基于形態(tài)指標和轉錄組的小麥抗旱與耐鹽相關性分析

盛雨婷，生林山，陸峻一，趙愛菊，李夕梅

（1.青島農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山東省旱作技術重點實驗室，山東省耐鹽作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用工程技術研究中心，山東青島 266109；2.東營青農(nóng)大鹽堿地高效農(nóng)業(yè)技術產(chǎn)業(yè)研究院，山東東營 257000；3.河北省農(nóng)林科學院糧油作物研究所，河北石家莊 050035）

小麥（Triticum aestivum L.）是我國第二大口糧作物，在保障國家糧食安全方面發(fā)揮著重要作用[1]。隨著水資源日益短缺和土壤鹽漬化日趨嚴重，小麥生產(chǎn)面臨嚴重威脅[2]。干旱會導致小麥光合能力下降、代謝不均衡，最終抑制小麥生長[3]。鹽脅迫會引起小麥細胞離子毒害、光合性能下降、生長發(fā)育停滯，嚴重影響小麥產(chǎn)量[4]。因此，抗旱耐鹽小麥新品種的培育對保障小麥生產(chǎn)具有重要意義。

眾所周知，抗旱耐鹽指標的鑒選對抗旱耐鹽品種的選育具有重要指導意義。胚芽鞘長度、莖稈內(nèi)可溶性碳水化合物、葉片相對含水量、拔節(jié)期葉面積指數(shù)、根系干質(zhì)量等形態(tài)指標均與小麥抗旱性關系密切[5-9]；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等酶活性、丙二醛（MDA）含量、葉綠素含量及熒光參數(shù)、蛋白質(zhì)和核酸含量、滲透調(diào)節(jié)能力等生理生化指標也與小麥抗旱性有著較為密切的關系[10-14]。發(fā)芽率、發(fā)芽勢、幼苗存活率、胚芽鞘長、根長、苗高、第一片葉的生長速度、苗鮮質(zhì)量、春季分蘗數(shù)等形態(tài)指標可以作為小麥耐鹽性鑒定的有效指標[15-17]；K+/Na+比、K+通量、液泡膜和液泡Na+/H+變化、質(zhì)膜和液泡膜H+-ATPase 活性、細胞膜透性、葉綠素含量、氣孔導度、SOD 酶活性、多胺含量、游離脯氨酸含量、羥脯氨酸含量、糖蛋白中糖分含量、甜菜堿含量等生理生化指標也可以作為鑒定小麥耐鹽性的重要指標[18-24]。由于小麥抗旱性和耐鹽性均是多基因控制的復雜數(shù)量性狀，在衡量小麥抗旱耐鹽性時需要將多種指標結合起來進行綜合評定，比如隸屬函數(shù)法[25]。

小麥旱鹽脅迫下形態(tài)及生理生化性狀的變化都受基因的轉錄調(diào)控，目前，高通量轉錄組測序技術已廣泛應用于植物抗逆相關研究中。LIU 等[26]利用高通量轉錄組測序發(fā)現(xiàn)，14 560 個基因在小麥干旱脅迫前后發(fā)生差異表達；ZHANG 等[27]以小麥幼苗根系為研究材料，在全基因組水平上鑒定到36 804 個鹽脅迫前后差異表達的基因。

有研究指出，干旱時土壤水分蒸發(fā)會導致地表鹽分不斷積累，使得地表土壤水分減少、鹽分濃度增加，因此，干旱和鹽害往往同時發(fā)生[28]。翁亞偉等[29]研究發(fā)現(xiàn)，旱鹽復合脅迫下，小麥幼苗的生物量、葉面積、葉綠素熒光和凈光合速率等均顯著下降；華智銳等[30]研究發(fā)現(xiàn)，小麥胚芽鞘長度、發(fā)芽勢和發(fā)芽率均隨旱鹽交叉脅迫的加劇而呈下降趨勢，而SOD、POD 和CAT 活性先上升后下降。目前，旱鹽復合脅迫對小麥影響的研究已有報道，但小麥抗旱性與耐鹽性相關性的研究尚未見報道。因此，本試驗以173 個小麥品種（系）為材料，采用20%PEG溶液（模擬干旱）和150 mmol/L NaCl 溶液（模擬鹽害）分別處理種子，并于芽苗期測定其相對胚芽鞘長、相對根長、相對苗高、相對發(fā)芽率和相對鮮質(zhì)量，利用綜合隸屬函數(shù)法計算各品種（系）的抗旱耐鹽能力，然后結合高通量轉錄組數(shù)據(jù)分析抗旱性與耐鹽性的相關性，以期豐富小麥抗旱耐鹽性相關研究，為小麥抗旱、耐鹽性品種選育提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

