基于腫瘤標(biāo)志物OATP1B3的近紅外熒光染色用于鑒別口腔鱗癌

崔娟娟 馬曉楠

摘要：目前口腔癌的診斷方法均存在一定的局限性，臨床上仍需一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的方法來(lái)診斷口腔部位病變細(xì)胞，而近紅外熒光染色有可能填補(bǔ)這一空白。通過(guò)分析數(shù)據(jù)庫(kù)中腫瘤特異性親和的近紅外熒光染料IR-783的轉(zhuǎn)運(yùn)體OATP1B3在癌癥組織中表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)體的高表達(dá)與口腔鱗癌患者生存期縮短相關(guān)。另外，體外試驗(yàn)中IR-783染色容易區(qū)分出口腔鱗癌細(xì)胞與非癌細(xì)胞，提示OATP1B3有可能作為口腔癌診斷的標(biāo)志物，而IR-783染色可以成為潛在的口腔癌診斷方法。

關(guān)鍵詞：口腔癌;近紅外熒光;OATP1B3

頭頸部腫瘤包括頸部腫瘤、耳鼻喉科腫瘤以及口腔頜面部腫瘤三大部分?？谇活M面部惡性腫瘤發(fā)病率僅次于鼻咽癌，居頭頸部惡性腫瘤的第2位。每年新發(fā)口腔癌患者數(shù)約占新發(fā)頭頸部腫瘤的15%?？谇话┦且环N高度致死的癌癥，致死率接近50%[1]。目前，口腔癌的診斷方法主要有兩種，即影像學(xué)檢查和細(xì)胞學(xué)/組織活檢，但臨床上仍需要一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的方法來(lái)診斷口腔部位病變細(xì)胞。所以考慮應(yīng)用一些對(duì)癌細(xì)胞有特異親和力的熒光染料，借助顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行診斷，形成一種全新、安全、高效的高分辨率實(shí)時(shí)影像學(xué)診斷系統(tǒng)。小分子近紅外熒光染料IR-783是一種水溶性陽(yáng)離子七甲川花菁染料，以前被用來(lái)測(cè)量血流量和心輸出量，如今，人們注意到了它的一種重要特性：IR-783很容易穿透生物膜結(jié)構(gòu)，可以特異性地富集于癌細(xì)胞的線粒體中。IR-783在癌細(xì)胞線粒體中的富集依賴于有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體OATP1B3（由SLCO1B3基因編碼）。OATP1B3在許多種類的腫瘤細(xì)胞中都有高表達(dá)，但具體表達(dá)水平和表達(dá)機(jī)制均未知。本研究將通過(guò)分析數(shù)據(jù)庫(kù)中OATP1B3在癌癥組織中表達(dá)特征，分析OATP1B3是否適合作為口腔癌的診斷標(biāo)志物，并考察IR-783是否富集于腫瘤細(xì)胞中，從而使IR783染色成為潛在的口腔癌診斷方法?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1材料與方法

基因表達(dá)資料交互分析：GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/detail.php）在線程序被用于分析和比較TCGA及GTEx數(shù)據(jù)，得到SLCO1B3在不同組織的分布情況。線箱圖用于比較多種腫瘤與對(duì)應(yīng)的正常組織中SLCO1B3表達(dá)差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，|log2FC|臨界值設(shè)定為1，P值臨界值設(shè)定為0.01，其余為默認(rèn)值。

生存分析：GEPIA的生存分析（包括了總體生存期與無(wú)病生存期）模塊中用時(shí)序檢驗(yàn)（Log-rank test）作為假設(shè)檢驗(yàn)（hypothesis test）。SLCO1B3表達(dá)的中位數(shù)作為臨界值。

近紅外熒光染料染色及熒光觀察：細(xì)胞數(shù)相同的人口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27與人胚胎腎細(xì)胞HEK293共培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中（含有10% FBS，1%青霉素-鏈霉素雙抗）。細(xì)胞鋪板8h后，在培養(yǎng)基中加入10 nmol/L IR-783，37℃避光孵育10 min，棄去培養(yǎng)基后用冷的PBS洗3次，加入新鮮培養(yǎng)基后40倍物鏡相差及熒光顯微鏡觀察并拍照（Olympus IX71，熒光激發(fā)波長(zhǎng)630 nm，發(fā)射波長(zhǎng)780 nm）。

