小麥抗殼針孢葉枯病基因發(fā)掘及育種應用進展

盧家玲，樊宇恒，馬夢思，田雪軍

（1.鄭州大學農(nóng)學院，河南鄭州 450001；2.荊楚理工學院生物工程學院，湖北荊門 448000）

小麥（Triticum aestivum L.）是世界上主要的糧食作物之一，也是我國第二大口糧作物，小麥生產(chǎn)對保障國家糧食安全、居民生活和國民經(jīng)濟發(fā)展起著重要作用[1]。小麥生長發(fā)育過程中會受到各種生物和非生物脅迫，其中由真菌引起的小麥葉枯病在世界范圍內(nèi)分布廣泛，嚴重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)[2-3]。小麥葉枯病通常是指由真菌侵染引起的小麥葉斑或葉枯性病害的一類總稱，該病主要為害小麥葉片和葉鞘，有時也為害莖稈及穗部[4]。目前，在全球范圍內(nèi)已鑒定到20 多種小麥葉枯病病原菌，其中對小麥產(chǎn)量和品質(zhì)危害最嚴重的葉枯病包括：小麥殼針孢葉枯病（Septoria tritici blotch，STB）、小麥褐斑?。═an spot）、小麥穎枯殼針孢葉枯?。⊿eptoria nodorum blotch）和小麥蠕孢葉枯?。⊿pot blotch）（圖1）[3，5]。小麥葉枯病的防治主要包括化學防治、生物防治和抗病育種，其中抗病品種的選育和推廣是最經(jīng)濟有效且環(huán)保的防治措施[3，6-7]。因此，篩選小麥葉枯病抗性種質(zhì)資源，克隆抗葉枯病基因并發(fā)掘優(yōu)異等位變異，開發(fā)功能分子標記，利用分子標記輔助選擇技術聚合多個抗病基因，將最終實現(xiàn)小麥品種抗病性的廣譜性和持久性。

本文主要綜述了小麥殼針孢葉枯病的危害，抗葉枯病基因/QTL 定位、功能標記開發(fā)和抗葉枯病分子機理研究，并對今后小麥葉枯病抗性研究重點及育種思路進行了討論，以期為更有效地開展葉枯病遺傳研究和抗病分子育種提供理論參考。

1 小麥殼針孢葉枯病的危害

小麥殼針孢葉枯?。⊿eptoria tritici blotch，STB）是由真菌（子囊菌）Mycosphaerella graminicola（無性態(tài)為Zymoseptoria tritici，異名Septoria tritici）引起的一種小麥葉部病害，嚴重發(fā)生時小麥葉片黃枯，不能正常灌漿結(jié)實，千粒質(zhì)量下降[8]。小麥殼針孢葉枯病在全球范圍內(nèi)均有發(fā)生，尤其在歐洲、地中海、南美洲、美國、澳大利亞和中國等地區(qū)發(fā)病較多，引起大面積葉枯和穗腐[5，9-11]。在歐洲，小麥殼針孢葉枯病對小麥造成的經(jīng)濟損失與水稻稻瘟病對水稻造成的損失相當，每年控制該病害使用的殺菌劑費用高達4 億美元[12]。此外，隨著品種更替和近些年的氣候環(huán)境變化，發(fā)病區(qū)域也隨之有明顯變動。在我國，小麥殼針孢葉枯病在不同生態(tài)小麥種植區(qū)均有發(fā)生，主要危害區(qū)域包括西北局部冷涼陰濕春麥區(qū)和東北晚熟春麥區(qū)[13]。

小麥殼針孢葉枯病貫穿小麥的整個生育期，為全生育期病害，不僅危害葉片、葉鞘，還危害莖和穗[4，14]。小麥殼針孢屬于半活體營養(yǎng)型真菌，侵染過程分活體營養(yǎng)和死體營養(yǎng)2 個階段。小麥殼針孢的孢子在侵入寄主前不形成附著孢，直接從氣孔入侵，侵染后經(jīng)歷1～4 周的潛伏期，此期間病原菌不穿透細胞壁進入葉肉細胞間，也不形成吸器從細胞內(nèi)汲取營養(yǎng)，而只是在葉肉組織細胞間不斷生長直至細胞壞死[8]。病菌侵染后發(fā)病癥狀由下部葉片向上擴展，初期在葉片上形成不規(guī)則黃褐色斑塊，后期擴展連片形成褐色大斑；有些葉片呈現(xiàn)黃色條紋狀病斑，葉脈黃綠色，嚴重時黃色部分變?yōu)榭莅咨砻嫔泻谏☆w粒，即分生孢子器；發(fā)病嚴重時，病菌自葉鞘向莖稈擴展直至穗部穎殼，使之變得干枯，籽粒干癟[14]。