青麥6 號、德抗961、濟南17、濟麥229、魯麥21、煙農(nóng)24 等173 份小麥品種（系）[31]用于小麥抗旱耐鹽形態(tài)鑒定指標數(shù)據(jù)的測定，抗旱耐鹽小麥品種青麥6 號（國審麥2016027）用于旱、鹽脅迫的轉錄組分析。

1.2 基于形態(tài)指標的小麥抗旱耐鹽相關性分析

小麥材料的萌發(fā)與處理、抗旱耐鹽形態(tài)指標的測定均采用文獻[31]的試驗方法；然后采用文獻[32]的方法計算小麥受脅迫下的相對抗旱或耐鹽系數(shù)；隨后利用Microsoft Excel 2007 對所得相對抗旱（耐鹽）系數(shù)進行統(tǒng)計分析；再采用隸屬函數(shù)值進行品種（系）各發(fā)芽指標的抗旱和耐鹽性綜合評定，參考文獻[31]進行；最后利用SPSS 22.0 軟件計算抗旱性與耐鹽性之間的相關系數(shù)，參考文獻[31]。

1.3 小麥旱、鹽脅迫的轉錄組測序及生物信息學分析

青麥6 號小麥幼苗的培養(yǎng)參考ZHANG 等[27]的方法進行，隨后分別采用20%PEG 溶液和0.3%NaCl 溶液對其進行模擬干旱和鹽脅迫處理，脅迫發(fā)生48 h 后葉片取樣并迅速置于液氮中，取出后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ哉ＩL條件的幼苗葉片作對照，每處理3 次生物學重復。RNA 的提取、建庫、轉錄組測序、基因組比對、表達水平分析、GO功能富集分析等均參考ZHANG 等[27]的方法進行。

2 結果與分析

2.1 不同品種（系）小麥抗旱形態(tài)指標的統(tǒng)計分析及抗旱性綜合評價

從圖1 可以看出，旱脅迫下不同小麥品種（系）相對胚芽鞘長、相對根長、相對苗高的隸屬函數(shù)值主要集中在0～0.49，分別占總數(shù)的73.99%、75.72%、99.42%；相對發(fā)芽率、相對鮮質(zhì)量的隸屬函數(shù)值主要集中在0.30～1.00，分別占總數(shù)的91.91%、93.64%。116 個小麥品種（系）（占總數(shù)的67.05%）的抗旱性綜合隸屬函數(shù)值在0.30～0.49；分別有27（15.61%）、23 個（13.29%）小麥品種（系）的抗旱性綜合隸屬函數(shù)值在0.20～0.29 和0.50～0.59，二者相差不多；分別只有2（1.16%）、5 個（2.89%）小麥品種（系）的抗旱性綜合隸屬函數(shù)值在0～0.19 和0.60～0.79。

2.2 不同品種（系）小麥耐鹽形態(tài)指標的統(tǒng)計分析及耐鹽性綜合評價

由圖2 可知，鹽脅迫下不同小麥品種（系）相對胚芽鞘長、相對發(fā)芽率、相對鮮質(zhì)量的隸屬函數(shù)值主要集中在0.30～1.00，分別占總數(shù)的81.50%、89.02%、92.49%；相對根長、相對苗高的隸屬函數(shù)值主要集中在0～0.49，分別占總數(shù)的80.92%、89.60%。98 個（占總數(shù)的56.65%）小麥品種（系）的耐鹽性綜合隸屬函數(shù)值在0.30～0.49；57 個（32.95%）小麥品種（系）的耐鹽性綜合隸屬函數(shù)值在0.50～0.59；分別只有8（4.62%）、10 個（5.78%）小麥品種（系）的耐鹽性綜合隸屬函數(shù)值在0.20～0.29 和0.60～0.79。

