251 份歐洲冬小麥成株期抗條銹病鑒定及抗條銹病基因檢測

翟雪婷，趙池銘，汪軍成，姚立蓉，司二靜，王化俊，孟亞雄，岳維云，尚勛武，李葆春

（1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；3.定西市臨洮農(nóng)業(yè)學(xué)校，甘肅定西 730500；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；5.天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，甘肅天水 741000）

由條型柄銹菌（Puccinia striiformis f.sp.tritici）引起的小麥條銹病是世界范圍內(nèi)最重要的小麥病害之一。它可通過高空氣流長距離傳播，具有發(fā)生面積大、發(fā)病時難以控制等特點(diǎn)[1]，在高濕和陰冷環(huán)境條件下極易暴發(fā)。小麥感染條銹病菌后，其植物發(fā)育和籽粒灌漿都會受到嚴(yán)重影響，導(dǎo)致產(chǎn)量下降和品質(zhì)受損，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。病害流行年份可致小麥減產(chǎn)高達(dá)70%，嚴(yán)重時甚至絕收。一般情況下，小麥品種在生產(chǎn)上使用3～5 a 便“喪失”其抗條銹病性，其中，條銹菌的不斷變異和抗源品種的單一化種植是引起我國小麥品種抗條銹病性喪失的主要原因[2-3]。目前，小麥抗病育種面臨的主要問題是抗源匱乏、抗性遺傳基礎(chǔ)狹窄[4-5]。要解決上述問題，只有尋找新的抗源和抗性基因，拓寬抗性基礎(chǔ)，增加其遺傳多樣性。所以，引進(jìn)和合理利用國外品種不失為解決抗性資源不斷狹窄的一種有效方法。

杜久元等[6]對2 900 份國外小麥種質(zhì)資源進(jìn)行了抗條繡病性鑒定，篩選出條銹病免疫材料18 份，高抗條銹病且優(yōu)質(zhì)的材料9 份，CMT.Du 2、CMT.Du 4、CMT.Du 5、CMT.Du 6、CMT.Du 7、CMT.Du 8、CMT.Du 9等7 個持久抗條銹材料的抗性表現(xiàn)穩(wěn)定；韓德俊等[7]利用已知抗條銹基因的分子標(biāo)記對1 980 份小麥地方品種和國外種質(zhì)進(jìn)行了抗條銹性鑒定與評價，建立了小麥條銹病抗源鑒定和評價體系，篩選出50 余份具有不同抗病性特征的抗源材料；白玉路等[8]利用與Yr10、Yr15、Yr18 和Yr39 緊密連鎖的分子標(biāo)記對美國西北部59 個小麥品種（系）進(jìn)行了分子檢測，結(jié)果表明，Yr18、Yr39 在美國西北部小麥品種（系）中的分布較普遍，并且大部分可抵抗我國當(dāng)前流行的條銹菌生理小種。以上研究在小麥抗源的篩選、鑒定等相關(guān)工作中起著重要的參考意義。

董玉琛等[9]對歐洲18 個國家的358 個冬、春小麥品種的農(nóng)藝性狀進(jìn)行了鑒定與評價，簡述了各國品種的特點(diǎn)，全部品種的生育期、株高、主穗粒數(shù)和千粒質(zhì)量等性狀變異豐富，向育種家推薦了一批優(yōu)良種質(zhì)，并提供了部分品種的系譜；王蘭芬等[10]對該批材料與東亞小麥品種進(jìn)行了遺傳多樣性的比較分析，共檢測到865 個等位變異，歐洲和東亞品種分別檢測到730、716 個等位變異，特有等位變異分別為150、135 個。近1/2 基因座的等位變異頻率及其分布在歐洲與東亞材料間存在明顯差異。但目前尚未見該批歐洲小麥材料在我國抗條銹病基因鑒定中的相關(guān)研究報道。

本研究對251 份歐洲冬小麥材料進(jìn)行了田間成株期抗條銹病鑒定，并利用分子標(biāo)記檢測了已知抗病基因（Yr10、Yr15、Yr18 和Yr26）在供試材料中的存在與否，旨在明確供試材料的抗性水平和抗病基因類型，綜合評價該批種質(zhì)材料的利用價值，旨在為進(jìn)一步培育抗條銹病新品種及抗病新基因的鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

251 份供試歐州冬小麥材料及感病對照品種銘賢169 由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。已知基因載體品系A(chǔ)vocet S*6/Yr10、Avocet S*6/Yr15、Avocet S*6/Yr18、Avocet S*6/Yr26 由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所、西北農(nóng)林科技大學(xué)植保學(xué)院提供。251 份冬小麥材料來源及育成年份參見文獻(xiàn)[9-10]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間成株期抗條銹病鑒定 在甘肅省天水市中梁實(shí)驗(yàn)站田間進(jìn)行2 a 條銹病自然誘發(fā)試驗(yàn)。將供試251 份小麥材料進(jìn)行條播，每份材料種植2 行，每隔20 行種植2 行銘賢169，作為感病對照材料。成株期當(dāng)感病品種充分發(fā)病后，對田間材料進(jìn)行病情調(diào)查。按照國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 1443.1—2007）進(jìn)行小麥抗條銹病鑒定，其反應(yīng)型分為6 級標(biāo)準(zhǔn)，即0 級（免疫）、0；級（近免疫）、1 級（高抗）、2 級（中抗）、3 級（中感）、4 級（高感）；嚴(yán)重度按9 級標(biāo)準(zhǔn)劃分，即0、1%、5%、10%、20%、40%、60%、80%、100%。共調(diào)查2 次，并以2 次調(diào)查結(jié)果高的為準(zhǔn)。