2 小麥殼針孢葉枯病質(zhì)量抗性基因定位分析

目前，正式命名的小麥抗殼針孢葉枯病的質(zhì)量抗性基因有22 個，包括Stb1-Stb19、StbSm3、StbWW和TmStb1，在小麥的7 個同源群上均有分布[15-16]。Stb3、Stb4、Stb5 和TmStb1 位于第7 同源群，在第1 和第3 同源群各分布有3 個基因，其中位于1B染色體短臂上的基因有3 個，分別為Stb2、Stb11 和StbWW[15-16]。根據(jù)小麥對殼針孢葉枯病的抗病表現(xiàn)時期，可將抗病基因分為全生育期抗性、苗期抗性和成株期抗性。其中，苗期抗性基因占1/2 以上，全生育期抗性基因有6 個，成株期抗性基因僅有4 個（表1）。這些抗病基因不僅來源于普通小麥，也有一些來自一粒小麥、硬粒小麥、人工合成六倍體小麥及小麥易位系材料。

表1 正式命名的小麥抗殼針孢葉枯病基因

3 小麥殼針孢葉枯病抗性數(shù)量性狀位點定位分析

3.1 基于雙親群體的小麥抗殼針孢葉枯病數(shù)量性狀位點定位分析

在田間試驗中，小麥對殼針孢葉枯病的抗性水平呈連續(xù)型分布，可能由幾個或多個基因控制，表現(xiàn)加性效應或顯性效應，在普通小麥和硬粒小麥中具有較高的遺傳力[35-37]。在苗期和成株期鑒定到的小麥抗殼針孢葉枯病數(shù)量性狀位點（Quantitative Trait Locus，QTL）遍布于小麥的各條染色體上。目前，已從19 個雙親遺傳群體中鑒定到177 個小麥抗殼針孢葉枯病QTL 位點[15]，GOUDEMAND 等[38]對7 個小麥雙單倍體（Double Haploid，DH）群體的殼針孢葉枯病抗性進行一致性QTL（meta quantitative loci，meta-QTL）分析，最終將定位到的115 個QTL，整合為27 個meta-QTL。簡言之，目前已報道的89 個抗小麥殼針孢葉枯病區(qū)間包含62 個QTL 和27 個meta-QTL，其中，27 個為苗期抗性位點，48 個為成株期抗性位點，其余14 個位點在全生育期均表現(xiàn)抗性[15]。這些抗病QTL 包含參與控制葉片壞死、分生孢子器生長和病情發(fā)展曲線下面積（Area under disease-progress curve，AUDPC）的位點，另外，還鑒定到2 個控制小麥殼針孢葉枯病潛伏期的微效QTL[39]。

除5D 染色體外，小麥其他染色體上都至少攜帶1 個抗殼針孢葉枯病QTL 或meta-QTL[15]。19 個QTL 或meta-QTL 與控制株高、抽穗期的基因或QTL 共定位，其中，定位到的6 個QTL 位點與Rht8、Rht-B1、Rht-D1、Ppd-A1 和Ppd-D1 距離較近[15，38-39]。另外，發(fā)現(xiàn)在3BL、6BS 和7DL 染色體上富集大量抗葉枯病QTL，包括22 個QTL 和6 個meta-QTL，這可能與該區(qū)間內(nèi)共定位到的一些質(zhì)量抗性基因有關[15]。此外，通過不同群體定位到的多個QTL 在質(zhì)量抗性基因Stb6、Stb5/Stb4 和Stb11/Stb2/StbWW 附近，而定位在Stb1、Stb9、Stb7 和Stb12、Stb13、Stb14 和Stb18 附近的QTL 較少[15，39-42]。除了8 個QTL 通過在人工合成六倍體小麥、中國春染色體代換系和一個美國小麥品系中鑒定到，其他QTL 絕大部分來自歐洲小麥種質(zhì)[39-42]。