2.3 小麥抗旱性、耐鹽性各指標間的相關性分析

由表1 可知，干旱脅迫下相對胚芽鞘長、相對根長、相對苗高、相對發(fā)芽率、相對鮮質(zhì)量隸屬函數(shù)值兩兩間相關系數(shù)絕對值在0.04～0.36；各指標隸屬函數(shù)值與抗旱綜合隸屬函數(shù)值間的相關系數(shù)在0.49～0.70，且均達極顯著水平。鹽脅迫下相對胚芽鞘長、相對根長、相對苗高、相對發(fā)芽率、相對鮮質(zhì)量隸屬函數(shù)值兩兩間相關系數(shù)絕對值在0.06～0.21；各指標隸屬函數(shù)值與耐鹽綜合隸屬函數(shù)值間的相關系數(shù)在0.46～0.56，且均達極顯著水平。相對鮮質(zhì)量、相對胚芽鞘長、相對苗高在旱鹽2 種脅迫下隸屬函數(shù)值相關系數(shù)分別達到0.50、0.52、0.63，且均為極顯著水平；抗旱、耐鹽綜合隸屬函數(shù)值間的相關系數(shù)為0.43，且達極顯著水平。

表1 小麥抗旱性、耐鹽性各指標間的相關性分析

2.4 小麥干旱、鹽脅迫響應差異表達基因及功能注釋的比較分析

從圖3 可以看出，與非脅迫處理相比，脅迫處理下共鑒定到3 311 個上調(diào)和4 712 個下調(diào)表達基因（變化倍數(shù)≥2，F(xiàn)DR 值＜0.01）。其中，干旱脅迫特異上調(diào)基因數(shù)為1 717 個，鹽脅迫特異上調(diào)基因數(shù)為650 個，旱鹽共上調(diào)基因數(shù)為944 個；干旱脅迫特異下調(diào)基因數(shù)為2 901 個，鹽脅迫特異下調(diào)基因數(shù)為209 個，旱鹽共下調(diào)基因數(shù)為1 602 個。隨后，對差異表達基因進行GO 功能富集分析，顯著富集的前20 個亞類結果顯示，旱鹽上調(diào)基因富集亞類相同的有18 個（圖4-A、B），旱鹽下調(diào)基因富集亞類相同的有19 個（圖4-C、D），均包括分子功能（molecular_function）、生物學過程（biological_process）、代謝過程（metabolic process）、催化活性（catalytic activity）等功能亞類。

3 結論與討論

3.1 采用隸屬函數(shù)法綜合評價小麥的抗旱性和耐鹽性

隸屬函數(shù)法屬于模糊評價函數(shù)的概念[25]，可基于多個指標對小麥抗旱、耐鹽性進行全面而客觀的評價[31，33-34]。本研究將每個小麥品種（系）各指標抗旱或耐鹽指標的隸屬函數(shù)值相加并取平均值，避免了使用單一指標進行評價的不準確性，評價結果更加科學、可靠。