2結(jié)果

2.1 OATP1B3在腫瘤和正常組織中的表達(dá)差異

基因表達(dá)資料交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis， GEPIA）被用于比較TCGA及GTEx數(shù)據(jù)，得出OATP1B3（SLCO1B3）在正常組織或器官和對(duì)應(yīng)的腫瘤組織中的表達(dá)差異及差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常人體內(nèi)，OATP1B3僅在肝臟和膽囊高表達(dá)，而在其他組織中幾乎觀察不到表達(dá)。但在小腸以外的其他消化系統(tǒng)腫瘤中存在表達(dá)水平升高的情況（圖1A、B）。相反，與正常肝臟和膽囊相比，在肝癌和膽囊癌組織中OATP1B3表達(dá)量卻降低（圖1B）。對(duì)表達(dá)差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，只有結(jié)腸腺癌、食道癌、頭頸癌、肝癌和膽囊癌中SLCO1B3的表達(dá)與正常組織對(duì)照相比有顯著性差異（P<0.01，圖1C、D）。提示SLCO1B3的表達(dá)可能與這五種癌癥發(fā)生與進(jìn)展相關(guān)。

2.2 SLCO1B3表達(dá)與癌癥病人生存期相關(guān)性分析

為了明確SLCO1B3的表達(dá)對(duì)這幾種癌癥病人預(yù)后的影響，GEPIA被用于分析基因表達(dá)與患者生存期之間的相關(guān)性。泛癌分析結(jié)果顯示SLCO1B3的高表達(dá)患者明顯有著更短的總體生存期與無(wú)病生存期（圖2A、B）。而結(jié)腸腺癌、食道癌、頭頸鱗癌患者SLCO1B3的高表達(dá)與生存期縮短顯著相關(guān)（圖2C），尤其是頭頸鱗癌患者SLCO1B3的高表達(dá)意味著更差的預(yù)后（圖2D）。另外，肝癌和膽囊癌患者SLCO1B3的表達(dá)對(duì)總體生存期與無(wú)病生存期均無(wú)顯著性影響（圖2E、F）。以上結(jié)果提示SLCO1B3的表達(dá)對(duì)頭頸鱗癌患者預(yù)后影響較大。

2.3 OATP1B3介導(dǎo)的IR-783在口腔癌細(xì)胞中富集

作為頭頸部腫瘤重要的一類，口腔癌鱗細(xì)胞是否可以通過(guò)表達(dá)OATP1B3而富集近紅外熒光染料并無(wú)報(bào)道。為了觀察IR-783是否可以特異性染色口腔癌細(xì)胞，人口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27與人胚胎腎細(xì)胞HEK293共培養(yǎng)，經(jīng)IR-783染色后進(jìn)行白光及近紅外熒光觀察。結(jié)果顯示IR-783在CAL-27細(xì)胞中特異性富集，而在HEK293細(xì)胞中幾乎沒(méi)有富集（圖3）。而CAL-27細(xì)胞紅外熒光信號(hào)很強(qiáng)烈（圖3B），293細(xì)胞幾乎不被紅外染料著色，很難將其與背景分開，兩種細(xì)胞染色對(duì)比度達(dá)到100：1。使用IR783，能夠清楚的區(qū)分兩種細(xì)胞。

3討論

根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，IR-783可以在多種腫瘤細(xì)胞系及裸鼠的異體移植腫瘤中富集，顯示出其作為癌癥診斷試劑的價(jià)值，但哪些腫瘤可以富集IR-783并不清晰，限制了其應(yīng)用。本研究從IR-783的轉(zhuǎn)運(yùn)體OATP1B3的表達(dá)出發(fā)，明確了SLCO1B3基因在腫瘤與配對(duì)正常組織中表達(dá)的差異，及SLCO1B3高表達(dá)與患者生存期縮短的的相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上證明了口腔鱗癌細(xì)胞易于富集IR-783，而這種近紅外熒光染料有成為口腔癌診斷試劑的潛力。

參考文獻(xiàn)

[1]趙友，周燁，崔笠，等.基于代謝組學(xué)的前列腺癌腫瘤標(biāo)志物研究進(jìn)展[J].腫瘤學(xué)雜志，2020，26（2）：78-82.