3.2 基于自然群體的小麥殼針孢葉枯病抗性的全基因組關聯(lián)分析

通過全基因組關聯(lián)分析（Genome-Wide Association Studies，GWAS），已在栽培小麥品種和地方品種中鑒定到與小麥殼針孢葉枯病抗性相關的基因位點，包括已報道的STB 抗性位點和一些新位點。前人對327 份歐洲小麥品種開展連續(xù)2 a 的噴霧接種調(diào)查研究，關聯(lián)分析共檢測到68 個SSR 標記與小麥殼針孢葉枯病成株期抗性顯著相關，其中，9 個抗病位點與表型鑒定時的所有抗病指標都顯著相關，關聯(lián)分析還鑒定到Stb1、Stb4、Stb6 和Stb8，說明這些基因已在歐洲品種廣泛應用[43]。此外，一些與STB 抗性相關的性狀也定位在已知的小麥抗殼針孢葉枯病基因附近。

通過對1 055 份優(yōu)異雜交種及其87 個親本在2 個環(huán)境下自然發(fā)病或進行混合小種噴霧接種，關聯(lián)分析鑒定到8 個單核苷酸多態(tài)性（Single nucletide polymorphism，SNP）標記與小麥殼針孢葉枯病抗性顯著相關，主要分布在1B、2B、5B 和6A 染色體上[44]。其中，5B 上的抗病位點可能為Stb1，并且在Arina Forno 和Steele-ND×ND 735 群體中也能被檢測到[42，45]。此外，對528 份來自全球的春小麥地方品種在溫室進行成株期抗殼針孢葉枯病鑒定，關聯(lián)分析定位到7 個抗病相關SNP，這些SNP 分布在3B、6B 和7B 染色體上，可能為新的抗殼針孢葉枯病基因[46]。近期，YATES 等[47]開發(fā)了自動圖像分析算法，量化小麥殼針孢葉枯病的抗病表型，在田間對335 個冬小麥品種進行了高通量自動化表型分析，將540 多萬個自動生成的表型性狀與13 648 個SNP 標記進行全基因組關聯(lián)分析，鑒定出26 個與小麥殼針孢葉枯病抗性相關的染色體區(qū)間，解釋1.9%～10.6%的表型變異，其中16 個染色體區(qū)間與已知的STB 抗性區(qū)間相吻合。

4 小麥抗葉枯病基因的克隆和作用機理探究

小麥葉枯病抗性遺傳分析，雖然定位到了很多質(zhì)量抗性基因和QTL，但是被克隆的卻很少。通過圖位克隆策略，目前僅報道克隆了2 個與小麥殼針孢葉枯病相關的主效抗病基因，即Stb6 和Stb16q。

4.1 Stb6 基因

Stb6 是第1 個被克隆的小麥抗葉枯病基因，對小麥殼針孢菌株IPO323 表現(xiàn)特異性抗性。早在2002 年，研究者利用抗病品種Flame 和Hereward，分別與感病品種Longbow組配F1，證明該基因是一個半顯性基因，通過后代F2和F3群體將該基因定位在3AS 染色體上[22]。直到2018 年，英國洛桑研究所和法國國家農(nóng)業(yè)研究院聯(lián)合研究，對Stb6 基因進行了精細定位，并通過候選基因表達分析、序列多態(tài)性分析、病毒誘導的基因沉默（Virus induced gene silencing，VIGS）技術、EMS 突變體分析和轉(zhuǎn)基因驗證，最終確定TaWAKL4 即為Stb6 基因[48]。TaWAKL4/Stb6 基因包含4 個外顯子和3 個內(nèi)含子，編碼一個647 個氨基酸組成的抗性蛋白，其中胞外是半乳糖醛酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（GUB_WAK），胞內(nèi)是非精氨酸-天冬氨酸蛋白激酶以及一個復雜拓撲刀豆蛋白A 型結(jié)構(gòu)域。簡言之，Stb6 基因只對一部分小麥殼針孢菌有效，這些菌株會分泌一種特定蛋白質(zhì)，該基因編碼的蛋白質(zhì)能識別它，啟動小麥的天然防御體系。Stb6 基因的克隆為小麥葉枯病抗性基因的研究奠定了重要基礎，同時也印證了先天免疫反應中的模式識別受體（Pattern recognition receptor，PRR）類蛋白也能控制質(zhì)量抗性，符合“基因?qū)蚣僬f”[48]。