1.2.2 251 份小麥材料DNA 的提取及分子檢測采用改良CTAB 法[11]對251 份供試小麥以及4 個基因載體品系幼葉進(jìn)行DNA 提取，選用已開發(fā)的Yr10、Yr15、Yr18 和Yr26 共4 個抗條銹基因的連鎖標(biāo)記（表1）分別對供試材料進(jìn)行分子檢測，所用引物由擎科生物技術(shù)有限公司合成，PCR 反應(yīng)體系為25 μL，包含2×PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，50～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35～40 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。產(chǎn)物進(jìn)行2%和3%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶特征并統(tǒng)計供試品種抗病基因的特征帶出現(xiàn)情況。

表1 小麥抗條銹病基因的分子標(biāo)記

2 結(jié)果與分析

2.1 田間成株期抗病鑒定

供試251 份小麥材料成株期抗條銹病鑒定結(jié)果如表2 所示，141 份材料表現(xiàn)為成株期抗條銹病，占供試材料的56.18%。其中，表現(xiàn)為免疫、近免疫、高抗和中抗的材料分別有45、0、72、24 份，分別占供試材料的17.93%、0、28.69%和9.56%；表現(xiàn)中感和高感的材料有110 份，占供試材料的43.82%（圖1）。

表2 小麥成株期抗條銹病鑒定及分子檢測結(jié)果

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

2.2 抗條銹病基因檢測

2.2.1 Yr10 分子檢測 利用SINGH 等[12]開發(fā)的SCAR 標(biāo)記Yr10F/R 來檢測Yr10（圖2），陽性條帶為543 bp，小麥材料中擴(kuò)增出146 條與對照品種相同的條帶，推測有146 份材料可能含Yr10，占總數(shù)的58.17%。這些檢測到可能含有Yr10 的材料在歐洲18 個國家均有分布（表2）。

2.2.2 Yr15 分子檢測 利用KLYMIUK 等[13]開發(fā)的特異性引物Yr15K1 來檢測Yr15（圖3），陽性條帶為992 bp，小麥材料中擴(kuò)增出28 條與對照品種相同的條帶，推測有28 份材料可能含有Yr15，占總數(shù)的11.16%，分別為奧地利、比利時等14 個國家的材料。南斯拉夫、法國、芬蘭、西班牙4 個國家的材料沒有檢測到。

2.2.3 Yr18 分子檢測 利用STS 標(biāo)記csLV34[14]檢測Yr18，陽性條帶為150 bp（圖4），小麥材料中擴(kuò)增出27 條與對照品種相同的條帶，推測有27 份材料可能含有Yr18，占總數(shù)的10.76%，分別為比利時、保加利亞等9 個國家的材料，奧地利、西班牙等9 個國家的材料未檢測到。

2.2.4 Yr26 分子檢測 利用WANG 等[15]根據(jù)ESTSSR 開發(fā)的大小為451 bp 的STS 標(biāo)記WE173 檢測Yr26，未檢測到供試品種（系）含有這個基因的特征性條帶。

2.3 Yr 基因組合分子檢測

在本試驗(yàn)所篩查的小麥材料中（表2），F(xiàn)43、F53 等33 份材料同時檢測到2 種抗條銹病基因，包含3種組合方式（Yr10 ＋Yr15、Yr10 ＋Yr18、Yr15＋Yr18），其中，F(xiàn)43 等16 份材料檢測到Y(jié)r10 與Yr15；F48 等14 份材料檢測到Y(jié)r10 與Yr18；F244檢測到Y(jié)r15 與Yr18；3 份材料同時檢測到3 種抗條銹病基因，包含Yr10＋Yr15＋Yr18，分別為F235、F334 和F348 等3 個品種?？赡軘y帶Yr10、Y15、Yr18的材料分別有146、28、27 份，分別占供試小麥的58.17%、11.16%、10.76%。在供試小麥材料中未檢測到與Yr26 基因相同條帶，推測可能不含Yr26 基因。F4、F5 等89 份材料未檢測到攜帶已知抗條銹病基因，其中，41 份田間鑒定表現(xiàn)為抗條銹病，推測可能含有其他已知或者未知抗病基因。