3.2 基于形態(tài)指標的抗性鑒定結果小麥抗旱性和耐鹽性的相關性

張會麗[35]應用主成分分析和隸屬函數(shù)法對36 個玉米品種（系）的生理和農(nóng)藝性狀指標進行綜合評價發(fā)現(xiàn)，部分耐鹽堿性強的品種（系）其抗旱性也較強，但部分抗旱性強的品種（系）則對鹽堿脅迫較為敏感，總體而言，抗旱性和耐鹽堿性存在一定的相關性。本研究基于173 個小麥品種（系）形態(tài)指標的抗旱、耐鹽性數(shù)據(jù)，采用隸屬函數(shù)法綜合評價小麥的抗旱耐鹽性后進行相關性分析。鑒于統(tǒng)計學上認為，相關系數(shù)r 的取值范圍是-1≤r≤1。當0＜r≤1時，成正相關關系；當r=0 時，不相關；當-1≤r＜0時，成負相關關系。r 的絕對值越大，相關程度越高。一般認為，0.8≤|r|＜1，存在極強相關性；0.6≤|r|＜0.8，強相關；0.4≤|r|＜0.6，中度相關；0.2≤|r|＜0.4，弱相關；0＜|r|≤0.2，極弱相關性，或認為不相關。本研究結果認為，旱/鹽脅迫下各形態(tài)指標間均為弱/極弱相關性，但是其與綜合抗旱/耐鹽性間的相關性達到中度及以上（相關系數(shù)為0.46～0.70）；相對胚芽鞘長、相對鮮質(zhì)量兩指標在旱鹽2 種脅迫間為中度正相關性（相關系數(shù)分別為0.52 和0.50），相對苗高在旱鹽2 種脅迫間為強正相關性（相關系數(shù)達0.63）。鑒于綜合隸屬函數(shù)最能客觀評價品種（系）的抗旱耐鹽性，本研究發(fā)現(xiàn)，抗旱、耐鹽綜合隸屬函數(shù)值間的相關系數(shù)為0.43，因此，本研究認為小麥的抗旱耐鹽性間為中度正相關關系。因此，可以對篩選出的抗旱性（耐鹽性）突出的小麥品種（系）進行耐鹽性（抗旱性）鑒定，有望篩選到同時適用于旱地、鹽堿地的既抗旱又耐鹽的小麥品種（系）。

3.3 基于轉錄測序結果小麥抗旱性和耐鹽性的相關性

干旱、鹽脅迫48 h 小麥葉片高通量轉錄組測序結果顯示，干旱、鹽脅迫共上調(diào)基因數(shù)（944 個）分別占旱（2 661 個）、鹽（1 594 個）脅迫上調(diào)基因總數(shù)的35.48%和59.22%，干旱、鹽脅迫共下調(diào)基因數(shù)（1 602 個）分別占干旱（4 503 個）、鹽（1 811 個）脅迫下調(diào)基因總數(shù)的35.58%和88.46%。說明小麥中很多基因是旱、鹽脅迫雙重響應的，在小麥抗旱、耐鹽性中均發(fā)揮作用。如Tamyb59 在PEG 和鹽處理下均呈現(xiàn)先上升后下降的表達趨勢，該基因的過表達能夠同時提高轉基因小麥的抗旱性和耐鹽性[36]；TaHsfA6f 受高溫、脫水、鹽分、低溫和多種激素的誘導表達，且擬南芥超表達株系較野生型株系表現(xiàn)出更強的抗旱性與耐鹽性[37]。上述這些說明小麥抗旱、耐鹽性的內(nèi)在遺傳機制有一定共性。差異表達基因的GO 功能富集結果顯示，干旱、鹽脅迫上調(diào)基因顯著富集前20 個亞類相同的有18 個，干旱、鹽脅迫下調(diào)基因顯著富集前20 個亞類相同的有19 個。進一步說明小麥在應對干旱、鹽脅迫逆境中，很大程度上采用了相似的調(diào)控機制。藏金萍[38]利用IR64/Binam 和特青/Binam 2 個導入系群體對水稻抗旱性、耐鹽性進行分析，分別鑒定到5、3 個抗旱性QTL 與耐鹽性QTL 相互重疊的基因組區(qū)域。鑒于不同作物間生長發(fā)育及應對脅迫的相似性，結合本研究結果，初步認為小麥抗旱性、耐鹽性之間確實存在一定相關性，對抗旱、耐鹽共響應基因進行有效的遺傳操縱，或者對抗旱性、耐鹽性QTL 重疊區(qū)進行有效的選擇，有可能培育出既抗旱又耐鹽的小麥新品種。

3.4 展望

鑒于芽苗期是小麥旱、鹽脅迫最為敏感的時期，以及工作量等現(xiàn)實問題，本研究主要基于173 個小麥品種（系）芽苗期形態(tài)指標數(shù)據(jù)進行了小麥抗旱性、耐鹽性間的相關性分析，為了使研究結果更加科學合理可信，應該結合生理生化指標、成株期鑒定指標及產(chǎn)量數(shù)據(jù)進行綜合分析，但是本研究結果對小麥抗旱耐鹽性研究仍有一定的指導意義。