4.2 Stb16q 基因

Stb16q 基因來自于人工合成六倍體小麥M3，在苗期和成株期都表現(xiàn)出穩(wěn)定的廣譜抗性，利用感病品種Kulm 和M3 衍生的RIL 群體，將Stb16q 基因定位在3DL 染色體上，QTL 分析結(jié)果表明，該位點可解釋苗期抗性表型變異41%～71%，成株期抗性表型變異28%～31%[31]。近日，法國國家農(nóng)業(yè)食品與環(huán)境研究所（INRAE）利用另外一個攜帶Stb16q基因的人工合成六倍體小麥TA4152-19，采用圖位克隆策略克隆了Stb16q 基因[49]，該基因編碼一個富含半胱氨酸的類受體激酶（CRK），包含7 個外顯子和6 個內(nèi)含子，主要在小麥葉片中表達，并且隨著發(fā)育階段表達量增強。Stb16q 編碼的蛋白包含2 個DUF26 結(jié)構(gòu)域、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個細胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。在煙草葉片中瞬時表達發(fā)現(xiàn)，Stb16q蛋白定位于質(zhì)膜上。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Stb16q可能在早期階段阻止小麥葉枯病菌的侵染[49]。已有研究表明，含有DUF26 結(jié)構(gòu)域的Gnk2 具有甘露糖結(jié)合活性[50]，涉及該活性的所有氨基酸均在STB16 的C 端DUF26 結(jié)構(gòu)域中高度保守，表明STB16 可能通過識別質(zhì)外體植物或真菌衍生的甘露糖或衍生物，進而觸發(fā)Stb16q 介導廣譜防御反應，在病原體穿過氣孔前阻止病程發(fā)展[49]。

5 小麥抗殼針孢葉枯病基因的育種應用

由于小麥葉枯病的遺傳研究較為緩慢，目前抗病基因在育種中的應用還相對較少。在普通小麥中，抗葉枯病的種質(zhì)資源較為匱乏。王振等[51]對東北春麥區(qū)主要推廣的54 份小麥品種進行抗葉枯病評價，結(jié)果表明，僅1 個品種墾大6 號抗性較好。由我國江蘇里下河農(nóng)業(yè)科學院育成的揚麥6 號，在印度、尼泊爾和孟加拉等國表現(xiàn)穩(wěn)定的葉枯病抗性[52]。BROWN 等[53]研究發(fā)現(xiàn)，中國春在田間對白葉枯病菌IPO323 表現(xiàn)特異性抗性。除此之外，大多數(shù)高抗葉枯病材料為簇毛麥、偃麥草、大賴草等小麥近緣種屬[54]。來自國際玉米小麥改良中心（Centro Internacional de Mejoramientode Maizy Trigo，CIMMYT）的品種KK 和來自葡萄牙的TE 9111 對多個小麥葉枯病菌都表現(xiàn)持久抗性，多年來作為抗葉枯病種質(zhì)資源在抗病育種中應用，有研究表明，這些品種可能含有多個針對不同菌株的抗性基因或含有一個廣譜抗性基因[55]。通過聚合多個Stb 基因有望提高抗性水平，這也是在抗病育種中經(jīng)常使用的策略。

第1 個克隆的小麥葉枯病基因Stb6 引起局部過敏性反應，阻礙病程的進一步發(fā)展。在98 份材料中可將Stb6 劃分為8 種單倍型，其中僅有1 種抗病單倍型占71 份，而且該抗病單倍型在野生四倍體和二倍體小麥中也能鑒定到，表明Stb6 可能在小麥馴化早期已經(jīng)滲入，有望在育種中得到更廣泛的應用[22]。第2 個克隆的Stb16q 對已鑒定的所有葉枯病菌株均表現(xiàn)較強的抗病性，重要的是，利用Stb16q 基因的功能SNP 標記（cfn80044 和cfn80045）檢測來自61 個國家的805 份小麥品種，發(fā)現(xiàn)核心種質(zhì)資源不含該抗病等位基因，僅在來自法國、印度和西班牙的5 個品種和來自CIMMYT 的1 個高代品系中檢測到Stb16q 的優(yōu)異抗病等位基因[49]。因此，未來可以通過分子標記輔助選擇回交育種，將Stb16q 基因引入到我國主栽小麥品種中，以實現(xiàn)小麥對葉枯病的廣譜抗性。此外，對于數(shù)量性狀QTL，可以通過回交等方法聚合多個QTL，增強單個微效基因的效應，從而使抗病性更為持久。