3 討論

長期大面積種植含有單一抗條銹病基因的小麥品種，為新的條銹病流行小種大肆傳播創(chuàng)造了條件，導(dǎo)致許多抗病基因抗性降低甚至“喪失”[16]。因此，為解決小麥品種抗病性減弱、抗源單一的問題，對國內(nèi)外種質(zhì)進(jìn)行抗條銹病性鑒定，可為我國抗條銹病小麥育種挖掘出新的抗病基因，豐富抗源材料[8，17]。本研究通過對251 份歐洲小麥材料進(jìn)行2 a田間成株期抗條銹病鑒定，篩選出141 份成株期抗病材料，其中免疫45 份、高抗72 份、中抗24 份；所有的法國材料田間均表現(xiàn)為抗條銹病。董玉琛等[9]對這批歐洲小麥品種的農(nóng)藝性狀鑒定與評價中，向育種家推薦了一批優(yōu)良種質(zhì)，其中就包括本研究中的4 份法國材料，這4 份田間農(nóng)藝性狀優(yōu)良且抗條銹病的材料可以作為重點(diǎn)材料加以改造利用。

Yr10 和Yr15 均為小種專化型全生育期抗性基因且抗病水平很高[18]。莊巧生[18]研究認(rèn)為，在中國小麥育種史上沒有使用Yr10 和Yr15 的證據(jù)；尉法剛等[19]在對400 份我國育成的小麥品種（系）條銹病成株期抗性鑒定與評價中檢測到可能攜帶Yr10，有10 份材料，占比很低，僅為4.75%。而在本研究對251 份歐洲小麥材料的檢測中，檢測到Y(jié)r10 的品種為146 份，出現(xiàn)的頻率高達(dá)58.17%，其中，抗病材料為88 份，占比為60.27%，感病材料為58 份，占比39.73%。分析在可能檢測到Y(jié)r10 的材料中仍有部分材料表現(xiàn)感病的原因可能是某種表達(dá)抑制現(xiàn)象或基因重組導(dǎo)致基因未表達(dá)，或者是成株期鑒定有誤以及分子檢測假陽性現(xiàn)象的發(fā)生，建議今后可充分利用這些表現(xiàn)抗病且檢測到抗病基因的國外材料用于國內(nèi)的抗病育種中。尉法剛等[19]對400 份小麥品種（系）條銹病成株期抗性鑒定與評價中檢測到可能攜帶Yr15 的材料有19 份，僅占4.75%；白玉路等[8]在美國西北部59 個小麥品種（系）中僅檢測到12 個小麥材料可能攜帶Yr15，占21.43%；徐默然等[20]在103 份小麥品種（系）抗條銹性和遺傳多樣性評價及基因檢測中未檢測到Y(jié)r15。而在本研究中，對供試小麥檢測可能含有Yr15 基因的材料也僅有28 份，占比為11.16%，與前人對中國材料和美國西北部材料的研究結(jié)果一致，Yr15 基因的應(yīng)用比例表現(xiàn)很低，但28 份材料中有19 份材料田間表現(xiàn)抗病，占比67.86%，大部分表現(xiàn)抗病，今后可將這些材料酌情應(yīng)用于抗病育種中。

Yr18/Lr34/Pm38 是一個慢銹抗性基因位點(diǎn)，對小麥葉銹、白粉也具有部分抗性[21]。本研究中檢測到可能含有Yr18 的小麥27 份，占比10.76%，占比較小，與楊文雄等[22]對我國小麥育成品中慢銹基因Lr34/Yr18 的分子檢測中得出“231 份育成品種（系）中攜帶Lr34/Yr18 基因的材料僅占6.1%”的研究結(jié)果基本一致。曾慶東等[23]在持久抗病基因Yr18 在我國小麥抗條銹育種中的應(yīng)用中得出，495 份小麥材料中Yr18 基因僅占2.02%，研究結(jié)果也基本一致；但與白玉路等[8]在對美國西北部59 個小麥的研究中的結(jié)果產(chǎn)生差異，其原因可能是材料來源地不同。說明此基因不僅在我國小麥中比例較少，在歐洲小麥材料中比例也較少，應(yīng)當(dāng)在我國的小麥抗病育種中加以重視和利用。

4 結(jié)論

經(jīng)田間成株期鑒定，251 份小麥材料中，表現(xiàn)抗病的材料有141 份，其中，表現(xiàn)為免疫、高抗和中抗的材料分別有45、72、24 份，分別占供試材料的17.93%、28.69%和9.56%；表現(xiàn)中感和高感的材料有110 份，占43.82%。分子檢測結(jié)果表明，攜帶Yr10、Yr15、Yr18 基因的品種分別有146、28、27 份，分別占供試小麥的58.17%、11.16%、10.76%，Yr26 分子標(biāo)記在試驗(yàn)材料中未檢測到。33 份材料同時攜帶2 種抗銹基因，包含3 種組合方式（Yr10＋Yr15、Yr10＋Yr18、Yr15＋Yr18），3 份材料同時攜帶3 種抗銹基因，組合方式為Yr10＋Yr15＋Yr18，89 份材料未檢測到攜帶上述已知抗銹基因，其中41 份田間鑒定表現(xiàn)為抗條銹病，推測可能含有其他已知或者未知抗病基因。本研究為篩選優(yōu)良的抗條銹病材料提供了參考依據(jù)。