrp44最初是在一個(gè)突變的裂殖酵母株中被發(fā)現(xiàn)，Rrp44突變后導(dǎo)致姐妹染色單體不分離[1]。隨后發(fā)現(xiàn)，在單個(gè)Rrp44突變體中，有絲分裂節(jié)點(diǎn)控制蛋白Mad2抑制有絲分裂進(jìn)程，但在Rrp44和Mad2雙突變體中，由于染色體分離錯(cuò)誤，導(dǎo)致產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞[17]。進(jìn)一步證明Rrp44的突變影響了微管定位和結(jié)構(gòu)，從而影響了有絲分裂的進(jìn)程。同時(shí)，在果蠅S2細(xì)胞中，敲除Rrp44也會(huì)影響細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)[18]。目前認(rèn)為，Rrp44主要參與著絲粒異染色質(zhì)沉默，也因此影響細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程。

3.2 Rrp44在產(chǎn)生抗體多樣性中的作用

在抗體重組的過程中，外切酶復(fù)合體能夠招募脫氨酶。脫氨酶的功能是將甲基化的胞苷殘基和5-羥甲基化的胞苷殘基分別轉(zhuǎn)化為尿嘧啶和胸腺嘧啶，然后被DNA修復(fù)機(jī)制識(shí)別并轉(zhuǎn)化為定點(diǎn)斷裂（DSBs），這是免疫球蛋白多樣化過程的一部分[19]。由于脫氨酶只能作用于單鏈DNA（ssD NA），因此這些過程只發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄過程中。在這種修復(fù)過程中產(chǎn)生的RNA會(huì)被外切酶復(fù)合體降解。