6 小麥抗殼針孢葉枯病研究思路探討

小麥是我國主要糧食作物之一，小麥葉枯病近年來從原來的點片發(fā)生發(fā)展到較大地區(qū)范圍，且危害逐年加重，在部分地區(qū)成為常年發(fā)生的重要病害。盡管化學藥劑和生物防治能夠在一定程度上控制小麥葉枯病，但會增加人力、物力投入，造成生態(tài)環(huán)境污染，而培育和推廣抗病品種是最經(jīng)濟、有效和環(huán)保的防治措施。因此，篩選抗病種質(zhì)資源，對小麥種質(zhì)資源中的抗葉枯病基因進行發(fā)掘和育種應用，是實現(xiàn)我國小麥品種葉枯病抗性可持續(xù)性的基礎。與其他小麥病害如銹病、白粉病相比，目前國內(nèi)對小麥葉枯病抗性的遺傳研究相對落后，相關基因克隆的研究還比較少，積累的抗病材料也相當缺乏。今后應加強幾方面的工作。

6.1 加強小麥殼針孢葉枯病抗性種質(zhì)資源的搜集、鑒定和利用

小麥抗葉枯病種質(zhì)資源的搜集和鑒定是抗病育種的基礎工作，前人已在栽培小麥品種、地方小麥品種、野生小麥和六倍體人工合成小麥中篩選到了高抗葉枯病的材料[56]。同時在普通小麥的祖先種（如一粒小麥、野生二粒小麥、硬粒小麥）和近緣種屬（如簇毛麥、燕麥草、大賴草等）中也篩選到一些高抗葉枯病的材料[15]。此外，中間偃麥草與小麥遠緣雜交創(chuàng)制的代換系、附加系等材料可以增強小麥的抗病性[57]，例如，利用小麥-中間偃麥草部分雙二倍體TAI7045 與普通小麥晉太170 進行亞遠緣雜交選育的小偃麥新種質(zhì)CH366 對3 個條銹菌流行小種均表現(xiàn)高抗[58]。因此，如何將這些抗性種質(zhì)材料應用到小麥育種工作中是今后應該注意和加強的方面。此外，對審定推廣品種的葉枯病抗性全面鑒定工作也需要加強，因為一旦鑒定出葉枯病抗性較好的品種，可以直接作為育種親本材料用于小麥葉枯病抗性改良。

6.2 加強小麥抗殼針孢葉枯病基因的克隆和優(yōu)異等位基因發(fā)掘

目前，已經(jīng)鑒定到22 個主效Stb 抗性基因，同時通過雙親群體和自然群體定位到許多與小麥葉枯病相關的QTL，但是目前為止僅分離克隆了2 個主要基因Stb6 和Stb16q。因此，在加強種質(zhì)資源葉枯病抗性評價的基礎上，也應當積極開展葉枯病抗性基因的發(fā)掘與克隆。目前，小麥基因組學研究已取得重大進展，基因編輯技術在小麥研究中也得到成功運用，這些新的研究成果和技術手段將為小麥葉枯病抗性基因的克隆和優(yōu)異等位基因的發(fā)掘提供便利條件。而小麥抗葉枯病基因的克隆，也為了解小麥抗葉枯病基因遺傳變異機制、解析其抗性遺傳機理，為小麥抗葉枯病分子設計育種、轉(zhuǎn)基因育種和精準基因編輯育種提供目標基因和靶點，為小麥種質(zhì)資源的收集、保護、研究和利用提供重要理論依據(jù)。

6.3 加強分子標記輔助選擇及抗病分子設計育種工作

小麥葉枯病抗性是一個由多基因控制的復雜數(shù)量性狀，單純的表型篩選易受環(huán)境條件影響，選擇效率較低。加強育種材料，選擇抗性過硬的新品種，是小麥育種方向創(chuàng)新實踐優(yōu)化的主要策略[59]。小麥葉枯病抗性基因/QTL 的發(fā)掘和相關功能標記/連鎖標記的開發(fā)，對開展葉枯病抗性分子標記輔助育種和提高育種效率奠定了基礎。為了快速提高小麥品種對葉枯病的抗性，同時又保持改良后較好的農(nóng)藝性狀和適應性，挑選適應性較好、產(chǎn)量較高、綜合農(nóng)藝性狀良好的主推品種作為育種改良的輪回親本品種，擴大回交育種群體，回交育種結(jié)合分子標記輔助選擇是抗葉枯病育種最有效的方法之一。但是國內(nèi)利用分子標記輔助選擇育成抗葉枯病并大面積推廣的品種鮮有報道，聚合不同抗葉枯病基因的分子聚合育種的實例更少。因此，今后應加強分子標記輔助及標記聚合分子育種工作。